Overexpressing miR-222-3p in cultured Mycobacterium Tuberculosis-infected macrophages does not affect their bacteriostatic activity

Full Text

Введение

Актуальность выявления новых легкодоступных биомаркеров для диагностики туберкулеза (ТБ), а также маркеров, способных указать на обострение воспаления, изменение активности инфекционного процесса при ТБ не вызывает сомнения. Ведущая роль в иммунном ответе, развивающемся при ТБ инфекции, принадлежит профессиональным фагоцитам, а именно, макрофагам. Макрофаги являются первой линией защиты на пути микобактерий. Данные клетки вовлечены в развитие как врожденного, так и адаптивного иммунного ответов. Макрофаги способны нейтрализовать и устранять бактерии путем индукции апоптоза, воспалительных реакций и фагоцитарной активности [12]. За тысячелетия сосуществования с человеком микобактерии, как организм с внутриклеточным типом паразитирования, выработали широкий спектр защитных механизмов, препятствующих их элиминации. Так, микобактерии способны

miRs — это короткие, биологически консервативные некодирующие РНК, участвующие в регуляции ряда клеточных (пролиферация, дифференцировка и апоптоз) и физиологичес ких процессов, таких как воспалительный ответ, эмбриогенез и онкогенез [8]. Регуляторная роль молекул miRs показана как при аутоиммунных, так и при инфекционных заболеваниях. Они служат своего рода факторами, запускающими либо тормозящими развитие реакций врожденного и адаптивного ответов и, таким образом, могут играть решающую роль в развитии бактериальных инфекционных заболеваний [6]. miRs потенциально могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических биомаркеров заболевания и ответа на терапию. Ряд исследований посвящен поиску miRs маркеров в легкодоступных биообразцах, таких как цельная кровь. В нашем предыдущем исследовании мы описываем паттерн экспрессии из 6 зрелых сывороточных miRs (miR-155-5p, miR-191-5p, miR-223-5p, miR-222-3p, miR-26a-5p и miR-320-5p) у пациентов с различными вариантами ТБ легких. По уровню и направлению экспрессии данных miR можно охарактеризовать различные варианты течения ТБ (с разной интенсивностью воспалительных иммунологических процессов) [10, 11]. Чувствительность и специфичность вышеупомянутых miRs в качестве использования их как биомаркеров активности ТБ 88–100%.

Ранее было показано, что miR-222-3p регулирует функциональное перепрограммирование макрофагов и участвует в регуляции врожденного иммунитета хозяина. Кроме того, продемонстрировано снижение экспрессии этой miR под действием внутриклеточной паразитарной инфекции Echinococcus multilocularis, участие данной miR в регуляции иммунной функции макрофагов [13]. Однако механизм действия miR-222 при ТБ остается неизвестен. В нашей работе мы исследуем влияние гиперэкспрессии miR-222 на функцию макрофагов при экспериментальной ТБ инфекции.

Материалы и методы

Выделение моноцитов крови и культивирование макрофагов. В работе использовали цельную кровь здоровых доноров. Донорами до момента забора крови была подписана форма добровольного информированного согласия. Исследование было одобрено ЛЭК ФГБНУ «ЦНИИТ» (протокол № 13 от 28.12.2021). Мононуклеары выделяли из крови здоровых доноров с использованием градиента фиколла с плотностью 1,077 г/л (ПанЭко, Россия). После чего клетки отмывали и инкубировали 3 часа в чашках Петри при 37°С и 5% СО₂ в среде DMEM (ПанЭко, Россия). Из прилипших к пластику моноцитов «воспитывали» макрофаги по методу, описанному S. Saeed и коллегами [9] в присутствии 10% активной человеческой сыворотки. В экспериментах использовали сыворотку, полученную от тех же доноров, что и кровь для выделения моноцитов, либо донорскую сыворотку от доноров с идентичной группой крови АВ0 и резус-фактором. Обогащение культуры моноцитов макрофагами оценивали по экспрессии макрофагального поверхностного маркера CD163.

Антигены. В работе использовали вирулентный штамм M. tuberculosis H37RV Pasteur из коллекции ФГБНУ «ЦНИИТ». Наработку микобактерий для экспериментов in vitro производили по ранее описанной методике [7]. В ряде экспериментов in vitro в качестве антигена использовали ультрозвуковой дезентиграт культуры микобактерий (микобактериальный соникат) 10 мкг/мл. Соникат микобактерий был любезно предоставлен В.Г. Авдиенко.

Трансфекция. Для стимуляции гиперэкс прессии miR-222 использовали синтетический аналог данной miR:

hsa-miR-222: (rC)(U)(rC)-(rA)(rG)(U)-(rA)(rG)(rC)-(rC)(rA)(rG)-(U)(rG)(U)-(rA)(rG)(rA)-(U)(rC)(rC)-(U).

Трансфекцию малой интерферирующей РНК осуществляли с использованием набора HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Германия) согласно рекомендации фирмы изготовителя. Через 72 часа трансфицирования макрофаги отмывали и культивировали с контрольной средой в течение 24 часов. Полученные таким образом культуры клеток использовали в экспериментах in vitro. В качестве отрицательного контроля макрофаги трансфицировали смесью без РНК и смесью, содержащей Negative Control siRNA (Qiagen, Германия) (NC).

Выделение РНК и синтез кДНК. Для выделения суммарной РНК из культуры макрофагов использовали TRIzol^® Reagent (ThermoFisher Scientific (Ambion), США). Полученные образцы РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК. кДНК получали при помощи набора реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия). кДНК miRs получали при помощи TaqMan^® Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (ThermoFisher Scientific, США) в соответствии с методикой, описанной ранее [10].

ПЦР в реальном времени. qRT-PCR с кДНК проводили с использованием системы CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, США), специфических праймеров, зондов TaqMan и реагентов ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems, США) для определения уровней мРНК генов, связанных с воспалением. GAPDH использовался в качестве гена домашнего хозяйства.

Для определения уровней экспрессии miR использовали TaqMan™ Advanced miRNA Assay (ThermoFisher Scientific, США). Ген miR-186 был выбран в качестве гена с постоянным уровнем экспрессии в соответствии с рекомендациями TaqMan^® Advanced miRNA Assays User Guide (ThermoFisher Scientific, США).

Определение бактериостатической функции макрофагов. Бактериостатическую функцию макрофагов оценивали методом регистрации включения [³H]-урацила микобактериями при совместном культивировании с макрофагами по ранее описанной методике [1]. Подавление роста микобактерий в культурах Мф представляли в процентах от включения [³H]-урацила микобактериями в культурах без Мф. Продукцию активных форм азота макрофагами при их совместном культивировании с микобактериями определяли по концентрации нитрит-аниона с использованием реактива Грисса [1].

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки полученных данных использовали t-тест с поправкой на множества Бонферони при сравнении более двух групп. Отличия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Для получения макрофагальной культуры с гиперэкспрессией miR-222, Мф, «воспитанные» из моноцитов крови, подвергали трансфекции синтетическим аналогом hsa-miR-222. Через 72 часа клетки отмывали от среды трансфицирования и культивировали 24 часа в присутствии либо в отсутствии сониката микобактерий. Из рис. 1А видно, что наличие микобактериальных антигенов в культуре неинфицированных Мф вело к достоверному снижению экспрессии miR-222. Обработка «наивных» макрофагов синтетическим аналогом miR-222 приводила к достоверному усилению экспрессии данной miR. В то время как наличие микобактериальных антигенов в культуре отменяло эффект гиперэкспрессии miR-222. Отрицательным контролем в экспериментах in vitro являлись культуры макрофагов человека, обработанные трансфицирующим агентом без РНК и смесью трансфицирующего агента с NC. Достоверных отличий между культурами «наивных» Мф (без трансфекции) и культурами отрицательного контроля в экспериментах in vitro получено не было.

Усиление экспрессии miR-222 приводило к подавлению экспрессии miR-26a в неинфицированных Мф, но не влияло на экспрессию последней при наличии в культуре антигенов микобактерий (рис. 1Б). Воздействие сониката микобактерий на культуру Мф приводило к достоверному понижению экспрессии miR-191, miR-223 и miR-320 (рис. 1Б, В). Гиперэкспрессия miR-222 отменяла данное действие микобактериальных антигенов для miR-191 и miR-223; и не влияла на экспрессию данных miR в культуре «наивных» Мф (рис. 1Б). В случае miR-320 увеличенное количество miR-222 в культуре приводило к сильному достоверному снижению экспрессии данной miR неинфицированными Мф и увеличивало экспрессию miR-320 в присутствии в культуре антигенов микобактерий (рис. 1В).

 

Рисунок 1. Динамика Т-клеточного ответа на вакцинацию YF17D. Доля ЖЛ-специфических TCRb клонов от всего репертуара в различных точках до и после вакцинации

Figure 1. Dynamics of the T cell response towards YF17D vaccination. Fraction of the YF-specific TCRb from the whole repertoire in different timepoints

 

В этих же культурах оценивали экспрессию факторов воспаления (цитокинов и хемокинов). Было продемонстрировано, что гиперэкспресссия miR-222 приводит к достоверному снижению экспрессии IL-6, IFNγ и увеличению экспрессии IL-1β и cxcl10 в культуре неинфицированных Мф (рис. 2А, В, Д, Е). Причем при усиленной экспрессии miR-222, как и в культурах клеток без трансфекции, экспрессия IL-6 и IL-1β достоверно выше в культуре, содержащей соникат (рис. 2А, Д); в то время как уровень экспрессии IFNγ не менялся и был одинаков в инфицированных культурах Мф после трансфекции и без трансфекции (рис. 2В). Экспрессия cxcl10 достоверно увеличивалась у трансфицированных Мф в присутствии сониката (рис. 2Е). Культуры инфицированных Мф с гиперэкспрессией miR-222, также, как и инфицированные Мф без трансфекции, характеризовались повышенным уровнем экспрессии NF-IL6. Причем, экспрессия данного гена у Мф после трансфекции была достоверно ниже (рис. 2Б). Гиперэкспрессия miR-222 не влияла на экспрессию TNF в Мф как в присутствии, так и в отсутствии антигенов микобактерий (рис. 2Г).

 

Рисунок 2. Фенотипический состав ЖЛ-специфических клонов. Доля CD8+ и CD4+ популяций среди всех ответивших клонов в различных точках после вакцинации

Figure 2. Phenotypes of the YF-specific clones. Fraction of the CD8⁺ and CD4⁺ populations from all expanded clones in different timepoints

 

Мишенью miR-222 является липидная фосфотаза PTEN [14], которая обладает ингибирующим действием в отношении PI3K/AKT/NF-κB путей и, следовательно, способна регулировать активность транскрипционного фактора NF-κB. NF-κB в свою очередь имеет решающее значение для индукции и выработки ряда воспалительных факторов и цитокинов (таких как IL-1β, IL-6, TNF). Таким образом, гиперпродукция miR-222 будет приводить к ингибированию NF-κB и как следствие снижению экспрессии провоспалительных цитокинов, что согласуется с полученными нами результатами.

Одна из основных функций Мф при ТБ инфекции — элиминация микобактерий, поэтому на следующем этапе исследования было оценено влияние гиперэкспрессии miR-222 на бактериостатическую активность макрофагов. Для чего трансфицированные и «наивные» Мф культивировали совместно с вирулентным штаммом M. tuberculosis при соотношении микобактерия : Мф в культуре 5 : 1. Через 72 часа в данных культурах оценивали ограничение роста микобактерий по включению последними ³H-урацила, а также генерацию активных форм азота (NO^●) по продукции нитрит-аниона (рис. 3).

 

Рисунок 3. Графы для ЖЛ-специфических клонов. Каждая точка на графе обозначает отдельный клонотип. Черным цветом обозначены CD8⁺ клоны, серым CD4⁺. Приведен консенсусный мотив для самого большого кластера

Figure 3. Graphs of the YF-specific clones. Each dot represents a clonotype. Black colour represents CD8⁺ clones, grey CD4⁺. The consensus motif of the largest cluster is shown

 

Было показано, что гиперэкспрессия miR-222 приводит к небольшому достоверному увеличению продукции активных форм азота инфицированными Мф, но не влияет на их бактериостатическую активность (рис. 3). Для miR-222 показано сильное понижение экспрессии при поляризации Мф в сторону М1 [5], что характерно на начальных этапах ТБ инфекции. Гиперэкспрессия данной miR, напротив, препятствует дифференцировке Мф и как следствие может влиять на активацию бактериостатической функции фагоцитов.

Заключение

В результате проведенных исследований нам удалось показать, что гиперэкспрессия miR-222 в культуре инфицированных Mtb макрофагов человека не ведет к существенному изменению продукции IFNγ, а также их бактериостатичес кой активности. При этом, miR-222 оказывает стимулирующее воздействие на продукцию оксида азота, IL-1β и cxcl10 и понижает экспрессию IL-6 и IFNγ. Наши результаты согласуются с данными, полученными Chen Zonghai и соавт. [14], которые показали, что добавление ESAT6 в культуру клеток макрофагальной линии клеток ведет к снижению экспрессии miR-222-3p, и как следствие, подавляет выработку провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, IL-1b и TNF, способствуя экспрессии фосфатазы и тензина (PTEN), что в конечном итоге благоприятствует репликации Mycobacterium smegmatis. Наше исследование закладывает основу для интеграции miRs в клиническую практику для обогащения персонализированных и креативных диагностических стратегий, и дальнейшего принятия решений о лечении ТБ, особенно при лечении пациентов с лекарственной устойчивостью.

About the authors

Galina S. Shepelkova

Central Tuberculosis Research Institute (CTRI)

Author for correspondence.
Email: shepelkovag@yahoo.com

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory for Biotechnology, Department of Immunology

Россия, 107564, Moscow, Yauza alley, 2

V. V. Evstifeev

Central Tuberculosis Research Institute (CTRI)

Email: shepelkovag@yahoo.com

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory for Biotechnology, Department of Immunology

Россия, 107564, Moscow, Yauza alley, 2

V. V. Yeremeev

Central Tuberculosis Research Institute (CTRI)

Email: shepelkovag@yahoo.com

DSc (Medicine), Head Researcher, Head of the Department of Immunology

Россия, 107564, Moscow, Yauza alley, 2

References

Supplementary files