Overexpressing miR-222-3p in cultured Mycobacterium Tuberculosis-infected macrophages does not affect their bacteriostatic activity

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Tuberculosis, a disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis, is a major public health concern. Innate and adaptive immunity provide robust defense against pathogens. However, M. tuberculosis, which co-evolved with humans, has acquired many mechanisms to evade the immune response and ensure its intracellular existence and long-term survival within the host. Moreover, emerging evidence suggests that this secretive bacterium can alter expression of regulatory noncoding RNAs (including microRNAs), leading to dysregulation of biological processes underlying tuberculosis pathogenesis. For example, miR-222-3p has been shown to regulate the functional reprogramming of macrophages and is involved in the regulation of host innate immunity. Previously, we demonstrated the important role of miR-222-3p as a biological marker of tuberculosis activity. To confirm their biological targets and understand their role in the pathogenesis of tuberculosis, many research groups are working to establish functional relationships between miRNA expression under different conditions and their actual biological action using molecular biology and bioinformatics methods. In the present study, we demonstrated the effect of miR-222-3p overexpression on several functions of human macrophages of monocytic origin activated with M. tuberculosis antigens in in vitro culture. Specifically, we found that miR-222-3p overexpression significantly decreased IL-6 and IFNγ expression and increased IL-1β and cxcl10 expression in cultures of uninfected macrophages. Infected macrophages overexpressing miR-222-3p were characterized by increased NF-κB and IL-6 expression, as were infected macrophages without transfection. Another important finding was that miR-222-3p overexpression caused a small but significant increase in reactive nitrogen species production by infected macrophages, but did not affect their bacteriostatic activity against M. tuberculosis. Elucidating the functions of different microRNAs in regulating different pathogenic pathways in TB may lead to discovering new therapeutic targets. The detailed study of microRNAs that regulate immune-associated pathways will be useful for the design of miRNA mimetic molecules, either as inhibitors or as activators. Immune effects induced by miRNA drugs are currently a major challenge for miRNA therapeutics.

Full Text

Введение

Актуальность выявления новых легкодоступных биомаркеров для диагностики туберкулеза (ТБ), а также маркеров, способных указать на обострение воспаления, изменение активности инфекционного процесса при ТБ не вызывает сомнения. Ведущая роль в иммунном ответе, развивающемся при ТБ инфекции, принадлежит профессиональным фагоцитам, а именно, макрофагам. Макрофаги являются первой линией защиты на пути микобактерий. Данные клетки вовлечены в развитие как врожденного, так и адаптивного иммунного ответов. Макрофаги способны нейтрализовать и устранять бактерии путем индукции апоптоза, воспалительных реакций и фагоцитарной активности [12]. За тысячелетия сосуществования с человеком микобактерии, как организм с внутриклеточным типом паразитирования, выработали широкий спектр защитных механизмов, препятствующих их элиминации. Так, микобактерии способны

1) препятствовать фагоцитозу, а также образованию фаголизосом в макрофагах;
2) нейтрализовать кислую среду [3];
3) блокировать формирование мембраны апоптотических везикул [4];
4) ингибировать восстановление плазматической мембраны, что может приводить к распространению инфекции через некроз макрофагов [2];
5) подавлять активацию иммунных клеток, препятствовать презентации антигена;
6) модулировать экспрессию генов связанных с патогенезом заболевания и влиять на экспрессию микроРНК (miRs) через ключевые точки их регуляции.

miRs — это короткие, биологически консервативные некодирующие РНК, участвующие в регуляции ряда клеточных (пролиферация, дифференцировка и апоптоз) и физиологичес ких процессов, таких как воспалительный ответ, эмбриогенез и онкогенез [8]. Регуляторная роль молекул miRs показана как при аутоиммунных, так и при инфекционных заболеваниях. Они служат своего рода факторами, запускающими либо тормозящими развитие реакций врожденного и адаптивного ответов и, таким образом, могут играть решающую роль в развитии бактериальных инфекционных заболеваний [6]. miRs потенциально могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических биомаркеров заболевания и ответа на терапию. Ряд исследований посвящен поиску miRs маркеров в легкодоступных биообразцах, таких как цельная кровь. В нашем предыдущем исследовании мы описываем паттерн экспрессии из 6 зрелых сывороточных miRs (miR-155-5p, miR-191-5p, miR-223-5p, miR-222-3p, miR-26a-5p и miR-320-5p) у пациентов с различными вариантами ТБ легких. По уровню и направлению экспрессии данных miR можно охарактеризовать различные варианты течения ТБ (с разной интенсивностью воспалительных иммунологических процессов) [10, 11]. Чувствительность и специфичность вышеупомянутых miRs в качестве использования их как биомаркеров активности ТБ 88–100%.

Ранее было показано, что miR-222-3p регулирует функциональное перепрограммирование макрофагов и участвует в регуляции врожденного иммунитета хозяина. Кроме того, продемонстрировано снижение экспрессии этой miR под действием внутриклеточной паразитарной инфекции Echinococcus multilocularis, участие данной miR в регуляции иммунной функции макрофагов [13]. Однако механизм действия miR-222 при ТБ остается неизвестен. В нашей работе мы исследуем влияние гиперэкспрессии miR-222 на функцию макрофагов при экспериментальной ТБ инфекции.

Материалы и методы

Выделение моноцитов крови и культивирование макрофагов. В работе использовали цельную кровь здоровых доноров. Донорами до момента забора крови была подписана форма добровольного информированного согласия. Исследование было одобрено ЛЭК ФГБНУ «ЦНИИТ» (протокол № 13 от 28.12.2021). Мононуклеары выделяли из крови здоровых доноров с использованием градиента фиколла с плотностью 1,077 г/л (ПанЭко, Россия). После чего клетки отмывали и инкубировали 3 часа в чашках Петри при 37°С и 5% СО2 в среде DMEM (ПанЭко, Россия). Из прилипших к пластику моноцитов «воспитывали» макрофаги по методу, описанному S. Saeed и коллегами [9] в присутствии 10% активной человеческой сыворотки. В экспериментах использовали сыворотку, полученную от тех же доноров, что и кровь для выделения моноцитов, либо донорскую сыворотку от доноров с идентичной группой крови АВ0 и резус-фактором. Обогащение культуры моноцитов макрофагами оценивали по экспрессии макрофагального поверхностного маркера CD163.

Антигены. В работе использовали вирулентный штамм M. tuberculosis H37RV Pasteur из коллекции ФГБНУ «ЦНИИТ». Наработку микобактерий для экспериментов in vitro производили по ранее описанной методике [7]. В ряде экспериментов in vitro в качестве антигена использовали ультрозвуковой дезентиграт культуры микобактерий (микобактериальный соникат) 10 мкг/мл. Соникат микобактерий был любезно предоставлен В.Г. Авдиенко.

Трансфекция. Для стимуляции гиперэкс прессии miR-222 использовали синтетический аналог данной miR:

hsa-miR-222: (rC)(U)(rC)-(rA)(rG)(U)-(rA)(rG)(rC)-(rC)(rA)(rG)-(U)(rG)(U)-(rA)(rG)(rA)-(U)(rC)(rC)-(U).

Трансфекцию малой интерферирующей РНК осуществляли с использованием набора HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Германия) согласно рекомендации фирмы изготовителя. Через 72 часа трансфицирования макрофаги отмывали и культивировали с контрольной средой в течение 24 часов. Полученные таким образом культуры клеток использовали в экспериментах in vitro. В качестве отрицательного контроля макрофаги трансфицировали смесью без РНК и смесью, содержащей Negative Control siRNA (Qiagen, Германия) (NC).

Выделение РНК и синтез кДНК. Для выделения суммарной РНК из культуры макрофагов использовали TRIzol® Reagent (ThermoFisher Scientific (Ambion), США). Полученные образцы РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК. кДНК получали при помощи набора реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия). кДНК miRs получали при помощи TaqMan® Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (ThermoFisher Scientific, США) в соответствии с методикой, описанной ранее [10].

ПЦР в реальном времени. qRT-PCR с кДНК проводили с использованием системы CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США), специфических праймеров, зондов TaqMan и реагентов ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems, США) для определения уровней мРНК генов, связанных с воспалением. GAPDH использовался в качестве гена домашнего хозяйства.

Для определения уровней экспрессии miR использовали TaqMan™ Advanced miRNA Assay (ThermoFisher Scientific, США). Ген miR-186 был выбран в качестве гена с постоянным уровнем экспрессии в соответствии с рекомендациями TaqMan® Advanced miRNA Assays User Guide (ThermoFisher Scientific, США).

Определение бактериостатической функции макрофагов. Бактериостатическую функцию макрофагов оценивали методом регистрации включения [3H]-урацила микобактериями при совместном культивировании с макрофагами по ранее описанной методике [1]. Подавление роста микобактерий в культурах Мф представляли в процентах от включения [3H]-урацила микобактериями в культурах без Мф. Продукцию активных форм азота макрофагами при их совместном культивировании с микобактериями определяли по концентрации нитрит-аниона с использованием реактива Грисса [1].

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки полученных данных использовали t-тест с поправкой на множества Бонферони при сравнении более двух групп. Отличия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Для получения макрофагальной культуры с гиперэкспрессией miR-222, Мф, «воспитанные» из моноцитов крови, подвергали трансфекции синтетическим аналогом hsa-miR-222. Через 72 часа клетки отмывали от среды трансфицирования и культивировали 24 часа в присутствии либо в отсутствии сониката микобактерий. Из рис. 1А видно, что наличие микобактериальных антигенов в культуре неинфицированных Мф вело к достоверному снижению экспрессии miR-222. Обработка «наивных» макрофагов синтетическим аналогом miR-222 приводила к достоверному усилению экспрессии данной miR. В то время как наличие микобактериальных антигенов в культуре отменяло эффект гиперэкспрессии miR-222. Отрицательным контролем в экспериментах in vitro являлись культуры макрофагов человека, обработанные трансфицирующим агентом без РНК и смесью трансфицирующего агента с NC. Достоверных отличий между культурами «наивных» Мф (без трансфекции) и культурами отрицательного контроля в экспериментах in vitro получено не было.

Усиление экспрессии miR-222 приводило к подавлению экспрессии miR-26a в неинфицированных Мф, но не влияло на экспрессию последней при наличии в культуре антигенов микобактерий (рис. 1Б). Воздействие сониката микобактерий на культуру Мф приводило к достоверному понижению экспрессии miR-191, miR-223 и miR-320 (рис. 1Б, В). Гиперэкспрессия miR-222 отменяла данное действие микобактериальных антигенов для miR-191 и miR-223; и не влияла на экспрессию данных miR в культуре «наивных» Мф (рис. 1Б). В случае miR-320 увеличенное количество miR-222 в культуре приводило к сильному достоверному снижению экспрессии данной miR неинфицированными Мф и увеличивало экспрессию miR-320 в присутствии в культуре антигенов микобактерий (рис. 1В).

 

Рисунок 1. Динамика Т-клеточного ответа на вакцинацию YF17D. Доля ЖЛ-специфических TCRb клонов от всего репертуара в различных точках до и после вакцинации

Figure 1. Dynamics of the T cell response towards YF17D vaccination. Fraction of the YF-specific TCRb from the whole repertoire in different timepoints

 

В этих же культурах оценивали экспрессию факторов воспаления (цитокинов и хемокинов). Было продемонстрировано, что гиперэкспресссия miR-222 приводит к достоверному снижению экспрессии IL-6, IFNγ и увеличению экспрессии IL-1β и cxcl10 в культуре неинфицированных Мф (рис. 2А, В, Д, Е). Причем при усиленной экспрессии miR-222, как и в культурах клеток без трансфекции, экспрессия IL-6 и IL-1β достоверно выше в культуре, содержащей соникат (рис. 2А, Д); в то время как уровень экспрессии IFNγ не менялся и был одинаков в инфицированных культурах Мф после трансфекции и без трансфекции (рис. 2В). Экспрессия cxcl10 достоверно увеличивалась у трансфицированных Мф в присутствии сониката (рис. 2Е). Культуры инфицированных Мф с гиперэкспрессией miR-222, также, как и инфицированные Мф без трансфекции, характеризовались повышенным уровнем экспрессии NF-IL6. Причем, экспрессия данного гена у Мф после трансфекции была достоверно ниже (рис. 2Б). Гиперэкспрессия miR-222 не влияла на экспрессию TNF в Мф как в присутствии, так и в отсутствии антигенов микобактерий (рис. 2Г).

 

Рисунок 2. Фенотипический состав ЖЛ-специфических клонов. Доля CD8+ и CD4+ популяций среди всех ответивших клонов в различных точках после вакцинации

Figure 2. Phenotypes of the YF-specific clones. Fraction of the CD8+ and CD4+ populations from all expanded clones in different timepoints

 

Мишенью miR-222 является липидная фосфотаза PTEN [14], которая обладает ингибирующим действием в отношении PI3K/AKT/NF-κB путей и, следовательно, способна регулировать активность транскрипционного фактора NF-κB. NF-κB в свою очередь имеет решающее значение для индукции и выработки ряда воспалительных факторов и цитокинов (таких как IL-1β, IL-6, TNF). Таким образом, гиперпродукция miR-222 будет приводить к ингибированию NF-κB и как следствие снижению экспрессии провоспалительных цитокинов, что согласуется с полученными нами результатами.

Одна из основных функций Мф при ТБ инфекции — элиминация микобактерий, поэтому на следующем этапе исследования было оценено влияние гиперэкспрессии miR-222 на бактериостатическую активность макрофагов. Для чего трансфицированные и «наивные» Мф культивировали совместно с вирулентным штаммом M. tuberculosis при соотношении микобактерия : Мф в культуре 5 : 1. Через 72 часа в данных культурах оценивали ограничение роста микобактерий по включению последними 3H-урацила, а также генерацию активных форм азота (NO●) по продукции нитрит-аниона (рис. 3).

 

Рисунок 3. Графы для ЖЛ-специфических клонов. Каждая точка на графе обозначает отдельный клонотип. Черным цветом обозначены CD8+ клоны, серым CD4+. Приведен консенсусный мотив для самого большого кластера

Figure 3. Graphs of the YF-specific clones. Each dot represents a clonotype. Black colour represents CD8+ clones, grey CD4+. The consensus motif of the largest cluster is shown

 

Было показано, что гиперэкспрессия miR-222 приводит к небольшому достоверному увеличению продукции активных форм азота инфицированными Мф, но не влияет на их бактериостатическую активность (рис. 3). Для miR-222 показано сильное понижение экспрессии при поляризации Мф в сторону М1 [5], что характерно на начальных этапах ТБ инфекции. Гиперэкспрессия данной miR, напротив, препятствует дифференцировке Мф и как следствие может влиять на активацию бактериостатической функции фагоцитов.

Заключение

В результате проведенных исследований нам удалось показать, что гиперэкспрессия miR-222 в культуре инфицированных Mtb макрофагов человека не ведет к существенному изменению продукции IFNγ, а также их бактериостатичес кой активности. При этом, miR-222 оказывает стимулирующее воздействие на продукцию оксида азота, IL-1β и cxcl10 и понижает экспрессию IL-6 и IFNγ. Наши результаты согласуются с данными, полученными Chen Zonghai и соавт. [14], которые показали, что добавление ESAT6 в культуру клеток макрофагальной линии клеток ведет к снижению экспрессии miR-222-3p, и как следствие, подавляет выработку провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, IL-1b и TNF, способствуя экспрессии фосфатазы и тензина (PTEN), что в конечном итоге благоприятствует репликации Mycobacterium smegmatis. Наше исследование закладывает основу для интеграции miRs в клиническую практику для обогащения персонализированных и креативных диагностических стратегий, и дальнейшего принятия решений о лечении ТБ, особенно при лечении пациентов с лекарственной устойчивостью.

×

About the authors

Galina S. Shepelkova

Central Tuberculosis Research Institute (CTRI)

Author for correspondence.
Email: shepelkovag@yahoo.com

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory for Biotechnology, Department of Immunology

Russian Federation, 107564, Moscow, Yauza alley, 2

V. V. Evstifeev

Central Tuberculosis Research Institute (CTRI)

Email: shepelkovag@yahoo.com

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory for Biotechnology, Department of Immunology

Russian Federation, 107564, Moscow, Yauza alley, 2

V. V. Yeremeev

Central Tuberculosis Research Institute (CTRI)

Email: shepelkovag@yahoo.com

DSc (Medicine), Head Researcher, Head of the Department of Immunology

Russian Federation, 107564, Moscow, Yauza alley, 2

References

  1. Шепелькова Г.С., Майоров К.Б., Евстифеев В.В., Апт А.С. Взаимодействие Т-лимфоцитов CD4⁺CD27hi и CD4⁺CD27lo с макрофагами при туберкулезной инфекции у мышей // Туберкулез и болезни легких. 2015. № 12. С. 57–60. [Shepelkova G.S., Mayorov K.B., Evstifeev V.V., Аpt А.S. Interaction of T-lymphocytes of CD4⁺CD27hi and CD4⁺CD27lo with macrophages in tuberculous infection in mice. Tuberkulez i bolezni legkikh = Tuberculosis and Lung Diseases, 2015, no. 12, pp. 57–60. (In Russ.)]
  2. Divangahi M., Chen M., Gan H., Desjardins D., Hickman T.T., Lee D.M., Fortune S., Behar S.M., Remold H.G. Mycobacterium tuberculosis evades macrophage defenses by inhibiting plasma membrane repair. Nat. Immunol., 2009, vol. 10, no. 8, pp. 899–906. doi: 10.1038/ni.1758
  3. Flannagan R.S., Cosío G., Grinstein S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat. Rev. Microbiol., 2009, vol. 7, no. 5, pp. 355–366. doi: 10.1038/nrmicro2128
  4. Gan H., Lee J., Ren F., Chen M., Kornfeld H., Remold H.G. Mycobacterium tuberculosis blocks crosslinking of annexin-1 and apoptotic envelope formation on infected macrophages to maintain virulence. Nat. Immunol., 2008, vol. 9, no. 10, pp. 1189–1197. doi: 10.1038/ni.1654
  5. Graff J.W., Dickson A.M., Clay G., McCaffrey A.P., Wilson M.E. Identifying functional microRNAs in macrophages with pola rized phenotypes. J. Biol. Chem., 2012, vol. 287, no. 26, pp. 21816–21825. doi: 10.1074/jbc.M111.327031
  6. Hou J., Wang P., Lin L., Liu X., Ma F., An H. MicroRNA-146a feedback inhibits RIG-I-dependent Type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6, IRAK1, and IRAK2. J. Immunol., 2009, vol. 183, no. 3, pp. 2150–2158. doi: 10.4049/jimmunol.0900707
  7. Lyadova I.V., Eruslanov E.B., Khaidukov S.V., Yeremeev V.V., Majorov K.B., Pichugin A.V., Nikonenko B.V., Kondratieva T.K., Apt A.S. Comparative analysis of T lymphocytes recovered from the lungs of mice genetically susceptible, resistant, and hyperresistant to Mycobacterium tuberculosis-triggered disease. J. Immunol., 2000, vol. 165, no. 10, pp. 5921–31 doi: 10.4049/jimmunol.165.10.5921
  8. Naqvi A.R., Sarwat M. MicroRNAs and immunity. Semin. Cell. Dev. Biol., 2022, vol. 124, pp. 1–2. doi: 10.1016/j.semcdb. 2021.10.007
  9. Saeed S., Quintin J., Kerstens H.H., Rao N.A., Aghajanirefah A., Matarese F., Cheng S.C., Ratter J., Berentsen K., van der Ent M.A., Sharifi N., Janssen-Megens E.M., Ter Huurne M., Mandoli A., van Schaik T., Ng A., Burden F., Downes K., Frontini M., Kumar V., Giamarellos-Bourboulis E.J., Ouwehand W.H., van der Meer J.W., Joosten L.A., Wijmenga C., Martens J.H., Xavier R.J., Logie C., Netea M.G., Stunnenberg H.G. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science, 2014, vol. 345, no. 6204: 12510⁸6. doi: 10.1126/science.12510⁸6
  10. Shepelkova G.S., Evstifeev V.V., Berezovskiy Yu.S., Tarasov R.V., Bagirov M.A., Yeremeev V.V. Lung Inflammation Signature in Post-COVID-19 TB Patients. Int. J. Mol. Sci., 2023, vol. 24, no. 22: 16315. doi: 10.3390/ijms242216315
  11. Shepelkova G.S., Evstifeev V.V., Tarasov R.V., Ergeshova A.E., Bagirov M.A., Yeremeev V.V. MicroRNAs as Biomarkers of Active Pulmonary TB Course. Microorganisms, 2023, vol. 11, no. 3: 626. doi: 10.3390/microorganisms11030626
  12. Simmons J.D., Stein C.M., Seshadri C., Campo M., Alter G., Fortune S., Schurr E., Wallis R.S., Churchyard G., Mayanja-Kizza H., Boom W.H., Hawn T.R. Immunological mechanisms of human resistance to persistent Mycobacterium tuberculosis infection. Nat. Rev. Immunol., 2018, vol. 18, no. 9, pp. 575–589. doi: 10.1038/s41577-018-0025-3
  13. Zheng Y. Suppression of mouse miRNA-222-3p in response to echinococcus multilocularis infection. Int. Immunopharmacol., 2018, vol. 64, pp. 252–255. doi: 10.1016/j.intimp.2018.09.004
  14. Zonghai C., Tao L., Pengjiao M., Liang G., Rongchuan Z., Xinyan W., Wenyi N., Wei L., Yi W., Lang B. Mycobacterium tuberculosis ESAT6 modulates host innate immunity by downregulating miR-222-3p target PTEN. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis., 2022, vol. 1868, no. 1: 166292. doi: 10.1016/j.bbadis.2021.166292

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1. Dynamics of the T cell response towards YF17D vaccination. Fraction of the YF-specific TCRb from the whole repertoire in different timepoints

Download (358KB)
Indexing metadata
3. Figure 2. Phenotypes of the YF-specific clones. Fraction of the CD8+ and CD4+ populations from all expanded clones in different timepoints

Download (589KB)
Indexing metadata
4. Figure 3. Graphs of the YF-specific clones. Each dot represents a clonotype. Black colour represents CD8+ clones, grey CD4+. The consensus motif of the largest cluster is shown

Download (121KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Shepelkova G.S., Evstifeev V.V., Yeremeev V.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies