Method for identification of acinetobacter baumannii bv. tryptophandestruens and its subbiovars A and B

Full Text

Введение

В 2021 г. было опубликовано описание бактерий биовара tryptophandestruens A. baumannii, осуществляющего хромогенную биотрансформацию L-триптофана [1]. Авторы предложили проводить идентификацию бактерий этого биовара тестами на хромогенную биотрансформацию L-триптофана и отсутствие утилизации гиппурата натрия, что доступно лабораториям любого уровня. Тест на хромогенную биотрансформацию антраниловой кислоты использовать не предлагали, ввиду ограничения доступа лабораторий к этому веществу как прекурсору наркотических средств. Дальнейшие наши исследования показали значительное распространение бактерий биовара tryptophandestruens среди клинических изолятов A. baumannii, однако обнаружили единичные штаммы этого биовара отрицательные по хромогенной биотрансформации L-триптофана, что снижало диагностическую чувствительность идентификации.

Цель данного исследования — повысить диагностическую чувствительность метода идентификации бактерий A. baumannii bv. tryptophandestruens и определить распространенность этого биовара и его суббиоваров среди клинических изолятов A. baumannii.

Материалы и методы

Штаммы бактерий. Объектами исследования были 210 первичных штаммов A. baumannii, выделенных в 2021 и 2022 гг. в бактериологической лаборатории Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова. Из них 42 первичных штамма были иддентифицированы на кафедре микробиологии академии как A. baumannii bv. tryptophandestruens. В сравнительных исследованиях использовали штаммы других видов Acinetobacter: A. nosocomialis (n = 8), A. pittii (n = 8), A. calcoaceticus (n = 1), а также 34 видов других 22 родов (Pseudomonas, Moraxella, Burkholderia, Stenotrophomonas, Alcaligenes, Shewanella, Salmonella, Klebsiella, Serratia, Hafnia, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Morganella, Providentia, Escherichia, Shigella, Yersinia, Vibrio, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus). Видовая принадлежность всех штаммов была подтверждена методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной ионизацией (MALDI-ToF MS) в Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова и НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. Все штаммы A. baumannii bv. tryptophandestruens находятся в рабочей коллекции культур Е.П. Сиволодского на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии.

Питательные среды и реактивы. Для культивирования бактерий использовали Колумбийский агар (НИЦФ, Санкт-Петербург)

Питательная среда для идентификации бактерий биовара A. baumannii bv. tryptophandestruens по хромогенной биотрансформации бензоата натрия и методика ее применения. Состав и приготовление питательной среды. В 1 л дистиллированной воды вносят: пептон ферментативный 5,0 г; NaCl 5,0 г; FeCl₃ 6H₂O (10% водный раствор) 0,1–1,0 мл; бромтимоловый синий (1,6% водный раствор) 3 мл; агар микробиологический 15,0 г; NaOH 4% раствор 2,6–3,0 мл; растворяют при нагревании все компоненты, затем добавляют бензоат натрия (CAS 532-32-1) 1,0–2,0 г: корректируют до рН 7,2±0,2; стерилизуют при 121°С в течение 20 мин, разливают в стерильные чашки Петри. Питательная среда имеет зеленую окраску, прозрачная, пригодна к использованию в течение 30 сут при хранении от 4°С до 8°С. Контроль питательной среды при приготовлении: суточные культуры контрольных штаммов (клинические штаммы A. baumannii и A. baumannii bv. tryptophandestruens) засевают петлей в виде бляшки диаметром 5 мм на поверхность исследуемой среды в чашке Петри, инкубируют аэробно при 37°С в течение 18 ч, учитывают результат: питательная среда пригодна к использованию, если вокруг газона бактерий штамма A. baumannii bv. tryptophandestruens имеется четко выраженная зона темно-коричневой окраски питательной среды (положительный контроль) при отсутствии зоны окраски питательной среды вокруг газона бактерий штамма A. baumannii (отрицательный контроль).

Применение питательной среды. Исследуемый материал — суточные агаровые культуры A. baumannii засевают петлей на поверхность питательной среды в виде бляшки в отдельных секторах чашки Петри (¹/₈ часть чашки), инкубируют аэробно при 37°С в течение 18 ч, затем учитывают результат. Наличие вокруг газона бактерий зоны темно-коричневой окраски питательной среды указывает на принадлежность данного штамма A. baumannii к биовару tryptophandestruens.

Питательная среда для идентификации суббиоваров А и В бактерий A. baumannii bv. tryptophandestruens по хромогенной биотрансформациии L-триптофана и методика ее применения. Состав и приготовление питательной среды такие же, как питательной среды с бензоатом натрия, в которой бензоат натрия заменен L-триптофаном в равном количестве (1,0–2,0 г). Для биологического контроля питательной среды используют клинические штаммы A. baumannii bv. tryptophandestruens положительные по хромогенной биотрансформации L-триптофана и отрицательные по хромогенной биотрансформации L-триптофана.

Применение питательной среды. Питательную среду для хромогенной биотрансформации L-триптофана используют совместно с питательной средой для хромогенной биотрансформации бензоата натрия по одинаковой методике. Наличие вокруг газона штамма бактерий A. baumannii темно-коричневой окраски среды на питательной среде с бензоатом натрия и питательной среде с L-триптофаном указывает на принадлежность штамма к биовару tryptophandestruens суббиовару А. Наличие вокруг газона штамма A. baumannii темно-коричневой окраски среды на питательной среде с бензоатом натрия и отсутствие окраски среды на питательной среде с L-триптофаном указывает на принадлежность штамма к биовару tryptophandestruens суббиовару В.

Питательная среда для выявления A. baumannii bv. tryptophandestruens по хромогенной биотрансформации антраниловой кислоты. Состав и применение среды такие же, как среды с бензоатом натрия, в которой бензоат натрия заменен антраниловой кислотой (1 г/л) и увеличено количество NaOH для приведения рН к 7,2. Применение среды такое же, как среды с бензоатом натрия. Появление темно-коричневой окраски питательной среды вокруг газона бактерий через 18–24 ч инкубации при 37°С идентифицирует бактерии A. baumannii bv. tryptophandestruens.

Методика постановки тестов для фенотипической идентификации бактерий группы A. baumannii. Отношение бактерий к окраске по Граму, морфологию и подвижность изучали микроскопическим методом. Наличие каталазы устанавливали тестом с 3% раствором пероксида водорода. Цитохромоксидазу определяли тестом с 1% водным раствором тетраметилпарафенилендиамина по появлению синей окраски бактерий через 20 с. Для проведения окислительно-ферментативного теста с глюкозой использовали среду Хью–Лейфсона. Нитратредуктазу и быструю уреазу (в течение 3 ч) выявляли, используя среды и реактивы микрообъемной тест-системы «Рапид-Энтеро» (НИИЭМ имени Пастера). Утилизацию субстратов в качестве единственных источников углерода проводили на плотной минимальной солевой среде по методике, изложенной в [3]. Использовали следующие субстраты: D-глюкоза, бензоат натрия, L-арабиноза, гиппурат натрия, антраниловая кислота, L-триптофан, L-орнитин, L-фенилаланин отечественного производства и путресцин производства Merck (Германия).

Идентификация видов бактерий методом MALDI-ToF MS. Использовали настольный MALDI-ToF масс-спектрометр Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc., Германия) в соответствии с инструкцией по применению.

Результаты

При исследовании отношения бактерий биовара tryptophandestruens A. baumannii к различным ароматическим соединениям нами неожиданно была обнаружена интенсивная хромогенная биотрансформация ими бензоата натрия, а также бензоата калия и бензойной кислоты. Темно-коричневая хромогенная реакция с бензоатом натрия полностью совпадала у всех штаммов биовара с хромогенной биотрансформацией антраниловой кислоты, характерной для этого биовара. Высокая специфичность хромогенной биотрансформации бензоата натрия была подтверждена отсутствием ее у остальных штаммов A. baumannii (кроме биовара), у прочих видов ацинетобактеров A. nosocomialis (n = 8), A. pittii (n = 8), A. soli (n = 4), A. baylyi (n = 10), A. calcoaceticus (n = 1), а также 34 видов других 22 родов (Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Alcaligenes, Shewanella, Klebsiella, Proteus, Morganella, Providentia, Escherichia, Shigella, Salmonella, Kluyvera, Serratia, Hafnia, Enterobacter, Citrobacter, Yersinia, Vibrio, Bacillus, Staphylococcus, Enterococcus). Учитывая безопасность и широкую доступность бензоата натрия в качестве консерванта пищевых продуктов (пищевая добавка Е 211), это вещество было использовано нами для метода идентификации биовара tryptophandestruens A. baumannii. Были созданы две плотных хромогенных питательных среды, содержащих раздельно бензоат натрия для выявления по его биотрансформации биовара tryptophandestruens и L-триптофан для выявления по его биотрансформации суббиоваров этого биовара. Методика приготовления этих сред и их совместного применения изложена в разделе «Материалы и методы».

Предложенным методом были идентифицированы среди 210 первичных клинических изолятов A. baumannii, выделенных в Санкт-Петербурге в 2021 и 2022 гг.,42 штамма A. baumannii bv. tryptophandestruens, в том числе впервые обнаружены его суббиовары А (27 таммов) и В (15 штаммов). Установлены фенотипические признаки биовара и его суббиоваров А и В. Все штаммы биовара tryptophandestruens вызывали хромогенную биотрансформацию бензоата натрия, антраниловой кислоты и не утилизировали в качестве единственного источника углерода L-арабинозу и гиппурат натрия. Штаммы суббиовара А отличались наличием хромогенной биотрансформации L-триптофана, а также не утилизировали L-орнитин и путресцин. Штаммы суббиовара В отличались отсутствием хромогенной биотрансформации L-триптофана, а также утилизировали L-орнитин и путресцин (табл. 1). Все штаммы биовара tryptophandestruens не утилизировали бензоат натрия, антраниловую кислоту, L-триптофан, но интенсивно утилизировали L-фенилаланин.

 

Таблица 1. Фенотипические признаки штаммов A. baumannii bv. tryptophandestruens суббиоваров А и В

Table 1. Phenotypic features A. baumannii bv. tryptophandestruens subbiovars A and B strаins

Фенотипические признаки Phenotype features	A. baumannii bv. tryptophandestruens subbiovar A (n = 27)	A. baumannii bv. tryptophandestruens subbiovar B (n = 15)
Хромогенная биотрансформация/Chromogenic biotransformation
Бензоат натрия/Sodium benzoate	+*	+
Антраниловая кислота/Anthranilic acid	+	+
L-Триптофан/L-Tryptophan	+	–
Утилизация/Utilization
L-Арабиноза/L-Arabinose	–**
Гиппурат натрия/Sodium hippurate
L-Орнитин/L-Ornithine		+
Путресцин/Putrescine	–	+

Примечание. * — все штаммы положительные; ** — все штаммы отрицательные.

Note. * — all strains are positive; ** — all strains are negative.

 

Разработанным методом идентификации биовара tryptophandestruens A. baumannii установлена частота распространения этого биовара и его суббиоваров среди первичных клинических изолятов A. baumannii, выделенных в Санкт-Петербурге в 2021 и 2022 гг. (табл. 2).

 

Таблица 2. Частота штаммов A. baumannii bv. tryptophandestruens среди первичных штаммов A. baumannii, выделенных в 2021–2022 гг.

Table 2. Frequency of A. baumannii bv. tryptophandestruens strains among primary A. baumannii strains isolated in 2021–2022 years

Годы выделения штаммов Years of strains isolation	Число первичных штаммов A. baumannii Number of primary strains of A. baumannii	Из них штаммов A. baumannii bv. tryptophandestruens, абс. M±m% Of these, A. baumannii bv. tryptophandestruens strains abs. M±m%
		суббиовар А subbiovar A	суббиовар В subbiovar B	всего биовар tryptophandestruens total biovar tryptophandestruens
2021	108	20 18,5±3,7	8 7,4±2,5	28 25,9±4,2
2022	102	7 6,85±2,5	7 6,85±2,5	14 13,7±3,4
2021 и 2022	210	27 12,9±2,3	15 7,1±1,7	42 20,0±3,5

 

В 2021 г. среди 108 штаммов A. baumannii выявлены 28 штаммов биовара (25,9 ±4,2%), в том числе суббиовара А — 20 штаммов (18,5±3,7%), суббиовара В — 8 штаммов (7,4±2,5%). В 2022 г. среди 102 штаммов A. baumannii быпи обнаружены 14 штаммов биовара (13,7±3,4%), в том числе 7 штаммов суббиовара А (6,85±2,5%) и 7 штаммов суббиовара В (6,85±2,5%). Всего за 2021 и 2022 гг. среди 210 штаммов A. baumannii были выделены 42 штамма биовара tryptophandestruens (20,0±3,5%), в том числе суббиовара А — 27 штаммов (12,9±2,3%) и суббиовара В — 15 штаммов (7,1±1,7%).

Диагностическая чувствительность выявления штаммов биовара tryptophandestruens A. baumannii повысилась за счет дополнительного выявления штаммов суббиовара В.

Обсуждение

Нами впервые выявлено свойство бактерий биовара tryptophandestruens A. baumannii осуществлять хромогенную биотрансформацию бензойной кислоты и ее солей — бензоата натрия и бензоата калия. Хромогенную биотрансформацию бензоата натрия вызывали все штаммы этого биовара и не вызывали все изученные штаммы других видов ацинетобактеров (A. pittii, A. nosocomialis, A. calcoaceticus, A. soli, A. baylyi) и 34 видов других 22 родов бактерий. Ранее нами была выявлена хромогенная биотрансформация антраниловой кислоты (орто-аминобензойной кислоты) всеми штаммами этого биовара A. baumannii [3], что указывает на равную таксономическую значимость этих тестов, специфичность и возможность использовать признак хромогенной биотрансформации бензоата натрия в качестве маркера биовара tryptophandestruens A. baumannii. Известно, что аэробная деградация L-триптофана до антранилата (антранилатный путь) осуществляется некоторыми бактериями (Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia metallidurans) трехступенчато с участием ферментов триптофан-2,3-диоксигеназы (ген kynA), кинуренинформамидазы (ген kynB) и кинурениназы (ген kynU) [4]. Химическая сущность дальнейших химических реакций антранилата натрия и бензоата натрия при их хромогенной биотрансформации неизвестна.

В ходе исследований были обнаружены два суббиовара биовара tryptophandestruens A. baumannii. Оба суббиовара вызывали хромогенную биотрансформацию бензоата натрия и антраниловой кислоты, не утилизировали L-арабинозу и гиппурат натрия; суббиовар А отличался наличием хромогенной биотрансформации L-триптофана, не утилизировал L-орнитин и путресцин; суббиовар В отличался отсутсвием хромогенной биотрансформации L-триптофана, утилизировал L-орнитин и путресцин. Оба суббиовара интенсивно утилизировали L-фенилаланин, что позволяет выделять их на селективной питательной среде «Ацинетобактер фенилаланин агар» [2].

Разработан и апробирован метод идентификации биовара tryptophandestruens A. baumannii и его суббиоваров двумя тестами на плотных хромогенных средах. Положительный результат теста на хромогенную биотрансформацию бензоата натрия на хромогенной среде с бензоатом натрия выявляет принадлехность штамма бактерий к биовару tryptophandestruens A. baumannii. Положительный результат теста на хромогенную биотрансформацию L-триптофана на хромогенной среде с L-триптофаном указывает на принадлежность штамма бактерий к суббиовару А этого биовара. Отрицательный результат теста на хромогенную биотрансформацию L-триптофана на хромогенной среде с L-триптофаном свидетельствует о принадлежности штамма бактерий к суббиовару В. Метод обеспечивает повышение диагностической чувствительности идентификации биовара за счет дополнительного выявления суббиовара В в сравнении с предыдущей методикой, в которой использовалась только хромогенная среда с L-триптофаном. Метод доступен для лабораторий любого уровня и может применяться для изучения экологии и эпидемиологии возбудителей ацинетобактерной инфекции. Данным методом была установлена частота распространения бактерий биовара tryptophandestruens среди первичных клинических изолятов A. baumannii в Санкт-Петербурге: в 2021–2022 гг. среди 210 изолятов были обнаужены 42 штамма биовара tryptophandestruens (20,0±3,5%), в том числе 27 штаммов (12,9±2,3%) суббиовара А и 15 штаммов (7,1±1,7%) суббиовара В.

В связи с существенным значением в патогенезе заболеваний человека нарушений метаболизма бензойной кислоты и ароматических аминокислот [1], представляет интерес исследование химического механизма хромогенной биотрансформации бензоата натрия, антраниловой кислоты, L-триптофана бактериями биовара tryptophandestruens A. baumannii, а также изучение особенностей их патогенности и лекарственной резистентности.

Заключение

Впервые выявлена хромогенная биотрансформация бензоата натрия (бензойной кислоты) бактериями биовара tryptophandestruens A. baumannii и установлена таксономическая значимость ее как маркера этого биовара. Обнаружены два суббиовара бактерий биовара tryptophandestruens и определенны их отличительные признаки. Разработан метод идентификации бактерий биовара tryptophandestruens A. baumannii и его суббиоваров А и В хромогенными средами с бензоатом натрия и L-триптофаном. Повышена диагностическая чувствительность идентификации бактерий биовара tryptophandestruens ввиду дополнительного выявления бактерий суббиовара В. Установлена частота распространения штаммов биовара tryptophandestruens и его суббиоваров среди первичных клинических изолятов A. baumannii в Санкт-Петербурге в 2021–2022 гг.: штаммов биовара — 20,0±3,5%, в том числе суббиовара А – 12,9±2,3%, суббиовара В – 7,1±1,7%.

Благодарности

Авторы благодарят старшего лаборанта кафедры микробиологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова Белогурову Татьяну Борисовну за помощь в исследованиях.

About the authors

Evgeny P. Sivolodskii

Military Medical Academy named after S.M. Kirov; Saint-Petersburg Pasteur Institute

Email: es279@yandex.ru

DSc (Medicine), Professor of the Department of Microbiology, Senior Researcher, Laboratory of Molecular and Biological Technologies

Россия, 194044, St. Petersburg, Akademika Lebedeva Street, 6; 197101, St. Petersburg, Mira Street, 14

Lyudmila A. Kraeva

Military Medical Academy named after S.M. Kirov; Saint-Petersburg Pasteur Institute

Email: lykraeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9115-3250
SPIN-code: 4863-4001
Scopus Author ID: 23473821900
ResearcherId: H-1786-2012

DSc (Medicine), Head of the Laboratory of Medical Bacteriology, Professor of the Department of Microbiology

Россия, 194044, St. Petersburg, Akademika Lebedeva Street, 6; 197101, St. Petersburg, Mira Street, 14

Elena V. Melnikova

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Email: es279@yandex.ru

Bacteriologist Laboratory of the Central Clinical Diagnostic Laboratory

Россия, 194044, St. Petersburg, Akademika Lebedeva Street, 6

Galina V. Gorelova

Military Medical Academy named after S.M. Kirov

Author for correspondence.
Email: es279@yandex.ru

Head of the Laboratory of Bacteriology, Central Clinical Diagnostic Laboratory

Россия, 194044, St. Petersburg, Akademika Lebedeva Street, 6

References

Supplementary files