IImmunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis bearing gene mutations associated with osteoporosis-predisposition

Lyubov V. Kurlaeva; Курлаева Любовь Владимировна; Tatyana F. Stepanova; Степанова Татьяна Федоровна; Ksenia B. Stepanova; Степанова Ксения Борисовна; Anastasia N. Kosyreva; Косырева Анастасия Николаевна; Irina V. Bakshtanovskaya; Бакштановская Ирина Владимировна; Galina A. Kalgina; Кальгина Галина Аркадьевна; Svetlana Andreevna Grigorieva; Григорьева Светлана Андреевна

doi:10.15789/2220-7619-IPI-8486

IImmunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis bearing gene mutations associated with osteoporosis-predisposition

Authors: Kurlaeva L.V.¹, Stepanova T.F.¹, Stepanova K.B.¹, Kosyreva A.N.¹, Bakshtanovskaya I.V.¹, Kalgina G.A.¹, Grigorieva S.A.¹
Affiliations:
1. Tyumen Region Infection Pathology Research Institute
Issue: Vol 13, No 5 (2023)
Pages: 923-930
Section: ORIGINAL ARTICLES
Submitted: 19.04.2023
Accepted: 03.11.2023
Published: 30.11.2023
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/8486
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-IPI-8486
ID: 8486

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

To identify the features of the immune system functioning in patients with chronic opisthorchiasis bearing mutations in loci associated with predisposition to developing osteoporosis, comprehensive studies of cellular and humoral arms were carried out. The state of the phagocytic system was assessed by assessing absorption, metabolic activity and reactive oxygen species formation to restore nitrosine tetrazolium (spontaneous and stimulated NBT test). The phenotype of lymphocytes was determined by flow cytometry. The humoral immune arm was evaluated by the number of immunoglobulin classes M, G, A and E. Differences in the functional state of various arms of the immune system were revealed. In patients with chronic opisthorchiasis in the presence of rs1544410 polymorphism of the gene encoding the intracellular vitamin D receptor, the relative number of T-helper cells is significantly lower than in the group with the normal allele. In the presence of rs1800012 polymorphism of the gene encoding the α1-chain of type I collagen, the absolute lymphocyte count is significantly higher, spontaneous and stimulated NBT test were lower, the number of DN-T lymphocytes is significantly lower (both in relative and absolute values). In the presence of the rs3736228 mutation of the gene encoding the transmembrane low-density lipoprotein receptor, the level of myeloperoxidase and the neutrophil stimulation index are lower, the absorption activity of neutrophils is higher. The presence of the rs2234693 mutation for estrogen receptor gene leads to significantly increased level of stimulated NBT test and IgG concentration. Thus, patients with chronic opisthorchiasis bearing mutations in the COL1 A1, LRP5, ESR1(rs2234693) genes, have altered both nonspecific innate reactions and parameters of the adaptive immune arm; mutation of the VDR gene solely affects adaptive immunity. Analysis of the results suggests that the presence of mutations associated with the development of osteoporosis has a modulating effect on the immune response in chronic opisthorchiasis invasion. The identification of polymorphic genes associated with metabolic disorders of bone tissue and the study of the immunological profile in patients with chronic opisthorchiasis invasion will allow to implement an individual approach in the treatment of such patients.

Keywords

immune response, nonspecific resistance, adaptive immunity, chronic opisthorchiasis, genetic polymorphisms, osteoporosis

Full Text

Введение

Вопросы о механизмах функционирования иммунной системы при хроническом описторхозе по-прежнему актуальны. В хронической фазе описторхоза основное значение имеют воспалительно-пролиферативные процессы, важны интенсивность и длительность инвазии [15]. Многолетние исследования иммунного статуса у людей с хронической описторхозной инвазией продемонстрировали активацию неспецифической резистентности (повышение значений кислородзависимой бактерицидности (НСТ-тест)), активности миелопероксидазы нейтрофильных гранулоцитов, повышение концентрации IL-8, высокое содержание хелперов и Т-лимфоцитов с поздним маркером активации (CD3⁺HLA^–DR⁺), снижение показателей адаптивного клеточного иммунитета (сниженное количество цитотоксических лимфоцитов), активацию гуморального звена иммунитета (повышение концентрации общих IgA, IgМ и IgE), повышение концентрации циркулирующих иммунных комплексов) [2, 4].

Существует взаимосвязь между функционированием костной и иммунной систем организма. В регуляции дифференцировки костной ткани и активации иммунной системы принимают участие одни и те же белки (интерлейкины-1 и -6, фактор некроза опухоли и др.). Обнаружены общие для клеток обеих систем рецепторы, факторы транскрипции, сигнальные пути. Остеобласты участвуют в регуляции образования иммуноцитов, синтезируя гранулоцитарный, макрофагальный колониестимулирующие факторы. Клетки иммунной системы с помощью синтезируемых ими медиаторов способны как усиливать процессы костной резорбции, так и тормозить их. Так, например, прямым ингибитором остеокластогенеза является интерлейкин-10, а трансформирующий фактор роста TGF-β, который синтезируют макрофаги и Т-лимфоциты, способен вызывать хемотаксис остеобластов, усиливать их пролиферацию [16]. Это дает основания предполагать, что полиморфизмы генов, ассоциированных с развитием остеопороза, влияющие на перестройку и активацию метаболических процессов организма, тем самым могут воздействовать на иммунный ответ у больных хроническим описторхозом.

Целью исследования было выявление взаимосвязи между наличием полиморфизмов, ассоциированных с развитием остеопороза, и особенностями функционирования иммунной системы у пациентов с хронической описторхозной инвазией.

Материалы и методы

Исследованы образцы венозной крови 22 пациентов с диагнозом «Описторхоз, хроническая фаза заболевания». Все пациенты дали информированное согласие на использование биологического материала в настоящем исследовании. Медиана возраста обследуемых составила 48 лет (IQR 38–59). Проведено комплексное исследование иммунологических показателей. Фагоцитарная активность нейтрофилов (ФАН) определялась по способности клеток поглощать частицы латекса с d = 10 мкм (ООО «ДИАЭМ», Россия) — процент нейтрофилов из 200 проанализированных, содержащих частицы латекса [11]. Метаболическую активность нейтрофилов определяли цитохимическим методом восстановления нитросинего тетразолия до диформазана (НСТ-тест спонтанный и стимулированный 10% раствором пирогенала) [11]. Спонтанный НСТ-тест отражал степень активации кислородзависимого метаболизма и связанную с ним наработку свободных радикалов, стимулированный вариант (in vitro) характеризовал функциональный резерв [17]. Уровень миелопероксидазы нейтрофилов выявляли спектрофотометрическим методом [17]. Исследование фенотипа лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии цельной периферической крови с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, США), меченых FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), ECD (phycoerythrin-Texas Red-X) и PC5 (phycoerythrin-cyanin5) на проточном цитофлуориметре «Cytomics FC-500» (Beckman Coulter, США). Использовалось трехцветное иммунофенотипирование по панелям: CD3/CD4/CD45, CD3/CD8/CD45, CD3/CD16+56/CD45 и CD3/CD19/CD45. Основные фенотипы лимфоцитов: Т-лимфоциты (CD3⁺CD19^–CD16/56^–CD45⁺), Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺CD45⁺), Т-цитотоксические (CD3⁺CD8⁺CD45⁺), NK-клетки (CD3^–CD16/56⁺CD45⁺), B-лимфоциты (CD3^–CD19⁺CD45⁺). Абсолютные значения были получены по двухплатформенной технологии с использованием результатов гематологического анализа. Концентрацию иммуноглобулинов М, G, А, и E в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью коммерческих наборов «Иммуноскрин-G, M, A-ИФА-БЕСТ» и «IgE-общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия). Концентрацию цитокинов (IFNγ, IL-4, IL-8, IL-10) определяли иммуноферментным методом с помощью коммерческих наборов «Гамма-интерферон-ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-4-ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-10-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия).

Выделение тотальной ДНК человека из образцов крови проводили с использованием коммерческих наборов «ДНК-сорб В» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Генетические полиморфизмы выявляли методом пиросеквенирования с применением системы генетического анализа PyroMark24 и коммерческих наборов реагентов (АмплиСенс Пироскрин «ОСТЕО-скрин»), предназначенных для оценки предрасположенности к развитию остеопороза путем обнаружения полиморфизмов в локусах:

rs1544410 гена VDR (Рецептор к витамину D);
rs1800012 гена COL1 A1 (Коллаген тип 1);
rs3736228 гена LRP5 (Рецептор к липопротеинам низкой плотности);
rs2234693 и rs9340799 гена ESR1 (Эстрогеновый рецептор);
rs4988235 гена LCT (Лактаза).

Статистическая обработка полученных результатов выполнена лицензионным программным обеспечением SPSS, версия 22.0, предназначенным для научных исследований и доказательной медицины. Оценка значимости различий между группами c нормальным распределением значений (подтвержденным тестом Шапиро–Уилка) проводилась с помощью t-критерия Стьюдента (Т-тест). Оценка значимости различий между группами при распределении, отличном от нормального, проводилась с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни (U-тест). Критический уровень значимости принимался < 0,05. Сравнивали показатели иммунной системы в группах больных хроническим описторхозом с наличием и отсутствием мутаций, ассоциированных с предрасположенностью к остеопорозу. В статье представлены достоверно различающиеся показатели (р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Результаты нашего исследования показали: у пациентов полиморфизмом rs1544410 гена, кодирующего внутриклеточный рецептор витамина D, выявлено достоверно (р = 0,02, Т-тест) меньшее относительное количество Т-хелперов 40,5±3,24 по сравнению с пациентами без данной мутации — 49±1,24. Такое отсутствие повышения количества Т-хелперов может быть связано с недостаточностью иммунного ответа на описторхозную инвазию у пациентов с наличием минорного аллеля. Ген VDR кодирует белок-рецептор витамина D, способный изменять экспрессию генов, вовлеченных как в гомеостаз кальция, так и в иммунный ответ [13]. Ферменты, метаболизирующие витамин D, и рецепторы к витамину D присутствуют во многих типах клеток, включая иммунные (антигенпрезентирующие клетки, Т-клетки, В-клетки и моноциты) [25]. Витамин D влияет как на врожденный, так и на адаптивный иммунитет, участвует в клеточной пролиферации и дифференцировке [5, 14], усиливает противомикробное действие макрофагов и моноцитов, повышает фагоцитарную функцию иммунных клеток, увеличивает продукцию IL-10, ингибирует цитокины IL-2 и IL-17 [20]. Применение высоких доз кальцитриола у здоровых людей приводит к значительному снижению уровня провоспалительного цитокина — IL-6 [14]. Количество VDR на CD3⁺CD4⁺ лимфоцитах коррелирует со степенью их дифференцировки, что говорит о потенциальной восприимчивости T-хелперов к витамину D [9] и может быть связано с изменением их реакции на описторхозную инвазию при наличии исследуемой мутации.

У пациентов с хронической описторхозной инвазией при наличии полиморфизма rs1800012 гена COL1A1 обнаружены отличия от группы без мутации по нескольким показателям (табл. 1).

Таблица 1. Иммунологические показатели у пациентов с хроническим описторхозом в зависимости от наличия или отсутствия минорного аллеля rs1800012 гена COL1 A1

Table 1. Immunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis, depending on the presence or absence of a minor allele rs1800012 of the gene COL1 A1

Показатели

Indicators

Наличие минорного аллеля, n = 4

Presence of a minor allele, n = 4

M±m/Me (Q₂₅–Q₇₅)

Отсутствие минорного аллеля n = 18

Absence of a minor allele, n = 18

M±m/Me (Q₂₅–Q₇₅)

НСТ, %

NBT, %

11,5±1,85

22,44±2,09

0,002

Т-test

НСТ ст., %

NBT st., %

34,25±2,25

44,06±2,05

0,03

Т-test

Лимфоциты, кл/мкл

Lymphocytes, cells/μl

2122±120,54

1721±66,5

0,03

Т-test

В реакциях врожденного иммунитета наблюдается достоверное снижение образования активных форм кислорода нейтрофилами в спонтанном НСТ-тесте 11,50±1,85% по сравнению с лицами без данной мутации — 22,44±2,09%, а также меньшие значения показателя стимулированного НСТ-теста — 34,25±2,25 против 44,06±2,05% соответственно. При этом в группе с наличием мутантного аллеля показатели находятся в пределах границ физиологической нормы, в отличие от группы без мутации, где регистрируется их более выраженная реакция на описторхозную инвазию. Сохранение нормальной реакции нейтрофилов у больных описторхозом с наличием минорного аллеля свидетельствует о менее выраженной реакции на антиген, а также о сохранении высокого бактерицидного потенциала этих клеток. У больных с мутантным аллелем обнаружено достоверно более высокое абсолютное количество лимфоцитов 2122±120,54 кл/мкл, чем в группе без мутации 1721±66,5 кл/мкл. Таким образом, мутация в гене коллагена I типа, влияющая на структурно-функциональные характеристики самого распространенного протеина костного матрикса и способствующая развитию остеопороза [1, 7], способна модифицировать иммунную реакцию на описторхозную инвазию, снижая реакции врожденного иммунитета.

У больных ХО при наличии мутации rs3736228 гена LRP5 выявлены изменения в показателях врожденного иммунитета (табл. 2).

Таблица 2. Иммунологические показатели у пациентов с хроническим описторхозом в зависимости от наличия или отсутствия минорного аллеля rs3736228 гена LRP5

Table 2. Immunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis with or without minor allele rs3736228 of the LRP5 gene

Показатели

Indicators

Наличие минорного аллеля, n = 7

Presence of a minor allele, n = 7

M±m

Отсутствие минорного аллеля, n = 15

Absence of a minor allele, n = 15

M±m

МП, у.е.

MP, с.u.

482±87,01

797±111

0,04

Т-test

ФАН, %

PAN, %

85,17±1,01

76,13±1,94

0,01

Т-test

При наличии минорного аллеля достоверно ниже уровень фермента нейтрофилов миелопероксидазы (482±87 у.е.) по сравнению с уровнем миелопероксидазы у пациентов без минорного аллеля (797±111 у.е.), что можно оценивать как протективное влияние мутации, так как в ответ на описторхозную инвазию резко повышается активность миелопероксидазы, а этот фермент, будучи сильным окислителем, способен вызвать повреждение окружающих тканей макроорганизма. Обнаружен более высокий процент фагоцитарной активности нейтрофилов — 85,17±1,01 против 76±1,94%, что говорит об большей активации показателей неспецифической резистентности организма в исследуемой группе больных ХО по сравнению с больными ХО без мутации.

LRP5 — трансмембранный рецептор липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), который служит корецептором Wnt сигнального пути и играет ключевую роль в пролиферации и дифференциации различных клеток [8, 12]. Полиморфные варианты рецептора к ЛПНП зависят от нарушения передачи сигналов системой Wnt и тем самым влияют на метаболизм остеобластов во время остеогенеза, связаны с минеральной плотностью кости и с предрасположенностью к остеопорозу [19, 23, 24]. ЛПНП принимают участие в иммунном ответе, связанном с процессами воспаления и зависящем от воздействия провоспалительных цитокинов, фактора некроза опухоли, IL-1b и IL-6 [3]. Полиморфизм rs3736228 гена LRP5, как и полиморфизмы других участников Wnt-сигнального пути, ассоциирован с состояниями иммунной системы, обеспечивающими самоподдерживающееся воспаление [21], что может объяснять выявленные изменения в реакциях врожденного иммунитета у больных ХО при наличии исследуемой мутации LRP5.

У пациентов с ХО — носителей минорного аллеля rs2234693 гена ESR1 достоверно выше показатель стимулированного НСТ-теста (42,86±2,32%), чем у пациентов без мутации (34,63±3,2%), а также концентрация IgG — 20,95 (IQR 13–25) мг/мл против 10,05 (IQR 8–14) мг/мл (табл. 3). Следовательно, у пациентов с наличием полиморфизма rs2234693 гена эстрогенового рецептора выявляется более высокий бактерицидный потенциал нейтрофилов, а также более выраженная активация гуморального иммунного ответа, чем у больных ХО без мутации.

Таблица 3. Иммунологические показатели у пациентов с хроническим описторхозом в зависимости от наличия или отсутствия минорного аллеля rs2234693 гена ESR1

Table 3. Immunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis with or without minor allele rs2234693 of the ESR1 gene

Показатели

Indicators

Наличие минорного аллеля, n = 14

Presence of a minor allele n = 14

M±m/Me (Q₂₅–Q₇₅)

Отсутствие минорного аллеля, n = 8

Absence of a minor allele n = 8

M±m/Me (Q₂₅–Q₇₅)

НBТ ст., %

NTT st., %

42,86±2,32

34,63±3,2

0,04

Т-test

IgG, мг/мл

IgG, mg/ml

20,95 (IQR 13–25)

10,05 (IQR 8–14)

0,04

U-test

Полиморфизмы генов эстрогеновых рецепторов ассоциированы с минеральной плотностью костной ткани, костным ремоделированием и переломами костей [6]. Женские половые гормоны подавляют синтез факторов дифференцировки и активности остеокластов, стимулируют синтез остеопротегерина, подавляющего активность остеокластов и способствующего их апоптозу, а также TGF-β, который увеличивает продолжительность существования остеобластов за счет снижения их апоптоза [10]. Наряду с влиянием на костную ткань и участием в развитии остеопороза известно существенное влияние эстрогенов на иммунную систему: рецепторы эстрогена обнаружены во многих типах иммунных клеток, включая B- и Т-лимфоциты, дендритные и NK-клетки. Эстрогены влияют на реакции врожденного иммунитета — стимулируют синтез так называемых молекул адгезии (благодаря которым лимфоциты могут закрепиться в очаге повреждения), повышают уровень Т-хелперов и снижают содержание Т- супрессоров, активируют В-систему иммунитета, что приводит к повышению содержания антител [18]. Синтез цитокинов (TNFα, IL-1, IL-6) макрофагами регулируется эстрогенами, в частности, путем модуляции экспрессии CD16 [22]. Возможно поэтому в настоящем исследовании удалось выявить изменения иммунологических показателей врожденного и гуморального иммунитета у больных ХО с наличием минорного аллеля rs2234693 гена ESR1.

При наличии мутаций rs9340799 гена ESR1 и rs4988235 гена LCT у обследованных с хроническим описторхозом не выявлено достоверных отличий в исследованных показателях иммунной системы от лиц без данных мутаций.

Заключение

Анализ иммунологических показателей и молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с повышенным риском возникновения остеопороза, у больных хроническим описторхозом выявил отличия в функционировании иммунной системы у лиц с наличием мутаций от пациентов, у которых исследуемые мутации не обнаружены.

Полученные результаты показывают, что мутации генов COL1 A1, LRP5, ESR1 (rs2234693) при хроническом описторхозе оказывают влияние как на неспецифические врожденные реакции иммунной системы, так и на адаптивное звено иммунитета.

Мутация гена VDR у пациентов с ХО приводит к изменениям только адаптивного иммунного ответа. Наличие минорного аллеля полиморфизма rs1544410 гена, кодирующего внутриклеточный рецептор витамина D, препятствует повышению содержания Т-хелперов в периферической крови при описторхозной инвазии.

Обнаружено, что мутация rs1800012 гена COL1A1 модифицирует врожденныый иммунный ответ на описторхозную инвазию — отсутствие активности кислородзависимой бактерицидности нейтрофилов.

Показано модифицирующее влияние полиморфизма rs3736228 гена LRP5 на реакции врожденного иммунитета: при наличии минорного аллеля, меняющем проведение сигналов Wnt-пути, наблюдается усиление фагоцитарной способности нетрофилов и предотвращение активации фермента миелопероксидазы.

В нашем исследовании среди полиморфизмов гена ESR1 только rs2234693 оказался связан с повышением бактерицидного потенциала нейтрофилов и гуморального иммунного ответа на описторхозную инвазию.

Часть выявленных нами отличий в функционировании компонентов иммунной системы в группах с минорным аллелем могут рассматриваться как компенсирующие нарушения, вызванные описторхозной инвазией (например, активность миелопероксидазы нейтрофилов при наличии мутации rs 3736228 гена LRP5), а часть — как усугубляющие их. Анализ результатов позволяет предполагать, что наличие исследованных мутаций в генах VDR, COL1 A1, LRP5, ESR1 (rs2234693) оказывает влияние на иммунологические показатели описторхозной инвазии и проявления особенностей иммунного ответа у больных хроническим описторхозом.