Comparative analysis of the conservation of nucleoprotein immunogenic T-cell epitopes of master donor viruses for live and inactivated influenza vaccines

Full Text

Введение

Грипп является одной из наиболее распространенных в мире респираторных инфекций, вызываемой высококонтагиозным вирусным патогеном (чаще всего вирусами гриппа подтипа А) и часто характеризующейся осложненным течением. По данным ВОЗ, ежегодные эпидемии гриппа вызывают от 3 до 5 млн случаев тяжелой формы заболевания, смертность от которых достигает 22% [4].

Одним из наиболее эффективных средств борьбы с гриппозной инфекцией является вакцинопрофилактика, чаще всего осуществляемая с использованием таких инструментов, как сплит-, рекомбинантные и инактивированные (ИГВ) вакцины, в том числе на основе наночас тиц, а также живая гриппозная вакцина (ЖГВ). Показано, что в отличие от других способов вакцинации, иммунизация ЖГВ индуцирует как местный, так и Т-клеточный гетеросубтипический иммунный ответ к внутреннему белку вириона — нуклеопротеину (NP), наиболее богатому иммуногенными эпитопами для CD8⁺ Т-лимфоцитов компоненту вируса гриппа [3].

Штаммы, составляющие основу сезонных ЖГВ и ИГВ, являются продуктами генетической реассортации циркулирующих вирусных вариантов и вакцинных доноров [9]. Как правило, их геном представлен сегментами, кодирующими поверхностные белки (гемагглютинин и нейраминидазу) актуальных эпидемических вирусов гриппа, а также генами неструктурных белков и внутренних компонентов вириона (в частности, NP антигена), наследуемыми от вакцинного донора. Наиболее популярными донорными штаммами для создания гриппозных вакцин во всем мире являются вирусы 1933–1960 гг. выделения, а именно А/WSN/1933 (H1N1) (используемый для получения современных вакцин на основе наночастиц), A/PR/8/34 (H1N1) (донор высокой репродуктивности для создания ИГВ), А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), лицензированный для производства ЖГВ [7], а также донор аттенуации для американской ЖГВ A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), аминокислотный состав NP белка которых мог значительно отдалиться от такового у циркулирующих вирусов за более чем 60 лет. В случае если возникающие в NP замены затрагивают иммуногенные эпитопы, которые в комплексе с MHC I служат активаторами цитотоксических CD8⁺ Т-клеток (ЦТЛ-эпитопы), различия в составе «донорного» и «эпидемического» NP антигенов могут снижать эффективность стимуляции Т-клеточного иммунитета с помощью вакцин, содержащих антигенно устаревший белок нуклеокапсида.

Целью данного исследования стал анализ консервации in silico ЦТЛ-иммуноэпитопов NP антигена вирусов гриппа А, чаще всего используемых в качестве доноров для разработки и производства кросс-протективных вакцин (А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), A/PR/8/34 (H1N1) и А/WSN/1933 (H1N1)) в составе NP вирусов гриппа А (H1N1 и H3N2), циркулировавших в человеческой популяции с 2009 по 2023 год.

Материалы и методы

Для проведения иммуноэпитопного анализа из базы данных NCBI Influenza Virus Sequence Database [11] были отобраны аминокислотные последовательности NP антигена вакцинных доноров (А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), A/PR/8/34 (H1N1) и А/WSN/1933 (H1N1), а также уникальные последовательности NP 1614 современных вирусов гриппа А подтипа H1N1 и 1767 — подтипа H3N2, циркулировавших среди людей в 2009–2023 гг. Из рассмотрения были исключены лабораторные штаммы, а также полностью гомологичные последовательности, выявленные при выравнивании алгоритмом ClustalO [8]. Поиск ЦТЛ-эпитопов в последовательностях NP вакцинных доноров проводили в базе данных Immune Epitope Database (IEDB, www.iedb.org) с использованием алгоритма предсказания NetCTL, поэтапно для всех HLA-супертипов [5]. Параметры вклада С-концевого протеолиза, эффективности TAP-опосредованного транспорта пептидов в просвет эндоплазматического ретикулума (с участием транспортера, ассоциированного с процессингом антигена) и порога отбора эпитопов составляли 0,15, 0,05 и 0,75 соответственно. Затем последовательности NP вакцинных доноров были проанализированы на наличие протеолитических сайтов с помощью инструмента NetChop [6] и метода C-terminal proteolysis assay 3.0 при пороговом значении 0,5. Картирование ЦТЛ-эпитопов на последовательности NP вирусов гриппа А с учетом локализации сайтов протеолиза проводили с помощью программы JalView 2.8.1. Эпитопы, имею щие не более одного сайта протеолиза, были включены в дальнейший анализ. Предсказание иммуногенности отобранных ЦТЛ-эпитопов проводили в IEDB с использованием алгоритма предсказания Immunogenicity predictor tool [2]. Для дальнейшего исследования отбирали эпитопы с баллом иммуногенности более 0. Анализ консервации эпитопов проводили в IEDB с использованием соответствующего алгоритма Epitope Conservancy Assay [1] в режиме оценки линейных эпитопов с порогом идентичности последовательностей, равным 100. Степень консервативности эпитопов выражали как процент вирусных штаммов с полностью гомологичными последовательностями среди всех штаммов вируса гриппа А, включенных в анализ.

Результаты и обсуждение

Данные, представленные в табл. 1, показывают, что только 2 из 12 отобранных ЦТЛ-эпитопов (16,7%) для NP вакцинного донора А/WSN/1933 (H1N1) оказались высококонсервативными. Примечательно, что половина отобранных иммуногенных эпитопов была выявлена только у 0,1–2,0% циркулирующих в настоящее время вирусов гриппа А.

 

Таблица 1. Консервация экспериментально определенных и предсказанных ЦТЛ-эпитопов NP вакцинного донора А/WSN/1933 (H1N1) у вирусов гриппа А, циркулировавших в человеческой популяции с 2009 по 2023 год

Table 1. Conservation of experimentally defined and predicted CTL-epitopes of the NP of vaccine donor A/WSN/1933 (H1N1) in influenza A viruses circulating in the human population from 2009 to 2023

Эпитопы NP вируса гриппа А/WSN/1933 (H1N1) NP epitopes of influenza virus А/WSN/1933 (H1N1)				Консервация ЦТЛ- эпитопов NP  в штаммах вируса гриппа А (2009–2023), % Conservancy of NP CTL-epitopes in  influenza A strains (2009–2023), %	Предсказание ЦТЛ- иммуногенности  эпитопа, баллы Prediction of epitope CTL-immunogenicity,  score
Номер эпитопа  в IEDB Epitope IEDB ID	Позиция на транскрипте NP Position in NP  transcript	Связывающий эпитоп  HLA-супертип Epitope-binding  HLA supertype	Аминокислотная последовательность Amino acid sequence
p	174–182	B27	RRSGAAGAA	98,13	0,11
p	317–325	A3	RPNENPAHK	97,86	0,13
41691	32–40	A1, A26	MIDGIGRFY	52,31	0,32
11696	114–122	B44	EEIRRIWRQ	53,30	0,49
p	113–121	A3	KEEIRRIWR	53,27	0,51
p	30–38	A3	GKMIDGIGR	50,99	0,26
p	211–219	A26	NGRRTRIAY	1,97	0,29
p	213–221	B27	RRTRIAYER	1,97	0,29
p	214–222	B7	RTRIAYERM	1,97	0,30
19421	17–25	B44	GERQNATEI	1,53	0,02
p	125–133	B39	NGDDATAGL	1,40	0,16
p	245–253	B27, B39	SRNPGNAEF	0,10	0,11

Примечание. p — эпитоп предсказан.

Note. p — epitope is predicted.

 

Таблица 2. Консервация экспериментально определенных и предсказанных ЦТЛ-эпитопов NP вакцинного донора A/PR/8/34 (H1N1) у вирусов гриппа А, циркулировавших в человеческой популяции с 2009 по 2023 год

Table 2. Conservation of experimentally defined and predicted CTL-epitopes of the NP of vaccine donor A/PR/8/34 (H1N1) in influenza A viruses circulating in the human population from 2009 to 2023

Эпитопы NP вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) NP epitopes of influenza virus A/PR/8/34 (H1N1)				Консервация ЦТЛ- эпитопов NP  в штаммах вируса гриппа А (2009–2023), % Conservancy of NP CTL-epitopes in  influenza A strains (2009–2023), %	Предсказание ЦТЛ- Иммуногенности  эпитопа, баллы Prediction of epitope  CTL-immunogenicity, score
Номер эпитопа  в IEDB Epitope IEDB ID	Позиция на  транскрипте NP Position in NP  transcript	Связывающий  эпитоп HLA-супертип Epitope-binding  HLA supertype	Аминокислотная  последовательность Amino acid sequence
p	333–341	A24, B39	CHSAAFEDL	98,13	0,23
p	174–182	B27	RRSGAAGAA	98,13	0,11
p	317–325	A3	RPNENPAHK	97,86	0,13
11696	114–122	B44	EEIRRIWRQ	53,30	0,49
63408	23–31	A3, B44	TEIRASVGK	51,63	0,03
164131	32–40	A3, B62	MIGGIGRFY	44,72	0,32
19421	17–25	B44	GERQNATEI	1,53	0,02
p	125–133	B39	NGDDATAGL	1,40	0,16
p	211–219	A26, B62	NGRKTRIAY	1,36	0,02
p	213–221	B27	RKTRIAYER	1,29	0,29
p	31–39	A2, A24	KMIGGIGRF	0,44	0,29
p	30–38	A3	GKMIGGIGR	0,44	0,27

Примечание. p — эпитоп предсказан.

Note. p — epitope is predicted.

 

Аналогичные результаты были получены для A/PR/8/34 (H1N1), где только 3 из 13 предсказанных NP-эпитопов (23,1%) сохранились практически у всех циркулирующих в настоящее время вирусов (табл. 2).

Как и ожидалось, большая доля ЦТЛ-эпи топов NP донора аттенуации А/Ленин град/ 134/17/57 (H2N2), сохраняется у современных вирусов H1N1 и H3N2 (5 из 12, 41,7%), поскольку этот вирус был выделен на два десятилетия позже, чем первые два рассмотренных вакцинных донора (табл. 3).

 

Таблица 3. Консервация экспериментально определенных и предсказанных ЦТЛ-эпитопов NP донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) у вирусов гриппа А, циркулировавших в человеческой популяции с 2009 по 2023 год

Table 3. Conservation of experimentally defined and predicted CTL-epitopes of the NP of attenuation donor А/Leningrad/134/17/57 (H2N2) in influenza A viruses circulating in the human population from 2009 to 2023

Эпитопы NP вируса гриппа A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) NP epitopes of influenza virus A/Ленинград/134/17/57 (H2N2)				Консервация ЦТЛ- эпитопов NP в штаммах вируса гриппа А (2009–2023), % Conservancy of NP CTL-epitopes  in influenza A strains (2009–2023), %	Предсказание ЦТЛ- иммуногенности  эпитопа, баллы Prediction of epitope  CTL-immunogenicity,  score
Номер эпитопа в IEDB Epitope IEDB ID	Позиция на  транскрипте NP Position in NP  transcript	Связывающий эпитоп HLA- супертип Epitope-binding HLA supertype	Аминокислотная последовательность Amino acid sequence
167950	198–206	A24, B27	KRGINDRNF	99,01	0,20
53890	199–207	B58	RGINDRNFW	99,01	0,17
p	174–182	B27	RRSGAAGAA	98,13	0,11
p	245–253	B27, B39	SRNPGNAEI	96,43	0,11
p	250–258	A1, A3	NAEIEDLIF	96,36	0,35
p	114–122	B44	EEIRRIWRQ	53,30	0,49
п p	276–284	B7	LPACVYGPA	2,11	0,02
19421	17–25	B44	GERQNATEI	1,53	0,02
p	125–133	B39	NGDDATAGL	1,40	0,16
p	211–219	A26, B62	NGRKTRIAY	1,36	0,02
p	333–341	A24	CNSAAFEDL	1,33	0,23
p	213–221	B27	RKTRIAYER	1,29	0,29

Примечание. p — эпитоп предсказан.

Note. p — epitope is predicted.

 

Сходные данные были получены при анализе консервативности ЦТЛ-эпитопов NP антигена донора аттенуации А/Ann Arbor/6/60 (H2N2), что ожидаемо ввиду практически совпадающего времени выделения и подтипа данного вируса с таковым у А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 4).

 

Таблица 4. Консервация экспериментально определенных и предсказанных ЦТЛ-эпитопов NP донора аттенуации А/Ann Arbor/6/60 (H2N2) у вирусов гриппа А, циркулировавших в человеческой популяции с 2009 по 2023 год

Table 4. Conservation of experimentally defined and predicted CTL-epitopes of the NP of attenuation donor А/Ann Arbor/6/60 (H2N2) in influenza A viruses circulating in the human population from 2009 to 2023

Эпитопы NP вируса гриппа A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) NP epitopes of influenza virus A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)				Консервация ЦТЛ- эпитопов NP в  штаммах вируса  гриппа А (2009–2023), % Conservancy of NP CTL-epitopes in influenza A strains (2009–2023), %	Предсказание ЦТЛ- иммуногенности эпитопа, баллы Prediction of epitope  CTL-immunogenicity, score
Номер эпитопа в IEDB Epitope IEDB ID	Позиция на транскрипте NP Position in NP transcript	Связывающий эпитоп  HLA-супертип Epitope-binding HLA supertype	Аминокислотная  последовательность Amino acid sequence
p	174–182	B27	RRSGAAGAA	98,13	0,11
p	317–325	A3	RPNENPAHK	97,86	0,13
p	245–253	B27	SRNPGNAEI	96,43	0,11
984	251–259	B44	AEIEDLIFL	96,29	0,34
p	114–122	B44	EEIRRIWRQ	53,30	0,49
41691	32–40	A1, A3, A26	MIDGIGRFY	52,31	0,32
p	438–446	A3	SDMRAEIIR	51,74	0,32
p	30–38	A3	GKMIDGIGR	50,99	0,26
19421	17–25	B44	GERQNATEI	1,53	0,02
p	125–133	B39	NGDDATAGL	1,40	0,16
p	333–341	A24	CNSAAFEDL	1,33	0,23
p	174–182	B27	RRSGAAGAA	98,13	0,11

Примечание. p — эпитоп предсказан.

Note. p — epitope is predicted.

 

Таблица 5. Анализ представленности иммуногенных ЦТЛ-эпитопов современных вирусов гриппа А в последовательностях NP вакцинных доноров

Table 5. Analysis of the representation of immunogenic CTL epitopes of contemporary influenza A viruses in the NP sequences of vaccine donors

Иммуногенные ЦТЛ-эпитопы Immunogenic CTL-epitopes				Вирусы-доноры для создания вакцин Donor viruses for vaccine development
Подтип вируса гриппа Influenza virus subtype	Аминокислотная последовательность Amino acid sequence	Номер эпитопа Epitope ID	ЦТЛ-иммуногенность  эпитопа, баллы Epitope CTL- immunogenicity, score	A/WSN/ 1933	A/Leningrad / 134/17/57	A/ Ann Arbor/  6/60	A/PR/8/34
H1N1	RMIGGIGRF	p	0,29	–	–	–	–
H1N1	GRMIGGIGR	p	0,27	–	–	–	–
H1N1	KRGINDRNF	167950	0,20	–	+	–	–
H1N1	GENGRRTRV	p	0,19	–	–	–	–
H1N1	NGEDATAGL	p	0,18	–	–	–	–
H1N1	IQNSITIER	p	0,17	–	–	–	–
H1N1	GEDATAGLT	p	0,14	–	–	–	–
H1N1	AMELIRMIK	p	0,13	–	–	–	–
H1N1	SVGRMIGGI	p	0,07	–	–	–	–
H1N1	AVKGIGTMV	p	0,06	–	–	–	–
H1N1	GERQDTTEI	p	0,05	–	–	–	–
H1N1	MELIRMIKR	41392	0,01	–	–	–	–
H1N1, H3N2	MIDGIGRFY	41691	0,32	+	–	+	–
H1N1, H3N2	GINDRNFWR	20377	0,29	–	–	–	–
H1N1, H3N2	RGINDRNFW	53890	0,17	–	+	–	–
H1N1, H3N2	RRSGAAGAA	p	0,11	+	+	+	+
H1N1, H3N2	SRNPGNAEI	p	0,11	–	+	+	–
H3N2	EEIRRIWRQ	p	0,49	+	+	+	+
H3N2	NAEIEDLIF	p	0,35	–	+	–	–
H3N2	SDMRAEIIR	p	0,32	–	–	+	–
H3N2	GKMIDGIGR	p	0,26	+	–	+	–
H3N2	AANPIVPSF	p	0,05	–	–	–	–
H3N2	GDRQNATEI	p	0,02	–	–	–	–
H3N2	AAVKGIGTM	p	0,01	–	–	–	–
H3N2	NGEDATSGL	p	0,01	–	–	–	–
Представленность ЦТЛ-эпитопов в последовательности NP различных вакцинных доноров, % Representation of CTL-epitopes in the NP sequence of different vaccine donors, %				16	24	24	8

Примечание. p — эпитоп предсказан.

Note. p — epitope is predicted.

 

Однако, в отличие от этого вакцинного донора, в пределах NP А/Ann Arbor/6/60 (H2N2) были выявлены два уникальных консервативных эпитопа (251–259 и 438–446) и не обнаружены такие эпитопы как 198–206, 199–207, 276–284, 211–219, 213–221, присутствующие в NP антигене родственного вируса А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Далее мы провели поиск иммуногенных ЦТЛ-эпитопов, содержащих не более одного сайта протеолиза, в последовательностях NP современных штаммов вирусов гриппа А подтипа H1N1 и H3N2, рекомендованных ВОЗ для включения в состав поливалентных вакцин для применения в эпидемические сезоны 2018–2024 гг. в Северном полушарии, а затем оценили представленность обнаруженных эпитопов в NP вакцинных доноров (табл. 5).

В целом проведенный анализ показал, что большинство NP-специфических иммунодоминантных ЦТЛ-эпитопов вакцинных прототипов, разработанных на основе антигенно устаревших вирусов гриппа А, не присутствуют в современных штаммах, и напротив, представленность иммуногенных ЦТЛ-эпитопов NP антигена современных вирусов гриппа А у четырех наиболее популярных вакцинных доноров не превышает 24% (табл. 5), что может иметь по крайней мере два негативных последствия. Во-первых, массовое применение вакцин на основе неактуальных NP доноров приведет к клональной экспансии эффекторных CD8⁺ Т-лимфоцитов, не способных к распознаванию и уничтожению клеток, инфицированных недавними вариантами вируса гриппа, что неоправданно истощит иммунную систему вакцинируемых. Во-вторых, большинство новых эпитопов NP современных вирусов гриппа не будет распознаваться индуцированными вакциной T-клетками, поскольку эти эпитопы еще не были представлены в вакцинах на основе классических доноров.

Среди проанализированных ЦТЛ-эпитопов NP четырех наиболее популярных вакцинных доноров по степени консервативности можно выделить три группы пептидов: высококонсервативные (для которых процент консервации составляет более 90%), среднеконсервативные (сохраняющиеся у 40–55% современных штаммов вируса гриппа А) и низкоконсервативные (с консервацией 3% и менее). Выявленные различия в степени консервативности отдельных эпитопов NP могут свидетельствовать о дифференциальном действии естественного отбора со стороны иммунной системы хозяина в процессе вирусной эволюции. Это предположение может быть в дальнейшем дополнительно проверено с помощью алгоритмов оценки молекулярной эволюции [10, 12].

Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что NP-специфические CD8⁺ Т-клетки, генерируемые в ответ на вакцинацию штаммами, полученными на основе классичес ких доноров, будут способны распознавать лишь небольшую часть иммуногенных ЦТЛ-эпитопов NP антигена современных вариантов вируса гриппа. Этот недостаток может быть устранен либо введением в состав штаммов цельновирионных гриппозных вакцин, помимо генов поверхностных белков (гемагглютинина и нейраминидазы), гена NP актуальных вирусных вариантов, либо направленным точечным мутагенезом последовательностей NP вакцинных доноров для приведения ее в соответствие антигенному набору ЦТЛ-эпитопов NP современных вирусов гриппа А.

Заключение

В настоящем исследовании был выявлен ряд экспериментальных и предсказанных иммуногенных ЦТЛ-эпитопов в белке нуклеокапсида стандартных вакцинных доноров для создания гриппозных вакцин и проанализирована степень их консервативности по наличию в NP современных штаммов вируса гриппа А. По результатам анализа степени консервации этих эпитопов, большая их часть отсутствует в NP антигене штаммов вируса гриппа А подтипов H1N1 и H3N2, циркулировавших в мире с 2009 по 2023 год. Таким образом, существует вероятность ограниченной перекрестной NP-специфичности, а, следовательно, и защитной функции вакцин-индуцированных CD8⁺ Т-лимфоцитов, что может быть скорректировано за счет актуализации эпитопного состава NP вакцинных доноров в соответствии с таковым у современных вирусных вариантов. Выявленные в работе последовательности иммуногенных ЦТЛ-эпитопов NP могут быть использованы для конструирования новых прототипов вакцин против гриппа с улучшенными кросс-протективными свойствами.

About the authors

Alexandra Ya. Rak

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: rak.ay@iemspb.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Immunology and Prophylaxis of Viral Infections, A.A. Smorodintsev Department of Virology

Россия, 197376, St. Petersburg, Akademika Pavlova str., 12

L. G. Rudenkо

Institute of Experimental Medicine

Email: rak.ay@iemspb.ru

DSc (Medicine), Professor, Head of A.A. Smorodintsev Department of Virology

Россия, 197376, St. Petersburg, Akademika Pavlova str., 12

I. N. Isakova-Sivak

Institute of Experimental Medicine

Email: rak.ay@iemspb.ru

RAS Corresponding Member, DSc (Biology), Head of the Laboratory of Immunology and Prophylaxis of Viral Infections, A.A. Smorodintsev Department of Virology

Россия, 197376, St. Petersburg, Akademika Pavlova str., 12

References

Supplementary files