Oxidative stress induced by the human microbiota yeast component as a micromycetes pathogenicity factor

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

The introduction of MALDI-ToF mass spectrometry into routine microbiological diagnostics has led to a widely extended list of identified microorganisms. This phenomenon also affected mycological studies. Rare basidiomycetes and ascomycetes began to be detected in various types of pathological material. It is often difficult to assess a role of isolated micromycetes in the pathogenesis of a certain disease. In addition to generally admitted pathogenicity factors, such as aggression enzymes, adhesive activity, and toxin formation, induction or inhibition of reactive oxygen species can play a prominent role in pathogenesis of infectious diseases. In our study, we evaluated the total prooxidant and total antioxidant activity of cultivated ascomycete and basidiomycete yeasts from the human intestinal mycobiome. The strains of micromycetes assessed here were obtained from a fecal culture study from patients with gastrointestinal tract pathology and healthy people undergoing a routine medical examination. Identification was carried out analyzing morphological, cultural, biochemical properties and confirmed by mass spectrometry. The total prooxidant and antioxidant activity was assessed by the induced or inhibited malondialdehyde formation during Tween-80 oxidation. It was found that the level of total prooxidant activity in Rhodotorula mucilaginosa, Geotrichum candidum, Candida albicans, Pichia kudriavzevii significantly exceeds the level of total antioxidant activity, and the Pichia kudriavzevii prooxidase activity was more than twice as high as in other studied micromycetes. The revealed ability of some fungi to induce oxidase stress can be considered as one of significant pathogenicity factors of microorganisms that cause pathomorphological changes in human intestinal tissues.

Full Text

Введение

Увеличение доступности секвенирования нового поколения (NGS) и масс-cпектрометрии привело к кратному росту количества работ, посвященных изучению бактериального компонента микробиома кишечника. Однако отмечается и рост количества работ, связанных с изучением грибов — микобиома кишечника.

Методы метагеномики и масс-спектрометрической идентификации культивируемых микроорганизмов кишечника расширили наши знания об этиологическом разнообразии бактерий и микромицетов желудочно-кишечного тракта.

Кроме хорошо изученных грибов рода Candida и Aspergillus появилась возможность идентификации микромицетов других таксономических групп.

Расширение спектра идентифицированных микромицетов привело к вопросу об их роли в симбиотических отношениях с организмом человека.

Обнаружение в патологическом материале недостаточно изученных микроорганизмов приводит к вопросу о роли найденного микромицета в данном конкретном заболевании. Часто в литературе наряду с сообщениями о патогенной роли того или иного микромицета встречаются сообщения и о его пробиотической активности [11, 13, 20]. Кроме того, микромицеты кишечника влияют на работу различных органов и систем [26], тем самым еще более затрудняя определение их роли во взаимоотношении с организмом человеком.

Для решение этого вопроса в первую очередь необходимо оценить патогенетический потенциал микроорганизма, который складывается из совокупности свойств, приводящих к способности повреждать органы и ткани организма хозяина. Традиционно эти свойства включают способность к адгезии, синтезу ферментов агрессии, токсинообразованию и т.д.

Помимо общепризнанных факторов патогенности есть ряд биологических процессов, которым уделяется недостаточно внимания. В настоящее время роль свободно-радикальных процессов в патогенезе соматических заболеваний человека и в качестве регуляторных физиологических механизмов не вызывает сомнений. С другой стороны, значение свободно-радикального окисления и перекисного окисления липидов (ПОЛ) во взаимоотношениях между отдельными представителями микробиоты и организмом человека изучены недостаточно. Работы, касающиеся данного вопроса, в большей степени посвящены антиоксидантной активности пробиотиков [8, 24]. Роль же прооксидантной активности кишечной микрофлоры изучена недостаточно.

Методы оценки про- и антиоксидантной активности различаются по типу источника окисления, окисляемого вещества и способа детекции окисленного соединения. Одним из наиболее принятых способов оценки ПОЛ является определение малонового диальдегида — основного биохимического маркера перекисного окисления биополимеров [23].

В нашей работе мы сравнили общую прооксидантную активность (ОПА) и общую антиоксидантную активность (ОАА) аскомицетных (Candida albicans, Pichia spp., Geotrichum candidum, Wickerhamiella pararugosa, Brettanomyces bruxellensis, Coniochaeta hoffmannii) и базидиомицетных (Rhodotorula mucilaginosa, Trichosporon asahii) дрожжей, выделенных из кишечника человека.

Материалы и методы

В работе были исследованы базидомицетные дрожжи Rhodotorula mucilaginosa (20 штаммов), Trichosporon asahii (3 штамма) и аскомицетные дрожжи Candida albicans (11 штаммов), Geotrichum candidum (18 штаммов), Pichia kudriavzevii (7 штаммов), Brettanomyces bruxellensis (2 штамма), Pichia kluyveri (1 штамм), Pichia fermentas (1 штамм), Pichia cactophila (1 штамм) и Wickerhamiella pararugosa (1 штамм), Coniochaeta hoffmannii (1 штамм). Все штаммы были получены при бактериологическом исследовании кала пациентов амбулаторного отделения крупного медицинского центра.

Кал засевался на среду Сабуро с 2% глюкозы и хлорамфениколом (0,4 г/л) и инкубировался при 35°С в течение 72 ч, далее чашки в течении недели инкубировались при температуре 25°С.

Идентификация дрожжей проводилась на основе их морфологических, биохимических и культуральных свойств при помощи Atlas of Clinical Fungi (De Hoog G.S. et al., 2020, 4th ed.) и Интернет-ресурса www.clinicalfungi.org.

Для более точной идентификации дрожжей был использован масс-спектрометр «Microflex» (Bruker Daltonik GmbH & Co. KG, Германия) с программным обеспечением MALDI Biotyper, использующий референсную базу данных (содержит более 2500 видов МО и 7800 штаммов).

Для оценки прооксидантной и антиоксидантной активности готовили суспензии 48–72-часовой культуры исследуемых микромицетов в физиологическом растворе хлорида натрия. При помощи Densi-La-Meter II (Erba Group, EU) суспензии доводили до оптической плотности, равной 1,0–2,5 МакФарланда, в зависимости от вида микроорганизма, что соответствовало 107 КОЕ/мл (рассчитано при помощи камеры Горяева).

Суммарную прооксидантную активность оценивали по интенсивности окраски флуоресцентного комплекса, образующегося при взаимодействии продуктов перекисного окисления Твин-80 с тиобарбитуровой кислотой при помощи спектрофотометра «Cary 50» (Varian, США) (результаты представлены в процентах от значения контрольной пробы [1]).

Антиоксидантную активность суспензий микромицетов оценивали по изменению интегративного показателя общей антиоксидантной активности [3] (определяется по ингибированию Fe2+/аскорбат индуцируемого накопления продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой при окислении Твин-80 (результаты выражены в процентах от значения контрольной пробы).

Анализ и статистическая обработка данных был проведен при помощи расчета парного t-критерия Стьюдента. Анализ нормальности распределения проводился при помощи критерия Андерсона–Дарлинга, р < 0,05.

Результаты

Используемая в настоящей работе методика не позволяет оценить тонкие механизмы про- и антиоксидантной активности исследуемых микроорганизмов. В то же время оценка интегративных показателей ОАА и ОПА дают некоторое понимание об участии активных форм кислорода во взаимоотношении дрожжей кишечника с организмом человека.

На рис. представлены данные ОАА и ОПА исследуемых микромицетов.

 

Рисунок. Общая прооксидантная и антиоксидантная активность дрожжей кишечника человека

Figure. Total prooxidant and antioxidant activity of human intestinal yeast

 

К сожалению, частота встречаемости некоторых грибов кишечника не позволяет нам провести полноценный, статистически достоверный анализ ОАА и ОПА, и полученные нами данные носят лишь ориентировочный характер.

В то же время данные, полученные при исследовании R. mucilaginosa, G. candidum, C. albicans, P. kudriavzevii, показывают значимость индуцируемой прооксидантной активности.

Из представленных данных видно, что ОПА исследуемых микроорганизмов статистически достоверно превышает их ОАА. Таким образом, в патогенезе заболеваний, вызванных R. mucilaginosa, G. candidum, C. albicans, P. kudriavzevii, окислительный стресс может играть существенное значение.

Среди изученных микроорганизмов обращает на себя внимание P. kudriavzevii, ОПА которой более чем в 2 раза превышает прооксидазную активность других микроорганизмов.

Несмотря на невозможность достоверной оценки ОАА и ОПА, штаммы W. pararugosa, P. fermentas, P. cactophila показали признаки антиоксидазной активности, что требует более внимательного их рассмотрения с точки зрения их пробиотической активности.

Обсуждение

Существует большое количество работ, подтверждающих участие оксидативного стресса в воспалительных заболеваниях кишечника, таких как болезнь Крона [6], неспецифическом язвенном колите [15] и других патологических процессах кишечника. Кроме того, с оксидативным стрессом связывают метаболический синдром [4], неалкогольный жировой гепатоз [7] и пр.

Экспериментальные данные показывают, что в присутствии кишечной микрофлоры энтероциты кишечника способны генерировать «физиологический уровень» оксидативного стресса [9]. Также была отмечена четкая связь между дисбиозом кишечника и окислительным стрессом [22, 25]. И в большинстве работ в качестве причины дисбиоза рассматривается окислительный стресс, независимо от причины, его вызвавшей.

В настоящей работе мы предлагаем рассмотреть точку зрения, согласно которой микроорганизмы, входящие в состав микрофлоры кишечника, способны вызывать накопление активных форм кислорода, что в свою очередь может запускать каскад патофизиологических изменений в тканях кишечника человека, приводящих к заболеванию.

В настоящем исследовании была выявлена статистически значимая прооксидантная активность грибов R. mucilaginosa, G. candidum, C. albicans, P. kudriavzevii.

Роль C. albicans в качестве этиологического агента заболеваний различных органов человека хорошо известна и не вызывает сомнений. Обнаруженная в настоящем исследовании прооксидантная активность C. albicans показывает наличие еще одного аспекта патогенеза кандидозов.

R. mucilaginosa описан как один из возбудителей фунгемии и поражения центральной нервной системы, хотя есть данные о поражении других биотопов [14]. В последние десятилетия отмечается значительный рост заболеваний, вызванных данным микромицетом. Центральная нервная система и кровь, чаще поражаемые этими грибами, относятся к органам с высоким парциальным давлением кислорода [16], что косвенно подтверждает важную роль прооксидантной активности, вызванной данным микромицетом в патологическом процессе.

G. candidum также стал чаще встречаться в качестве этиологического агента, поражающего эндокард, легкие, глаза и др. [10, 18, 21]. Его прооксидантная активность, по всей видимости, играет существенную роль в патогенезе вызываемых им заболеваний.

P. kudriavzevii, телеморф Candida krusei, способна вызывать фунгемию [19], перитонит [5] и другие патологии. С другой стороны, в ряде работ описаны пробиотические свойства данного микроорганизма [12, 17]. Обнаруженная в нашей работе его прооксидантная активность, вероятно, вносит существенный вклад в патогенность данных микроорганизмов.

Несмотря на недостаточный объем информации о значимости исследуемых микроорганизмов в патологии кишечника, данные микроорганизмы с более высокой частотой обнаруживаются у людей с патологией желудочно-кишечного тракта [2], чем у здоровых людей.

Образование малонового диальдегида также тесно связано с образованием простагландинов. Это соединение представляет собой альдегид и является одним из видов электофильных соединений, которые вызывают токсический стресс в клетках и образуют ковалентные белковые аддукты (ALE), по аналогии с конечными продуктами гликирования. Таким образом, прооксидантная активность дрожжей кишечника может напрямую влиять на физиологические процессы тканей кишечника человека.

Результаты нашего исследования позволяют сделать предположение еще об одном механизме патогенного воздействия микромицетов на ткани организма человека. Для более достоверной оценки роли оксидативного стресса, индуцированного микромицетами кишечника, необходимы дальнейшее исследования.

×

About the authors

V. V. Prokopyev

Altai State Medical University; Clinical Diagnostic Laboratory “Zdorovie”

Author for correspondence.
Email: prokopievvv@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Virology, Bacteriologist

Russian Federation, Barnaul; Barnaul

N. V. Kuklina

Altai State Medical University

Email: prokopievvv@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Virology

Russian Federation, Barnaul

O. N. Mazko

Altai State Medical University

Email: prokopievvv@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Pharmacology named after professor V.M. Bryukhanov

Russian Federation, Barnaul

O. G. Makarova

Altai State Medical University

Email: prokopievvv@mail.ru

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Pharmacology named after professor V.M. Bryukhanov

Russian Federation, Barnaul

References

  1. Патент № 2146053 Российская Федерация, МПК G01N 33/53(2006.01), G01N 33/49(2006.01), G01N 33/84(2006.01). Способ определения прооксидантной активности биологического материала: № 97101937/14; заявлено 1997.02.10: опубликовано 2000.02.27 / Молчанов А.В., Галактионова Л.П. Патентообладатель: Алтайский государственный медицинский университет. 6 с. [Patent No. 2146053 Russian Federation, Int. Cl. G01N 33/53(2006.01), G01N 33/49(2006.01), G01N 33/84(2006.01). Method for determining pro-oxidation activity of a biological material. No. 97101937/14; application: 1997.02.10: date of publication 2000.02.27 / Molchanov A.V., Galaktionova L.P. Proprietor: Altajskij gosudarstvennyj meditsinskij universitet. 6 p.]
  2. Прокопьев В.В., Куклина Н.В., Емельянова И.В., Звездкина Г.С. Анализ культивируемых грибов кишечника у пациентов с патологией желудочно-кишечного тракта и клинически здоровых людей // Проблемы медицинской микологии. 2023. Т. 25, № 1. С. 19–24. [Prokopiev V.V., Kuklina N.V., Emelyanova I.V., Zvezdkina G.S. Analysis of cultivated intestinal fungi in patients with pathology of the gastrointestinal tract and clinically healthy people. Problemy meditsinskoi mikologii = Problems in Medical Mycology, 2023, vol. 25, no. 1, pp. 19–25. (In Russ.)] doi: 10.24412/1999-6780-2023-1-19-24
  3. Талалаева О.С., Зверев Я.Ф., Замятина С.В. Сравнительная оценка антиоксидантной и прооксидантной активностей препарата гистохром в экспериментах in vitro и in vivo // Бюллетень медицинской науки. 2017. № 4 (8). С. 30–35. [Talalaeva O.S., Zverev Ya.F., Zamyatina S.V. Comparative assessment of histochrome’s antioxidant and prooxidant activities in terms of in vitro and in vivo experiments. Bulleten’meditsinskoy nauki = Bulletin of Medical Science, 2017, no. 4 (8), pp. 30–35. (In Russ.)] doi: 10.31684/2541-8475.2017.4(8).30-35
  4. Шантырь И.И., Родионов Г.Г., Фоминых Ю.А., Бацков С.С., Ушал И.Э., Колобова Е.А., Светкина Е.В., Санников М.В. Состояние микробиоты кишечника и параметры оксидативного стресса у пациентов с метаболическим синдромом // Экология человека. 2019. № 6. С. 23–29. [Shantir’ I.I., Rodionov G.G., Fominykh Yu.A., Batskov S.S., Ushal I.E., Kolobova E.A., Svetkina E.V., Sannikov M.V. Intestinal microbiota and oxidative stress in patients with metabolic syndrome. Ekologiya heloveka = Human Ecology, 2019, no. 6, pp. 23–29. (In Russ.)] doi: 10.33396/1728-0869-2019-6-23-29
  5. Al Bshabshe A., Joseph M.R.P., Battayah E.S., Hamid M.E. Fungal peritonitis caused by Pichia kudriavzevii following sleeve gastrectomy. Ann. Saudi Med., 2019, vo. 39, no. 3, pp. 205–208. doi: 10.5144/0256-4947.2019.205
  6. Alemany-Cosme E., Sáez-González E., Moret I., Mateos B., Iborra M., Nos P., Sandoval J., Beltrán B. Oxidative stress in the pathogenesis of Crohn’s disease and the interconnection with immunological response, microbiota, external environmental factors, and epigenetics. Antioxidants (Basel), 2021, vol. 10, no. 1: 64. doi: 10.3390/antiox10010064
  7. Borrelli A., Bonelli P., Tuccillo F.M., Goldfine I.D., Evans J.L., Buonaguro F.M., Mancini A. Role of gut microbiota and oxidative stress in the progression of non-alcoholic fatty liver disease to hepatocarcinoma: current and innovative therapeutic approaches. Redox Biol., 2018, vol. 15, pp. 467–479. doi: 10.1016/j.redox.2018.01.009
  8. Campanella D., Rizzello C.G., Fasciano C., Gambacorta G., Pinto D., Marzani B., Scarano N., De Angelis M., Gobbetti M. Exploitation of grape marc as functional substrate for lactic acid bacteria and bifidobacteria growth and enhanced antioxidant activity. Food Microbiol., 2017, vol. 65, pp. 25–35. doi: 10.1016/j.fm.2017.01.019
  9. Dumitrescu L., Popescu-Olaru I., Cozma L., Tulbă D., Hinescu M.E., Ceafalan L.C., Gherghiceanu M., Popescu B.O. Oxidative stress and the microbiota-gut-brain axis. Oxid. Med. Cell. Longev., 2018, vol. 2018: 2406594. doi: 10.1155/2018/2406594
  10. Ghosh P., Boler A.K. Geotrichum candidum: a rare primary pathogen in pulmonary geotrichosis. Indian J. Med. Res., 2020, vol. 152, suppl. 1, pp. S123–S124. doi: 10.4103/ijmr.IJMR_2202_19
  11. Hof H. Rhodotorula spp. in the gut – foe or friend? GMS Infect. Dis., 2019, vol. 7: Doc02. doi: 10.3205/id000042
  12. Hong S.M., Kwon H.J., Park S.J., Seong W.J., Kim I., Kim J.H. Genomic and probiotic characterization of SJP-SNU strain of Pichia kudriavzevii. AMB Express, 2018, vol. 8, no. 1: 80. doi: 10.1186/s13568- 018-0609-0
  13. Jagirdar J., Geller S.A., Bottone E.J. Geotrichum candidum as a tissue invasive human pathogen. Hum. Pathol., 1981, vol. 12, no. 7, pp. 668–671. doi: 10.1016/s0046- 8177(81)80055-x
  14. Jarros I.C., Veiga F.F., Corrêa J.L., Barros I.L.E., Gadelha M.C., Voidaleski M.F., Pieralisi N., Pedroso R.B., Vicente V.A., Negri M., Svidzinski T.I.E. Microbiological and virulence aspects of Rhodotorula mucilaginosa. EXCLI J., 2020, vol. 19, pp. 687–704.
  15. Koch T.R., Yuan L.X., Stryker S.J., Ratliff P., Telford G.L., Opara E.C. Total antioxidant capacity of colon in patients with chronic ulcerative colitis. Dig. Dis. Sci., 2000, vol. 45, no. 9, pp. 1814–1819. doi: 10.1023/a:1005517824877.
  16. Meena S., Singh G., Dabas Y., Rajshekhar P., Xess I. Geotrichum candidum in infective endocarditis. J. Glob. Infect. Dis., 2017, vol. 9, no. 3, pp. 127–128. doi: 10.4103/jgid.jgid_112_16
  17. Moure M.C., Pérez Torrado R., Garmendia G., Vero S., Querol A., Alconada T., León Peláez Á. Characterization of kefir yeasts with antifungal capacity against Aspergillus species. Int. Microbiol., 2023, vol. 26, no. 2, pp. 361–370. doi: 10.1007/s10123-022-00296-z
  18. Myint T., Dykhuizen M.J., McDonald C.H., Ribes J.A. Post operative fungal endopthalmitis due to Geotrichum candidum. Med. Mycol. Case Rep., 2015, vol. 10, pp. 4–6. doi: 10.1016/j.mmcr.2015.11.001
  19. Nagarathnamma T., Chunchanur S.K., Rudramurthy S.M., Vineetha K.R., Ramamurthy K., Joseph J., Ambica R. Outbreak of Pichia kudriavzevii fungaemia in a neonatal intensive care unit. J. Med. Microbiol., 2017, vol. 66, no. 12, pp. 1759–1764. doi: 10.1099/jmm.0.000645
  20. Noor-Ul H., Haokun L., Junyan J., Xiaoming Z., Dong H., Yunxia Y., Shouqi X. Dietary supplementation of Geotrichum candidum improves growth, gut microbiota, immune-related gene expression and disease resistance in gibel carp CAS Ⅲ (Carassius auratus gibelio). Fish Shellfish Immunol., 2020, vol. 99, pp. 144–153. doi: 10.1016/j.fsi.2020.02.001
  21. Singhal R., Shah Y.M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J. Biol. Chem., 2020, vol. 295, no. 30, pp. 10493–10505. doi: 10.1074/jbc.REV120.011188
  22. Tomasello G., Mazzola M., Leone A., Sinagra E., Zummo G., Farina F., Damiani P., Cappello F., Gerges Geagea A., Jurjus A., Bou Assi T., Messina M., Carini F. Nutrition, oxidative stress and intestinal dysbiosis: Influence of diet on gut microbiota in inflammatory bowel diseases. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub., 2016, vol. 160, no. 4, pp. 461–466. doi: 10.5507/bp.2016.052
  23. Tsikas D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: analytical and biological challenges. Anal. Biochem. 2017, vol. 524, pp. 13–30. doi: 10.1016/j.ab.2016.10.021
  24. Wang Y., Wu Y., Wang Y., Xu H., Mei X., Yu D., Wang Y., Li W. Antioxidant properties of probiotic bacteria. Nutrients, 2017, vol. 9, no. 5: 521. doi: 10.3390/nu9050521
  25. Weiss G.A., Hennet T. Mechanisms and consequences of intestinal dysbiosis. Cell. Mol. Life Sci., 2017, vol. 74, no. 16, pp. 2959–2977. doi: 10.1007/s00018- 017-2509-x
  26. Wu X., Xia Y., He F., Zhu C., Ren W. Intestinal mycobiota in health and diseases: from a disrupted equilibrium to clinical opportunities. Microbiome, 2021, vol. 9, no. 1: 60. doi: 10.1186/s40168- 021-01024-x

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure. Total prooxidant and antioxidant activity of human intestinal yeast

Download (338KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Prokopyev V.V., Kuklina N.V., Mazko O.N., Makarova O.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies