Virus neutralizing antibodies in pseudovirus particle neutralization reaction as a bioanalytical part of a Salnavac® vaccine clinical trial

Full Text

Введение

За последние два десятилетия в мире было зафиксировано несколько крупных вспышек инфекционных заболеваний, обусловленных представителями семейства Coronaviridae, а именно коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) и коронавирусом ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) [14, 18]. Однако одним из главных событий последних нескольких лет стала объявленная ВОЗ в марте 2020 г. пандемия новой коронавирусной инфекции, вызванная еще одним вариантом коронавируса — SARS-CoV-2 [19]. Впервые появившаяся в китайском городе Ухань в декабре 2019 г. [17], эта инфекция вследствие высокой контагиозности и воздушно-капельного пути передачи быстро распространилась по всему земному шару.

ВОЗ координирует группу экспертов по разработке вакцины против COVID-19. Так, на сегодняшний день в разработке находится 366 вакцин, из них 169 препаратов проходят клинические испытания и 198 — доклиническую разработку [20].

Разработка мукозальных вакцин является многообещающим направлением профилактики SARS-CoV-2. Слизистые оболочки дыхательных путей являются входными воротами возбудителя COVID-19, поэтому индукция иммунитета слизистых оболочек представляется целесообразной. В то же время использование мукозальных вакцин приводит в числе прочего к индукции системного иммунного ответа [2, 4]. Кроме того, использование интраназальных форм препаратов менее травматично и требует меньшего участия медицинского персонала.

Компанией АО «ГЕНЕРИУМ» разработана новая форма выпуска на основе ранее одобренной вакцины Гам-КОВИД-Вак^® с интраназальным путем введения, который в настоящее время проходит сравнительное клиническое исследование VCI-COV-III.

Наличие в крови вируснейтрализующих антител против SARS-CoV-2 является важным показателем защитного иммунитета, сформированного вакциной. Поэтому для доклинических (ДоКИ) и клинических исследований (КИ) вакцин необходимы методы надежного, чувствительного и быстрого обнаружения ВНА против SARS-CoV-2. Классический метод определения титра ВНА, основанный на снижении количества вирусных бляшек в монослое культуры клеток (plaque reduction neutralization test, PRNT), требует работы с инфекционным, высокопатогенным живым аутентичным вирусом SARS-CoV-2 в условиях изолированной лаборатории с уровнем защиты 3–4 (в отечественной системе санитарного законодательства 1–2 группа патогенности) [1]. Таких лабораторий в РФ крайне мало, риск работы с образцами для оператора высокий, тесты трудоемкие, высокозатратные и не могут быть использованы в качестве биоаналитического этапа рутинного контроля образцов ДоКИ и КИ. Модификацией этого метода является реакция микронейтрализации, где подсчитываются уже не бляшки, а отдельные инфицированные клетки, выявляемые иммуноцитохимическим способом (microneutralization assay, MNA). Однако эти подходы также отнимают много времени и требуют работы в лабораториях с высоким уровнем биобезопасности. Разумной альтернативой аутентичному вирусу является использование псевдовирусных частиц со сниженной патогенностью, которые представляют собой неспособные к репликации частицы, содержащие структурное и ферментативное ядро одного вируса, такого как вирус везикулярного стоматита (VSV) или лентивирус (ВИЧ), и поверхностные белки другого вируса, такого как S-белок вируса SARS-CoV-2. Для определения инфекции псевдовирусы кодируют репортерный белок, такой как люцифераза светлячка (Fluc) или зеленый флуоресцентный белок (GFP) [5]. Из этого следует, что такой метод можно проводить в обычных лабораториях невысокого класса защиты, имеющих лицензию на работe с 3–4 группами патогенности или без нее. Следует отметить, что несмотря на привлекательность метода на основе псевдотипированных вирусов, необходима разносторонняя валидация, поскольку на результат реакции на вируснейтрализацию могут влиять многие параметры, такие как: оптимальная концентрация вирусных частиц (выражаемая в единицах трансдукции, ТЕ) в применяемых для трансдукции клеток рабочих растворах, доля «пустых» и «упакованных» лентивирусных частиц, наличие технологических загрязнений, происхождение клеток для инфекции, время совместной инкубации вируса и сыворотки, состав питательной среды/добавок и другие параметры, вносящие вклад в гетерогенность результатов и общую неопределенность методики [13]. В рамках настоящей работы проведена валидация разработанного ранее метода определения ВНА вируса для целей высокопроизводительного анализа образцов сыворотки вакцинированных добровольцев клинического исследования VCI-COV-III.

Материалы и методы

Данные клинического исследования

Дизайн клинического исследования. Клиническое исследование, в ходе которого проводился отбор биообразцов для анализа, являлось рандомизированным двойным слепым многоцентровым исследованием 3 фазы, проводимым с целью оценки иммуногенности интраназальной и внутримышечной форм комбинированной векторной вакцины против COVID-19, индуцированного SARS-CoV-2, в дизайне «double-dummy» для «заслепления» способа введения препарата. В целях обеспечения возможности коррекции общего размера выборки в ходе исследования по данным на 42 день после вакцинации был выбран групповой последовательный дизайн исследования (group sequential design). Протокол исследования одобрен Минздравом России (МЗ России) (№ 869 от 20.12.2021) и независимыми локальными этическими комитетами клинических центров. Исследование проводится в соответствии с требованиями Надлежащей Клинической Практики и Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации пересмотра 2013 г. Исследование состоит из следующих периодов: скрининг до 7 дней, иммунизация компонентом I (день 1) и компонентом II (день 21) исследуемых продуктов (ИП), период наблюдения I (до 42 дней) и период наблюдения II (до 365 дней). На сегодняшний день доступны результаты промежуточного анализа данных на 42 день наблюдения. Исследование продолжается.

Критерии отбора добровольцев. Включение добровольцев проводится в 16 клинических центрах на базе медицинских учреждений Российской Федерации.

Критерии включения: возраст 18–60 лет; индекс массы тела (ИМТ) 18,5 ≤ ИМТ ≤ 29,9 кг/м²; отсутствие существенных отклонений при лабораторных, инструментальных и физикальных исследованиях; уровень исходных анти-RBD IgG антител к SARS-CoV-2 не выше 100 BAU/мл; согласие на использование эффективных методов контрацепции; отсутствие острого инфекционного или неинфекционного заболевания и отсутствие обострения хронического заболевания за 14 дней до иммунизации; отрицательный анализ мочи на запрещенные препараты; отрицательный тест на алкоголь в выдыхаемом воздухе и отсутствие каких-либо злокачественных новообразований.

Критерии исключения: любая вакцинация в течение 30 дней до включения с ограничением вакцинации против SARS-CoV-2 в течение 6 месяцев до включения в исследование; COVID-19 в анамнезе в течение 6 месяцев до включения; положительный тест на SARS-CoV-2 на скрининге; положительный IgM к SARS-CoV-2 или SARS-CoV-2 анти-RBD IgG более 100 BAU/мл; контакт с больными COVID-19 в течение предшествующих включению 14 дней; стероидные препараты (кроме контрацептивов), иммуноглобулины и/или другие компоненты крови за 30 дней до рандомизации; затруднение носового дыхания; злоупотребление наркотическими препаратами; регулярное применение антиконгестантов; использование иммунодепрессантов, завершившееся менее чем за 3 месяца до рандомизации; положительный тест на беременность; положительный результат диагностики ВИЧ, гепатит В или С; наличие в анамнезе аллергических заболеваний любого генеза; систолическое артериальное давление < 100 или > 130 мм рт. ст. или диастолическое артериальное давление < 60 или > 90 мм рт. ст.; частота сердечных сокращений < 60 или > 100 ударов в минуту; наличие в анамнезе аутоиммунных заболеваний у добровольцев и у их родственников 1–2 степени родства; употребление алкоголя выше уровня низкого риска; госпитализация и/или хирургическое вмешательство во время исследования и до 4 недель до введения исследуемых препаратов; сопутствующие заболевания, влияющие на результаты исследования. Все добровольцы предоставили подписанное информированное согласие перед включением в исследование.

Исследуемые препараты. Салнавак^® представляет собой формат интраназального введения ранее одобренной к применению вакцины Гам-КОВИД-Вак^® и состоит из двух компонентов рекомбинантных вирусных частиц на основе аденовирусов человека серотипа 26 (компонент I) и 5 (компонент II), несущих ген S-белка вируса SARS-CoV-2. Полная доза обеих вакцин составляет 10¹¹ вирусных частиц на дозу для каждого рекомбинантного аденовируса или 0,5 мл на дозу для внутримышечной/интраназальной инъекции. Плацебо состоит из буферной композиции, равной объему вакцины. Исследуемые препараты и плацебо вводили внутримышечно или интраназально в соответствии со схемой рандомизации.

Рандомизация и маскировка. После подтверждения критериев отбора все добровольцы были распределены с использованием системы IWRS методом блоковой рандомизации (блоки переменного размера 4 или 6) в соотношении 1:1 в две группы: группа 1 получала Салнавак^® путем интраназального введения и плацебо путем внутримышечной инъекции; группа 2 получала Гам-Ковид-Вак^® внутримышечно и плацебо интраназально^. Препараты и плацебо внешне неотличимы по упаковке, этикетке и содержимому. Групповое распределение добровольцев было замаскировано для исследователей, добровольцев и всего исследовательского персонала (двойной слепой формат). В соответствии с протоколом исследования снятие маскировки данных проведено с целью подготовки промежуточного отчета в минимальном объеме, достаточном и необходимом для проведения анализа данных.

Процедуры. Помимо прочих стандартных методов обследования, предусмотренных протоколом, для всех участников был произведен отбор биообразцов для оценки титра ВНА к SARS-CoV-2 и анти-RBD IgG в день 1 (до введения компонента I), день 21 (до введения компонента II) и день 42 с целью анализа гуморального иммунитета. Клинико-лабораторные данные были собраны с использованием электронной платформы EDC.

Переменные интереса исследования. Первичной переменной интереса является иммунологическая эффективность вакцины Салнавак^® относительно вакцины Гам-КОВИД-Вак^®, выраженная в соотношении средних геометрических титров ВНА против SARS-CoV-2 на 42-й день. Титр RBD-специфичного IgG против SARS-CoV-2 на 42-й день является одной из вторичных переменных.

Данные лабораторного исследования

Методика определения ВНА против SARS-CoV-2 была разработана и описана компанией ООО «ИМГЕН+» [7].

Получение и очистка лентивирусных частиц, псевдотипированных S-белком SARS-CoV-2 (штамм Wuhan-Hu-1). Псевдовирусы получали путем котрансфекции клеток НЕК293Т плазмидами PLV-Fluc, psPAX2 и pCAGGS-S∆19, кодирующими соответственно векторную кассету, белки Gag, Pol и Rev вируса HIV-1 и S-белок вируса SARS-CoV-2 штамма Wuhan-Hu-1 без 19 С-терминальных аминокислотных остатков [7]. За день до трансфекции клетки НЕК293Т высевали с плотностью 200 000 клеток/мл в чашки для культивирования площадью 150 мм² и культивировали в инкубаторе с СО₂. Через 24 ч клетки трансфицировали плазмидами PLV-Fluc, psPAX2 и pCAGGS-S∆19 кальций-фосфатным методом. На одну трансфекцию использовали 70 мкг смеси плазмид (при соотношении PLV-Fluc : psPAX2 : pCAGGS-S∆19 = 3 : 2 : 2). Для получения осадка 372 мкл 2М CaCl₂ добавляли в стерильную коническую пробирку, содержащую 1098 мкл смеси плазмид в воде. Затем смесь плазмиды/кальций хлорид добавляли по каплям к равному объему фосфатно-солевого буфера HEPES (50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na₂HPO₄, 280 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 12 мМ сахарозы), рН 7,15 при постоянном встряхивании. Сразу после перемешивания осадок кальций-фосфат/ДНК переносили в клетки и оставляли на 7–8 часов. После промывания PBS культуральную среду заменяли средой Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), содержащей 2,5% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки. Через 68–72 ч после трансфекции культуральную среду, содержащую псевдовирусные частицы, собирали в конические пробирки объемом 50 мл, центрифугировали в течение 10 мин при 4500g для удаления клеток и крупного клеточного детрита и фильтровали с использованием системы вакуумной фильтрации PES 0,45 мкм. Затем полученный супернатант концентрировали с помощью модуля Vivaflow-50 100K (Sartorius, Германия) до 10-кратного уменьшения объема. Затем концентрированную среду наслаивали на 20% раствор сахарозы и центрифугировали в центрифуге Avanti J-30 (Beckman Coulter, США) при 24 000g в течение 90 мин с использованием ротора JS-24. Осадок псевдовируса ресуспендировали в среде Opti-MEM, содержащей 2,5% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, и аликвоты помещали в криопробирки. После шоковой заморозки вирусные частицы хранили в парах жидкого азота.

Частицы псевдовируса титровали на полученных ранее клетках HEK 293T-hACE2, стабильно экспрессирующих рецептор SARS-CoV-2 — человеческий ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) [7].

Подготовка образцов сыворотки добровольцев. Обезличенные образцы сыворотки добровольцев инактивировали на водяной бане при температуре (56±2)°С в течение 30 мин с целью истощения компонентов системы комплемента. Образцы инактивированной сыворотки использовали сразу или замораживали для последующего анализа. Образцы сыворотки с признаками гемолиза или бактериальной контаминации для анализа не использовались.

Анализ нейтрализации вируса. Клетки HEK 293T-hACE2 добавляли в лунки белых 96-луночных планшетов (Corning-3916 или Thermofisher 136101), по 15 000 клеток в 100 мкл среды на лунку.

Далее в лунки 96-луночного планшета с U-образным дном вносили двукратные разведения образцов сыворотки в среде Opti-MEM, начиная с разведения 1:10 и до 1:1280 в объеме 80 мкл. Для конкретных анализов использовались другие коэффициенты разбавления, как указано в тексте. Суспензию вирусных частиц в среде Opti-MEM 2,5% FBS добавляли во все лунки (10 000 ТЕ на лунку в 80 мкл среды), кроме лунок, служивших отрицательным контролем. После этого содержимое лунок перемешивали многоканальной пипеткой, затем планшет закрывали и инкубировали 30 мин в СО₂-инкубаторе при 37°С.

Затем содержимое U-образных чашек переносили в белые культуральные чашки, содержащие клетки HEK 293T-hACE2. Среду для выращивания предварительно осторожно удаляли из белых 96-луночных планшетов, не нарушая прикрепленных клеток. Затем белые планшеты оставляли в инкубаторе с СО₂ на 36–48 ч при 37°С и 5% СО₂.

Далее питательную среду отсасывали и в каждую лунку добавляли по 40 мкл раствора PBS, а затем — предварительно нагретый до 25°С реагент OneGlo (Promega), содержащий субстрат для люциферазы, и планшеты инкубировали в течение 60–75 мин при комнатной температуре (20–25°С) в темноте на орбитальном шейкере. После этого измеряли люминесценцию с помощью люминометра Luminoskan Microplate (Thermo Fisher Scientific, США). За 100%-ную нейтрализацию принимали среднее значение люминесценции, полученное в лунках с добавленным нейтрализующим антителом iB20, описанным ранее [7]. За 0% нейтрализации принимали среднее значение люминесценции, полученное в лунках без добавления сыворотки. Среднее значение люминесценции, полученное в лунках без добавления вирусных частиц, принимали за фоновое значение. Расчет ID₅₀ (расчетное значение, составляющее разведение сыворотки, необходимое для 50% нейтрализации вируса) был проведен с помощью анализа нелинейной регрессии в пакете GraphPad Prism.

Анализы, выполненные в рамках валидации метода. Чувствительность/специфичность — для определения этих параметров была измерена нейтрализующая активность 24 образцов сыворотки выздоравливающих/вакцинированных пациентов с подтвержденными ИФА антителами к S-белку SARS-CoV-2. Отрицательными пробами являлись замороженные до начала 2020 г. архивные образцы сывороток от доноров, постоянно проживающих в РФ.

Воспроизводимость — уровни ID₅₀ у серопозитивных доноров исследовали в течение 6 аналитических циклов.

Прецизионность внутри планшета — исследовали вариабельность измерения ID₅₀ в пределах одного планшета, измеренного для одного образца сыворотки.

Внутрилабораторная прецизионность — значения ID₅₀ были измерены для одного и того же образца сыворотки при настройке реакции разными операторами в один и тот же день или одним и тем же оператором в разные дни.

Устойчивость (робастность) — значения ID₅₀ были измерены для одного и того же образца сыворотки с использованием различных партий вирусных частиц.

Линейность — изменение уровня ID₅₀, измеренного для серийных разведений контрольной сыворотки. В качестве меры линейности мы рассматривали коэффициент R2, полученный путем линейной регрессии значений log₂ (коэффициент разбавления) в зависимости от log₂ (ID₅₀), как меру линейности.

По всем перечисленным выше параметрам были достигнуты приемлемые значения, позволяющие признать данную методику валидированной. Подробный протокол валидации и полученные результаты будут опубликованы отдельно.

Статистический анализ

Для проведения статистического анализа был использован язык программирования статистических расчетов R версии 4.1.2.

В анализ были включены данные без значимых отклонений от протокола исследования. Все сравнения добровольцев между группами препаратов проводились с помощью двусторонних критериев (кроме анализа первичной конечной точки с помощью одностороннего критерия).

При сравнении исходных характеристик добровольцев использовался t-критерий Стьюдента для независимых выборок или критерий Манна–Уитни, в зависимости от вида распределения добровольцев по значениям этих переменных. Для сравнений групп добровольцев по полу использовался критерий χ².

Так как все переменные, проанализированные в рамках промежуточного анализа, будут повторно анализироваться и сравниваться между группами в рамках финального анализа всего объема данных за период со скрининга до дня 42, все сравнения между добровольцами в группах по препаратам корректировались поправками на множественные сравнения. При сравнениях групп добровольцев по исходным характеристикам, титру ВНА на день 21 и день 42, титру RBD на день 1, день 21 и день 42, а также при сравнениях по титру ВНА и титру RBD в динамике нулевая гипотеза об отсутствии различий между группами/визитами отвергалась и принималась альтернативная гипотеза о наличии различий между группами/визитами при уровне p < 0,000001.

Анализ первичной конечной точки проводился на логарифмированных данных титра ВНА. Тестирование гипотез по первичной конечной точке проводилось с помощью одностороннего t-критерия Стьюдента для независимых выборок при уровне ошибки I рода (α) = 0,0000005. При превышении разницей средних титра ВНА границы доказательства эффективности в 1,042 планировалось принять утверждение о не меньшей иммунологической эффективности интраназальной вакцины Салнавак^® по сравнению с вакциной Гам-КОВИД-Вак^® по разнице средних титров ВНА.

Сравнение добровольцев в группах препаратов по значениям титра RBD на 42 день исследования выполнялось с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок на логарифмированных данных.

Динамика титров ВНА и RBD со дня 1 до дня 42 исследования оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента для зависимых выборок на логарифмированных данных, уровни значимости корректировались поправкой Холма для множественных сравнений.

Анализ корреляций между титром ВНА и титром анти-RBD IgG-антител проводился с помощью коэффициента Спирмена. Для трактовки силы корреляций использовалась следующая шкала: 0 < |r| < 0,3 — слабая корреляция; 0,3 ≤ |r| < 0,9 — умеренная корреляция; |r| ≥ 0,9 — сильная корреляция.

Надзор за исследованием

Исследование проведено спонсором (ОАО «ГЕНЕРИУМ») в соответствии с одобренным протоколом исследования, согласовано с исследователями и авторами публикации. Сбор данных проводился исследователями с верификацией данных персоналом спонсора с использованием продукции ENNOV CLINICAL S.A.S. Статистический и медицинский анализ данных, а также подготовка промежуточного отчета об исследовании были выполнены спонсором. Спонсор гарантирует полноту и точность данных и проведенного анализа и подтверждает, что публикация соответствует протоколу и другим документам исследования. Все авторы имели доступ к данным исследования, рукописи и одобрили окончательный вариант настоящей статьи.

Результаты

Профиль исследования. На момент проведения промежуточного анализа в исследование было скринировано 703 добровольца, 138 из которых (19,63%) соответствовали всем критериям включения/невключения и были рандомизированы в две группы вакцинопрофилактики. Один из рандомизированных добровольцев отозвал информированное согласие до введения Компонента I вакцины, что было расценено как ошибка рандомизации. Полную анализируемую совокупность (Full Analysis Set, FAS) составило 137 добровольцев. Из 137 рандомизированных добровольцев 19 пациентов были исключены из популяции «по протоколу» (Per Protocol, PP), и их данные не учитывались при анализе иммуногенности. Среди причин исключения из анализа были заболевание COVID-19 (для 7 добровольцев) и значимые отклонения от протокола с воздействием на результаты исследования (для 12 добровольцев) (рис. 1).

 

Рисунок 1. Распределение добровольцев в исследовании

Figure 1. Distribution of volunteers in the trial

 

Исходные характеристики добровольцев. Добровольцы в сравниваемых группах не отличались между собой по исходным характеристикам (полученные для всех показателей уровни p больше уровня, заданного для сравнения между группами по демографическим и исходным характеристикам на промежуточном этапе — p < 0,000001) (табл.).

 

Таблица. Исходные характеристики добровольцев. Популяция FAS

Table. Baseline characteristics of volunteers. FAS population

Параметр Parameter	Салнавак® Salnavac® (N = 68)	Гам-КОВИД-Вак® Gam-COVID-Vac® (N = 69)	Уровень p (критерий) p-value (criteria)
Женский пол, n (%) Female, n (%)	31 (45,6)	31 (44,9)	1 χ2
Мужской пол, n (%) Male, n (%)	37 (54,4)	38 (55,1)
Возраст, годы (среднее [CO]) Age, years (mean [SD])	34,43 (8,99)	36,25 (9,18)	0,24 t-критерий Стьюдента Student’s t-test
САД, мм рт.ст. (медиана [МКР]) SAP, mmHg (median [IQR])	118 (110; 124,25)	120 (112; 125)	0,31 Манна–Уитни Mann-Whitney
ДАД, мм рт.ст. (медиана [МКР]) DAP, mmHg (median [IQR])	75 (70; 80)	75 (68; 80)	0,38 Манна-Уитни Mann–Whitney
ЧСС, уд./мин (медиана [МКР]) HR, bpm (median [IQR])	71,5 (67; 79,25)	69 (68; 76)	0,14 Манна–Уитни Mann–Whitney
ЧДД, в мин (медиана [МКР]) RR, in min (median [IQR])	16 (16;17)	16 (16; 17)	0,80 Манна–Уитни Mann–Whitney
Температура тела, °C (медиана [МКР]) Body temperature, °C (median [IQR])	36,5 (36,4; 36,6)	36,5 (36,4; 36,6)	0,94 Манна–Уитни Mann–Whitney

Примечание. Описательные статистики пола представлены в виде частот (n) и долей в процентах (%), возраста — в виде среднего и стандартного отклонения (СО), жизненно важных показателей (систолического артериального давления — САД, диастолического артериального давления — ДАД, частоты сердечных сокращений — ЧСС, частоты дыхательных движений — ЧДД и температуры тела) — в виде медианы и межквартильного размаха (МКР) в виде 25%–75% квартилей.

Note. Gender-related descriptive statistics is presented as frequencies (n) and percentages (%), age — as mean and standard deviation (SD), vital signs (systolic blood pressure — SBP, diastolic blood pressure — DBP, heart rate — HR). contractions — heart rate, respiratory rate — RR and body temperature) — as a median and interquartile range (IQR) in the form of 25%–75% quartiles.

 

Оценка иммуногенности. В группе препарата Салнавак^® титр ВНА — геометрическое среднее значение (геометрическое стандартное отклонение) — составил в день 1 76,7±3,36. Ко дню 21 исследования титр ВНА в группе препарата Салнавак^® возрос в 3,2 раза от исходного уровня — до 243,85±3,33¹ — и далее, до дня 42, оставался стабильным²; титр ВНА на день 42 составил 238,34±3,23. С момента начала исследования (день 1) до дня 42 титр ВНА в группе Салнавак^® увеличился в 3,1 раза¹ (рис. 2).

В группе Гам-КОВИД-Вак^® титр ВНА в день 1 составил 43,35±4,27 и ко дню 21 увеличился до 526,5±3,76 — в 12,1 раза от исходного. Ко дню 42 статистически значимые изменения титра ВНА относительно дня 21 отсутствовали: титр на 42 день составил 616,94±3,73². В целом за время, прошедшее с начала исследования, титр ВНА в группе Гам-КОВИД-Вак^® увеличился в 14,2 раза¹ (рис. 2).

 

Рисунок 2. Геометрические средние титра ВНА с указанием стандартного отклонения в группах добровольцев, получавших препарат Салнавак® и Гам-КОВИД-Вак® 

Figure 2. Geometric mean VNA titers and standard deviation in groups of volunteers treated with Salnavac^® and Gam-COVID-Vac^®

Примечание. ВНА — вируснейтрализующие антитела; на оси Y представлены геометрическое среднее и стандартное отклонение; * в соответствии с опубликованными данными изучения вакцины mRNA-1273 (Moderna) [14].

Note. VNA — virus-neutralizing antibodies; Y-axis: geometric mean and standard deviation; *the data according published for mRNA-1273 vaccine study (Moderna) [14].

 

Титр ВНА на 42 день на логарифмированных данных составил 5,47 и 6,42 в группах Салнавак^® и Гам-КОВИД-Вак^® соответственно. Межгрупповая разница средних геометрических титров ВНА на 42 день исследования составила –0,95 (нижняя граница 99,9% ДИ для разницы титров ВНА –2,16). Полученный уровень p для сравнения p = 0,99 был больше, и величина эффекта, равная –0,95, была меньше уровней, заданных для доказательства не меньшей иммуногенности вакцины Салнавак^® по сравнению с вакциной Гам-КОВИД-Вак^®. Отношение геометрических средних титра ВНА на 42 день исследования составило 0,39 с нижней границей 99,99% ДИ, равной 0,12.

Титр уровня RBD в группе Салнавак^® составил 15,23±4,74 BAU/мл в день 1. Ко дню 21 он увеличился в 5,6 раза по сравнению с днем 1 — до 85,32±7,91 BAU/мл¹. На день 42 титр RBD составил 131,22±3,91 BAU/мл, значимо не изменившись относительно дня 21². В целом за время исследования в группе Салнавак^® титр RBD возрос в 8,6 раза¹ (рис. 3).

 

Рисунок 3. Концентрации анти-RBD-IgG с указанием стандартного отклонения в группах добровольцев, получавших препарат Салнавак® и Гам-КОВИД-Вак®

Figure 3. Anti-RBD-IgG concentrations and standard deviation in groups of volunteers treated with Salnavac^® and Gam-COVID-Vac^®

 

В группе Гам-КОВИД-Вак^® титр RBD в день 1 составил 14,21±4,22 BAU/мл, далее увеличившись до 490,76±4,66 BAU/мл — в 34,5 раза¹. Ко дню 42 статистически значимые изменения титра RBD относительно дня 21 отсутствовали, титр RBD составил 782,03±3,04 BAU/мл². В целом титр RBD в группе Гам-КОВИД-Вак^® со дня 1 до дня 42 увеличился в 55 раз¹ (рис. 3).

Отношение геометрических средних титра RBD на 42 день исследования составило 0,17 [99,99% ДИ 0,05; 0,56] (p < 0,001) (рис. 3). Средний титр RBD в группе Салнавак^® был ниже, чем в группе Гам-КОВИД-Вак^® в 6 раз¹.

Проведенный корреляционный анализ титра ВНА и анти-RBD IgG обнаружил прямую умеренную корреляцию показателей на 21 день (r = 0,78, p < 0,001) и на 42 день исследования (r = 0,84, p < 0,001).

Обсуждения и выводы

На сегодняшний день вакцинация является одной из основных мер здравоохранения для борьбы с пандемией COVID-19. Несколько вакцин на разных платформах были разработаны вскоре после появления SARS-CoV-2 в Китае, а чуть позже в зону интересов исследователей попал мукозальный способ проведения иммунопрофилактики. Белок шипа (S) вируса SARS-CoV-2 является целевым иммуногеном в большинстве разработок вакцин [9]. Это связано с тем, что RBD является областью вируса, которая связывается с ангиотензин-превращающим ферментом 2 клетки-хозяина (ACE2). RBD расположен в субъединице S1 белка S, и связывание RBD вируса и клетки-хозяина ACE-2 инициирует проникновение вируса [9]. ВНА, антитела, которые связываются с RBD, могут предотвратить проникновение вируса в клетки-хозяева [11].

В рамках клинического исследования была использована методика, позволяющая определить наличие специфических к антигену SARS-CoV-2 ВНА антител в реакции нейтрализации на культуре клеток НЕК 293-T-hAce2 с применением псевдовирусных частиц в сыворотке крови добровольцев. Были успешно проанализированы все доступные образцы.

В ряде работ была установлена достоверная корреляция титров ВНА, определяемых исходной референтной методикой PRNT, с титрами, определяемыми с использованием псевдотипированного вируса (PNA). Например, в работе Bewley и соавт., коэффициент корреляции Пирсона между PRNT и MNA составил r = 0,0963 (p < 0,001), а между PRNT и PNA была выявлена значительно более сильная корреляция — r = 0,8620 (p < 0,001) [3]. Теоретически это дает возможность сравнивать результаты разных исследований, где титры ВНА измерялись разными методами. При таком сравнении следует учитывать, что если титры PRNT и MNA соотносятся примерно, как 1:1 (что логично, поскольку в обоих случаях используется идентичный вирус дикого типа и та же клеточная линия), то титры, получаемые PNA, примерно в 10 раз ниже титров PRNT, измеренных в том же образце.

В последний год в научном сообществе неоднократно высказывалось мнение о том, что вводимые внутримышечно вакцины, включая самые эффективные мРНК и вирусные векторные вакцины, обеспечивающие хорошую защиту от тяжелого течения COVID-19, мало повлияли на цепочку передачи инфекции, особенно в случае новых штаммов SARS-CoV-2, таких как омикрон. Вместе с тем большие надежды на прерывание передачи инфекции возлагались именно на интраназальные вакцины, которые должны были сформировать в организме вакцинированного, помимо системного гуморального и клеточного иммунитета, барьерную защиту на слизистых оболочках [16]. Интраназальные вакцины, разработанные Bharat Biotech и CanSino Biologics, уже одобрены к применению в Индии и Китае соответственно [15].

Опубликованное клиническое исследование безопасности и иммуногенности вакцины Ad5-nCoV (CanSino Biologics, Китай), вводимой аэрозольно через небулайзер, показало титры ВНА в сыворотке крови, значительно превосходящие таковые при внутримышечном введении цельновирионной инактивированной вакцины CoronaVac. Геометрическое среднее титра ВНА после применения Ad5-nCoV составило 714 (95% ДИ: 479,4–1063,7) при высокой дозе и 744 — на низкой (95% ДИ: 520,1–1065,6), в то время как после применения CoronaVac титр ВНА был равен 78,5 [95% ДИ: 60,5–101,7] [10]. Следует отметить, что Ad5-nCoV — это тоже векторная вакцина, аналогичная второму компоненту Салнавак^®.

В то же время клиническое исследование другой интраназальной вакцины ChAdOx1 (AstraZeneca, Великобритания) не достигло запланированных конечных точек. Антиген-специфические антитела слизистой оболочки сформировались у меньшинства участников и их уровень редко превышал титры, наблюдаемые после заражения SARS-CoV-2. Системные ответы на интраназальную вакцинацию были слабее, чем после внутримышечной вакцинации ChAdOx1. Антиген-специфические антитела слизистой оболочки были обнаружены только у участников, получивших внутримышечную мРНК-вакцину после интраназальной вакцинации. Исследователи сделали вывод, что интраназальное введение ChAdOx1 не индуцировало ни устойчивого ответа антител слизистой оболочки, ни сильного системного ответа. Одной из вероятных причин такого неуспеха авторы считают меньшую способность обезьяньего аденовируса заражать слизистые оболочки человека [12].

Несмотря на показанную в ходе настоящего промежуточного анализа меньшую системную гуморальную иммуногенность интраназальной вакцины Салнавак^® по сравнению с внутримышечной вакциной Гам-КОВИД-Вак^®, было обнаружено наличие высоких титров ВНА и анти-RBD-IgG у добровольцев в обеих группах через 21 и 42 дня после включения в исследование, что подтверждает напряженность иммунного ответа в отношении SARS-CoV-2 после применения вакцины Салнавак^®. В соответствии с опубликованными данными изучения вакцины mRNA-1273 (Moderna, США), титр ВНА (ID₅₀), выявляемый с помощью метода псевдонейтрализации, равный 100 на 57 день исследования, соответствует эффективности вакцинации на уровне 90,7% (95% ДИ: 86,7–93,6) [6].

Учитывая применение сопоставимых методов определения ВНА в клиническом исследовании VCI-COV-III и при изучении препарата mRNA-1273 (Moderna, США), можно сделать предварительное заключение о достаточной протективной активности препарата Салнавак^®.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить всех исследователей и добровольцев, принимающих участие в этом исследовании, сотрудников центральной лаборатории «ИМГЕН+».

¹Уровень p для сравнения между визитами был меньше уровня, установленного для принятия альтернативной гипотезы о наличии различий между визитами p < 0,000001.

² Уровень p был больше уровня, установленного для принятия альтернативной гипотезы о наличии различий между визитами p > 0,000001.

About the authors

Evgeniy V. Zuev

JSC “GENERIUM”

Email: evzuev@generium.ru
ORCID iD: 0000-0001-5519-8358
SPIN-code: 8769-9506

Lead Expert of the Group of Scientific and Medical Expertise and Clinical Development, Department of Scientific Expertise and Pharmacovigilance, Directorate for Clinical Trials and Pharmacovigilance

Россия, Volginsky

Oksana Anatolievna Markova

JSC “GENERIUM”

Email: oamarkova@generium.ru
ORCID iD: 0000-0002-1179-3881

Head of the Department of Scientific Expertise and Pharmacovigilance, Directorate for Clinical Trials and Pharmacovigilance

Россия, Volginsky

Sergey V. Kulemzin

LLC “IMGEN+”

Email: s.kulemzin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4706-623X

PhD (Biology), Researcher

Россия, Novosibirsk

Dmitry A. Poteryaev

JSC “GENERIUM”

Email: poteryaev@ibcgenerium.ru
ORCID iD: 0000-0003-2695-8869

PhD (Biology), Science Adviser

Россия, Volginsky

Natalya A. Litvinova

JSC “GENERIUM”

Email: litvinova@ibcgenerium.ru
ORCID iD: 0000-0003-1430-8105

PhD (Biology), Head of Department of Molecular Diagnostics, Department of Pharmaceutical Analysis

Россия, Volginsky

Ilya A. Korotkevich

JSC “GENERIUM”

Email: iakorotkevich@generium.ru
ORCID iD: 0000-0003-1872-419X

Biostatistician, Group of Biostatistics and Data Management, Department of Scientific Expertise and Pharmacovigilance, Directorate for Clinical Trials and Pharmacovigilance

Россия, Volginsky

Taisiya V. Grigiryeva

JSC “GENERIUM”

Email: tvgrigorieva@generium.ru
ORCID iD: 0000-0002-8658-7142

Junior Clinical Research Project Manager, Medical Operations Department, Directorate for Clinical Trials and Pharmacovigilance

Россия, Volginsky

Ravil A. Khamitov

JSC “GENERIUM”

Author for correspondence.
Email: khamitov@ibcgenerium.ru
ORCID iD: 0000-0002-1314-894X

 DSc (Medicine), Professor, Vice President of Research and Development

Россия, Volginsky

References

Supplementary files