Virus-like particle endocytosis pathways and presentation of captured antigens

Full Text

Введение

Структурные белки многих вирусов обладают способностью самопроизвольно собираться в организованные полимерные структуры — вирусоподобные частицы (ВПЧ), которые несут антигены исходных вирусов, а также могут быть искусственно «декорированы» антигенами других возбудителей. ВПЧ не содержат вирусного генома и лишены инфекционности, но могут индуцировать мощный иммунный ответ. В связи с этим ВПЧ являются перспективной основой для разработки вакцин против многих заболеваний, и некоторые из ВПЧ-вакцин уже доказали свою эффективность [10]. Лицензированы для использования ВПЧ-вакцины против гепатитов В и Е, папилломавирусов человека (HPV), Plasmodium falciparum [74, 79, 107] и ветеринарные вакцины против цирковируса свиней [46]. Десятки ВПЧ-вакцин находятся на стадиях разработки или клинических испытаний [2, 74, 79]. Кроме того, ВПЧ можно использовать для доставки внутрь клеток генно-инженерных конструкций или лекарств, а также для исследования взаимодействия вирусов с клетками и оценки действия противовирусных лекарственных средств [1].

Размеры ВПЧ находятся в общем диапазоне размеров вирусов, а их форма может воспроизводить родительские вирионы или субвирусные частицы. Ценным свойством ВПЧ является строгая организация поверхности, состоящей из повторяющихся точно ориентированных элементов [10]. Такая поверхность характерна для структур патогенов (вирусных капсидов, жгутиков бактерий), и иммунная система может распознавать эти повторяющиеся структуры, как своеобразный геометрический паттерн, ассоциированный с патогенами [9]. Так, одинаковые антигенные эпитопы, равномерно распределенные на расстоянии 5–10 нм друг от друга (как в оболочке вируса), вызывают максимальную активацию В-лимфоцитов [9]. Повторяющиеся вирусные поверхности идеальны для многовалентных взаимодействий с IgM и мультимерными компонентами врожденной иммунной системы (C1q, пентраксинами, фиколинами, коллектинами). Они эффективнее активируют комплемент, что также способствует активации В-клеток [10]. Однако мощная активация В-клеток, не подкрепленная помощью Т-хелперов, может привести к быстрой дифференцировке В-клеток в короткоживущие плазмоциты без созревания клеток иммунологической памяти и долгоживущих плазмоцитов. Результатом такого Т-независимого ответа может быть сильная, но краткосрочная продукция антител. Необходимым условием формирования длительного иммунитета к инфекции является привлечение в иммунный ответ Т-лимфоцитов, за рекрутирование которых отвечают миелоидные антигенпрезентирующие клетки (АПК) — дендритные клетки (ДК) и макрофаги. Эти АПК эффективно собирают, процессируют и представляют антигенный материал на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС). Также функцию АПК могут выполнять В-клетки и Т-лимфоциты с γ/δ Т-клеточным рецептором (TCR) [102, 108], а в очаге воспаления — эпителиальные и эндотелиальные клетки.

АПК используют различные способы поглощения внеклеточного материала, причем многие из них могут участвовать в эндоцитозе ВПЧ. Однако разные пути эндоцитоза реализуются с использованием различных рецепторов и генерируют эндоцитарные везикулы разного размера, что может оказывать существенное влияние на поглощение различных ВПЧ. Некоторые эндоцитарные рецепторы при инфекции используются вирусами для проникновения в клетки. Следует ожидать, что наличие в структуре ВПЧ вирусных лигандов этих эндоцитарных рецепторов индуцирует поглощение частиц клетками-носителями рецепторов. Определенное влияние на фармакокинетику ВПЧ могут оказать эндоцитарные механизмы, вовлеченные в трансцитоз через эпителиальные и эндотелиальные барьеры. Наконец, разные пути эндоцитоза ассоциированы с различной судьбой поглощенного материала, что может влиять на эффективность загрузки антигенов на МНС. В обзоре приведены сведения о механизмах эндоцитоза и презентации антигенов, а также данные о реализации эндоцитарных механизмов при поглощении вирусов и ВПЧ.

Фагоцитоз

Традиционно описание поглощения микробного материала начинают с фагоцитоза, который используют профессиональные фагоциты: нейтрофилы, макрофаги, ДК [53, 93]и γ/δTCR+ Т-клетки [102, 108]. Однако фагоцитознаиболее эффективен при поглощении относительно крупных корпускулярных объектов с оптимальным размером от 0,5 до 3 мкм [48, 56], что существенно превышает размер большинства ВПЧ. Фагоцитоз частиц с нанометровыми размерами также возможен, но он, по-видимому, требует агрегации или опсонизации [96], что свидетельствует о роли фагоцитарных рецепторов в поглощении мелких объектов. К фагоцитарным рецепторам относятся рецепторы опсонинов, мембранные лектины С-типа (CD205/DEC-205, СD206/маннозный рецептор, CD209/DC-SIGN), рецепторы белков теплового шока, рецептор-мусорщик CD204 [31, 44, 95]. В соответствии со специфичностью этих рецепторов, следует ожидать, что характер гликозилирования также влияет на фагоцитоз мелких частиц.

Фагоцитоз эффективно запускается при контакте клетки с выступающей частью плотного объекта с большой кривизной, например с острым концом эллипсоида [24]. Активация фагоцитарных рецепторов в месте первичного контакта инициирует сборку актиновой сети в виде чаши под мембраной. Затем актиновая чаша трансформируется в кольцо, которое продвигается вдоль объекта фагоцитоза внутри растущих выступов плазматической мембраны, до тех пор, пока объект не будет заключен в мембранную структуру — фагосому. Сформированная фагосома отпочковывается от плазматической мембраны и продвигается внутрь клетки, вступая во временные контакты с эндосомами и сливаясь с лизосомами. При этом среда внутри фаголизосомы закисляется, и поглощенный материал подвергается инактивации и расщеплению лизосомальными ферментами. Интересно, что фагоцитоз и бактерицидная активность макрофагов усиливается от притока в клетку ионов Са²⁺ через механически активируемые ионные каналы Piezo1 [40]. Эти каналы активируются при механическом воздействии на мембрану клетки [30], при контакте макрофага с внеклеточным матриксом достаточной жесткости, а также участвуют в передаче сигнала от паттерн-распознающего Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) [40]. Таким образом, на уровне механосенсоров может происходить взаимодействие управляющих фагоцитозом сигналов, генерируемых механическим воздействием и молекулярным паттерном патогена.

Судьба материала, поглощенного с помощью фагоцитоза и других вариантов эндоцитоза; презентация антигенов

Нейтрофилы для инактивации поглощенных микроорганизмов используют чрезвычайно агрессивные агенты, в первую очередь, активные формы кислорода (АФК), тогда как макрофаги и, особенно, ДК уничтожают микроорганизмы за счет ферментативной деградации при относительно слабой продукции АФК [38]. Кроме того, среда в фаголизосомах ДК менее кислая, чем у макрофагов и нейтрофилов, набор ферментов разнообразен [57], но их концентрации невелики [35], а активность протеаз ограничена присутствием ингибиторов [47]. В результате ДК расщепляют поглощенные белки с сохранением относительно больших фрагментов, в том числе, Т-клеточных эпитопов — последовательностей, обладающих антигенной специфичностью и способностью эффективно связываться с молекулами МНС [93]. Благодаря этим свойствам, а также способности обеспечивать Т-клетки дополнительными стимулирующими сигналами, ДК являются наиболее активными АПК, критически необходимыми для запуска первичного Т-зависимого иммунного ответа. Наконец, ДК обладают еще одним свойством, расширяющим возможности представления поглощенных антигенов Т-лимфоцитам, а именно, способностью к перекрестной презентации. Следует отметить, что способностью к перекрестной презентации обладают разные типы АПК [21, 56], однако наиболее эффективно этот процесс использует специализированная группа ДК — классические или обычные (conventional) ДК типа 1 (кДК1) [11].

Суть перекрестной презентации состоит в следующем. Как известно, антигенные пептиды, представленные на МНСII (МНС II) распознаются CD4⁺ Т-клетками (в частности, Т-хелперами), а пептиды на МНС I — CD8⁺ Т-клетками (цитотоксическими Т-лимфоцитами). МНС II экспрессируются на АПК и экспонируют фрагменты белков, поглощенных с помощью эндоцитоза. МНС I экспрессируются практически на всех клетках организма и на большинстве клеточных типов презентируют фрагменты белков, синтезированных исключительно внутри клетки. Иными словами, клетка может презентировать вирусные антигены CD8⁺ Т-лимфоциту только в случае заражения вирусом данной клетки, но не в случае эндоцитоза вирусных белков извне. Однако перекрестно-презентирующие АПК могут не только представлять поглощенные извне антигены на МНС II, но и перераспределять часть этих антигенов на МНС I, в результате чего эндоцитированные антигены становятся доступными как для Т-хелперов, так и для CD8⁺ Т-клеток.

Местом загрузки антигенных пептидов на МНС II являются компартменты эндолизосомального пути расщепления поглощенного материала (фагосомы/фаголизосомы, макропиносомы, поздние эндосомы). Канонической зоной загрузки МНС I является эндоплазматический ретикулум, куда из цитозоля транспортируются пептиды, образовавшиеся при работе протеосом — мультимолекулярных комплексов для расщепления ненужных или дефектных белков. При альтернативных способах загрузки МНС I, лежащих в основе перекрестной презентации, происходит перераспределение поглощенных извне антигенов на МНС I по двум принципиально различным путям — вакуолярному и цитозольному. В вакуолярном пути антигены загружаются на MHC I непосредственно в фагосомах [11], то есть там же, где происходит загрузка на МНС II. Детали этого процесса обсуждаются, однако присутствие MHC I в фагосомах доказано, и может объясняться либо захватом этих молекул с наружной мембраны в зоне образования фагоцитарной чаши, либо транспортом из эндоплазматического ретикулума в везикулах [28], которые сливаются с мембраной растущей фагосомы и увеличивают ее площадь при «натягивании» на объект [58]. Следует отметить, что вакуолярный путь перераспределения антигена реализуется макрофагами при фагоцитозе, тогда как ДК, по-видимому, преимущественно используют цитозольный путь, ассоциированный не только с фагоцитозом, но и с другими механизмами эндоцитоза, которые будут описаны ниже [105]. В цитозольном пути антигены переносятся из фагосомы в цитозоль, гидролизуются протеасомами, и полученные пептиды транспортируются по каноническому маршруту к молекулам MHC I в эндоплазматический ретикулум [28]. Как осуществляется выход антигенов из фагосомы до конца не ясно, но обсуждаются две группы механизмов — перенос с помощью специализированного мембранного канала или разрыв части фагосом из-за перекисного окисления липидов мембран под действием АФК [28].

Как уже было отмечено, уход поглощенного материала с эндолизосомального пути деградации наблюдается не только при фагоцитозе, но и при других способах эндоцитоза. Более того, специфические пути эндоцитоза веществ, необходимых для клетки (см. ниже), обязательно включают в себя выведение полезного материала с эндолизосомального пути для его защиты от разрушения. Это выведение происходит после слияния эндоцитарных везикул со специализированными мембранными органеллами — ранними эндосомами, функция которых заключается в сортировке поглощенного материала и направлении полезных грузов в соответствующие компартменты клетки с помощью везикул и тубулярных структур. Затем среда в ранней эндосоме начинает закисляться, и эта органелла превращается в позднюю эндосому, сливается с лизосомой, а оставшийся в ней материал подвергается ферментативной деградации. Наряду с полезными грузами выход с эндолизосомального пути осуществляют вирусы для сохранения своего генома и последующей репликации. Точное место «побега» с эндолизосомального пути для многих вирусов неизвестно, однако для вируса гриппа А, реовирусов, аденоассоциированного вируса, полиомавирусов, риновирусов и вируса Зика установлено, что эвакуация из эндосомы зависит от закисления среды и часто требует действия ферментов на структурные белки вириона, что происходит при созревании ранней эндосомы в позднюю [14, 33, 36, 43, 81]. Поскольку некоторые вирусы могут выходить из эндосомы в виде целого вириона или субвирионных частиц, утративших лишь часть структурных белков, следует предположить, что ВПЧ, воспроизводящие структуру таких вирусов, также могут использовать вирусные механизмы «побега» и покидать эндолизосомальный путь в виде целых или фрагментированных частиц. Однако ВПЧ не инфекционны, и их выход из эндосомы приведет к деградации ненужных клетке вирусных белков в протеасомах и загрузке пептидов на MHC I, тогда как сохранение ВПЧ в эндосомах вплоть до их созревания и слияния с лизосомами приведет к расщеплению ферментами и загрузке пептидов на MHC II.

Следует учесть, что уход чужеродных объектов с эндолизосомального пути ведет к большим потерям антигенного материала, поскольку пептиды, образованные в протеасомах, быстро разрушаются до аминокислот цитозольными пептидазами, и лишь малая часть пептидов успевает загрузиться на MHC I [84]. В связи с этим предполагается, что эффективная презентация эндоцитированных антигенов на MHC I может происходить лишь при поглощении клеткой большого количества антигенного материала. Тем не менее при использовании ВПЧ для избирательной индукции клеточного цитотоксического ответа уход от эндолизосомального пути деградации может дать положительный результат. Так, псевдотипирование ВПЧ вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) гликопротеинами вируса везикулярного стоматита усиливало рекрутирование CD8⁺ T-клеток в цитотоксический ответ на антигены ВИЧ за счет расширения спектра АПК и усиления эндоцитоза, а также за счет направления ВПЧ из эндосом в цитоплазму. В результате облегчалось взаимодействие вирусных белков с протеасомой и ассоциация пептидов с MHC I [22, 63]. Уход с эндолизосомального пути также необходим для ВПЧ, которые планируется использовать для доставки внутрь клеток генно-инженерных конструкций или лекарственных средств, которые могут быть разрушены лизосомальными ферментами. В то же время для ВПЧ, которые планируется использовать в вакцинах для предотвращения большинства инфекций, уход антигенного материала с эндолизосомального пути представляется невыгодным, поскольку он может ослабить рекрутирование Т-хелперов, необходимых для формирования полноценного гуморального и клеточного иммунного ответа и иммунологической памяти.

Интересно, что в ходе эндоцитоза формируются пулы ранних эндосом с различной динамикой созревания. При этом стабильные ранние эндосомы могут длительно сохранять и сортировать поглощенный материал в нейтральной среде, тогда как другие эндосомы быстро закисляют среду и сливаются с лизосомами. Выбор груза для этих двух пулов эндосом происходит уже на плазматической мембране и, вероятно, связан с ассоциацией фагоцитарного/эндоцитарного рецептора с адапторными белками. Анализ, проведенный Burgdorf и Kurts показал, что грузы, фагоцитированные АПК мыши с помощью маннозного рецептора СD206 и лангерина/CD207, ассоциированы с ранними эндосомами, что, по мнению авторов, способствует перекрестной презентации. Фагоцитоз с помощью рецепторов CD209/DC-SIGN, CD205/DEC-205, DCIR2, дектина-1, MGL (macrophage galactose-type lectin) и рецепторов-мусорщиков направляет материал по эндолизосомальному пути, что должно приводить к преимущественной презентации антигенов на МНС II [21]. В связи с этим данные о взаимодействии ВПЧ с фагоцитарными рецепторами могут быть полезны для прогнозирования способа презентации антигенов, однако на сегодняшний день эти данные немногочисленны. Известно, что ВПЧ из белка L1 папилломавируса человека 16 (HPV-16) взаимодействуют с гепарансульфатом синдекана-3 на ДК и лангерином на клетках Лангерганса [19, 103], тогда как ВПЧ из белка L1 HPV-16 и белка L2 бычьего папилломавируса связываются рецептором DC-SIGN [4]. ВПЧ из белка gag ВИЧ-1 связываются с DC-SIGN [98], а химерные ВПЧ аденовируса человека типа 3, декорированные доменом RBD вируса SARS-CoV-2, связываются с DC-SIGN и MGL [15].

Макропиноцитоз

Для активного сбора антигенов ДК используют еще один процесс, зависящий от быстрого ремоделирования мембраны — макропиноцитоз [80]. При макропиноцитозе перестройки актинового цитоскелета формируют складки мембраны на поверхности клетки, которые смыкаются, захватывают жидкость и взвешенные в ней частицы и образуют крупные везикулы размером от 0,5 до 10 мкм — макропиносомы. В АПК этот тип эндоцитоза направляет поглощенный материал преимущественно на эндолизосомальную деградацию: среда в макропиносомах закисляется, они сливаются с поздними эндосомами и лизосомами, поглощенные белки разрушаются ферментами до пептидов, которые загружаются на МНС II.

С помощью макропиноцитоза внутрь клеток могут проникать некоторые вирусы, причем этот путь является основным способом заражения клеток крупными вирусами, такими как вирус Эбола и вирус осповакцины (табл.). ВПЧ, воспроизводящие вирус Эбола, также поглощаются с помощью макропиноцитоза [75]. Интересно, что макропиноцитоз может зависеть от состава вириона, хотя ранее эта форма эндоцитоза представлялась процессом неспецифического поглощения жидкости и взвешенных в ней частиц. Так, введение в состав вируса везикулярного стоматита гликопротеинов вируса Эбола индуцирует макропиноцитоз полученных псевдотипированных вирионов [75]. Определенная зависимость макропиноцитоза от свойств поглощаемого материала может быть связана со стимуляцией этого процесса паттерн-распознающими рецепторами. Так, у незрелых ДК макропиноцитоз идет конститутивно, однако при распознавании патогена рецепторами TLR2 или TLR4 макропиноцитоз активизируется, а подвижность клеток временно ограничивается, что позволяет ДК в течение нескольких часов собрать в инфицированной ткани большое количество разнообразного материала и лишь затем мигрировать в региональный лимфоидный орган для презентации собранных антигенов [100].

 

Таблица. Эндоцитарные пути проникновения вирусов в клетки человека

Table. Endocytic pathways of virus entry into human cells

Вирусы Viruses	Размер вириона (нм) Virion size (nm)	Пути эндоцитоза Pathways of endocytosis
		Макропиноцитоз Macropinocytosis	КОЭ Clathrin-mediated endocytosis	Клатрин-независимые пути Clathrin-independent pathways
Вирусы с липидной оболочкой Lipid-enveloped viruses
Хантавирусы Hantaviruses	228–5051	+ [72]	+ [72]
Эболавирус Ebolavirus	80×1400	+ [75, 91]
Вирус коровьей оспы Vaccinia virus	200×300	+ [70]
Вирус кори (основной путь — слияние с мембраной клетки) Measles virus (the major pathway is via fusion with cell membrane)	150–250	+ [41]		RhoA-ROCK-миозин II-зависимый путь [41] RhoA-ROCK-myosin II-dependent pathway
Вирус простого герпеса Herpes simplex virus	185–225			Путь Arf6 [77] Arf6 pathway
Герпесвирус, тип 8 Herpesvirus type 8	185–225	+ [83]	+ [5]
Вирус везикулярного стоматита Vesicular stomatitis virus	80×200		+ [65]
SARS-CoV-2	50–200		+ [7]
Вирус гриппа А Influenza A virus	100–120		+ [64, 90]
Вирус гепатита С Hepatitis C virus	40–60		+ [16, 67]
Вирус денге 2 Dengue virus 2	40–60		+ [3]
Вирус Зика Zika virus	40–60		+ [4, 81]
Вирус гепатита В Hepatitis B virus	30–42		+[46, 50, 52]	Кавеолы [59] Caveolae
Простые вирусы Non-enveloped viruses
Аденовирус, тип 2 и 5 Adenovirus type 2 and 5	70–90	+ [68, 69]	+ [68, 69]
Аденовирус, тип 3 Adenovirus type 3	70–90	+ [8]
Ротавирус Rotavirus	76		+ [33]	Путь IL-2Rβ [92] IL-2Rβ pathway
HPV, тип 16 HPV type 16	55		+ [34]
Полиомавирус 2 (JC) Poliomavirus 2 (JC)	40–50		+ [66]
Полиомавирус клеток Меркеля Merkel cell polyomavirus	40–50			Кавеолы/липидные рафты [14] Caveolae/lipid rafts
SV40	40–50			Кавеолы [82, 97] Caveolae CLIC-GEEC [32]
Вирус гепатита Е Hepatitis E virus	32–34		+ [51]
Вирус Коксаки A9 Coxsackievirus A9	20–30			Путь Arf6 [49] Arf6 pathway
Вирус Коксаки В3 Coxsackievirus В3	20–30		+ [27]	Путь Arf6 [61] Arf6 pathway
Эховирус-1 Echovirus-1	20–30			Кавеолы [62] Caveolae
Энтеровирус-71 Enterovirus-71	20–30			БЭОЭ [26] rapid endophilin-mediated endocytosis
Риновирус человека 14 Human rhinovirus 14	20–30		+ [43]
Аденоассоциированный вирус, тип 2 и 5 Adenoassociated virus type 2 and 5	20		+ [12, 13, 37]	CLIC-GEEC [78]

 

Клатрин-опосредованный эндоцитоз (КОЭ)

КОЭ является наиболее универсальным способом эндоцитоза и в физиологических условиях используется любыми эукариотическими клетками для связывания и транспортировки внутрь клеток необходимых веществ — метаболитов или гормонов с помощью специфических эндоцитарных рецепторов. Кроме того, КОЭ применяется для интернализации связавших лиганд сигнальных рецепторов с целью выключения сигнала и разрушения рецептора или его очистки от лиганда и возвращения на мембрану. У В-лимфоцитов КОЭ используется для интернализации связавших антиген В-клеточных рецепторов (BCR) и является основным способом сбора антигенов этим типом АПК [58, 88]. Интересно, что Т-лимфоциты интернализуют α/β TCR с помощью КОЭ в ходе постоянного рециклинга не связанных с антигеном TCR, тогда как после взаимодействия с комплексом антиген–МНС TCR поглощается с использованием клатрин-независимых механизмов [25].

Для запуска КОЭ эндоцитарные рецепторы должны связать лиганд, после чего их цитоплазматические участки рекрутируют адапторные белки и тримеры клатрина, имеющие характерную форму трискелиона. Тримеры клатрина полимеризуются, группируя нагруженные рецепторы на определенном участке плазматической мембраны и образуя под этим участком клатриновую сеть, которая привлекает индукторы искривления: эпсины и белки с доменом BAR. При этом клатриновая сеть выгибается внутрь клетки, увлекая с собой мембрану, рецепторы и связанные с ними лиганды. В результате формируется покрытая клатрином ямка, которая по мере прогибания мембраны превращается в шарообразную полость диаметром около 100–150 нм. Затем происходит рекрутирование и полимеризация динамина-2 в спираль, которая стягивает шейку полости и отделяет покрытую клатрином везикулу от наружной мембраны клетки. Клатрин диссоциирует от везикулы, и она сливается с ранней эндосомой, которая осуществляет сортировку поглощенного материала. Затем среда в ранней эндосоме начнет закисляться, она превратиться в позднюю эндосому и оставшийся в ней материал подвергается эндолизосомальной деградации [58]. Ассоциация КОЭ с сортировкой материала в ранних эндосомах и постепенное превращение ранних эндосом в поздние представляет возможность для «побега» с эндолизосомального пути деградации. Возможно, поэтому КОЭ является самым распространенным путем проникновения в клетки вирусов, которые в ходе эволюции приобрели способность взаимодействовать с эндоцитарными рецепторами [71]. В частности, вирусы гриппа, гепатита В, гепатита С, SARS-CoV-2, HPV-16, аденовирусы, герпесвирусы используют КОЭ для заражения клеток (табл.).

Быстрый эндофилин-опосредованный эндоцитоз (БЭОЭ)

КОЭ является относительно медленным процессом. Для интернализации большого количества рецепторов (более миллиона копий) с помощью КОЭ клетке требуется около 30 мин, и для ускорения поглощения необходим запуск дополнительных механизмов [86]. Так, при росте количества BCR, связавших антиген, В-клетки модифицируют КОЭ в несколько раз увеличивая размер покрытых клатрином ямок. Для превращения таких крупных участков мембраны в везикулу требуется раннее участие актина, тогда как при классическом КОЭ актин используется только для продвижения сформированной везикулы внутрь клетки [88]. Другие клетки могут проводить более радикальную смену механизмов эндоцитоза, как, например, эпителиальные клетки при росте концентрации эпидермального фактора роста (EGF). При низких концентрациях EGF его рецептор интернализуется КОЭ, при повышенной концентрации — неклатриновым эндоцитозом рецептора EGF с острым ремоделированием мембраны и активацией динамина. Наконец, при чрезвычайно высоких концентрациях этого потенциально онкогенного фактора экстренный клиренс его рецептора с поверхности осуществляется с помощью макропиноцитоза и БЭОЭ [86].

БЭОЭ, также как и КОЭ, зависит от взаимодействия интернализуемого рецептора с лигандом, а формирование эндосомальной везикулы осуществляется за счет изгибания мембраны специализированным цитозольным белком, в данном случае — индуктором искривления эндофилином [18]. Однако, в отличие от клатрина, эндофилин обогащает отдельные участки под наружной мембраной еще до взаимодействия рецептора с лигандом за счет активного перераспределения между короткоживущими (5–10 с) «эндофилиновыми пятнами». Активация рецептора лигандом инициирует связывание эндофилина с цитоплазматическим участком рецептора (непосредственно или через адапторные белки), что вызывает кластеризацию активированных рецепторов и группировку их грузов на локальном участке мембраны, который втягивается в клетку и образует глубокую полость (везикулярно-тубулярную сборку) размером 0,1–1 мкм, которая с цитоплазматической стороны окружена эндофилином и белком Bin1. Почкование этой везикулы требует полимеризации динамина и актина, а ее продвижение внутрь клетки вдоль микротрубочек осуществляется с помощью молекулярного мотора динеина, который рекрутируется белком Bin1 [86].

В физиологических условиях БЭОЭ участвует в интернализации питательных веществ и цитокинов, в частности, IL-2 [18], а также обеспечивает поглощение и перераспределение участков мембраны при движении или поляризации клетки [94]. Следует отметить, что β-цепь рецептора IL-2 (IL-2Rβ) может быть интернализована по своему уникальному пути, родственному макропиноцитозу и требующему активности малой ГТФ-азы RhoA [86]. При инфекциях БЭОЭ может быть вовлечен в отравление клеток бактериальными токсинами (холерным токсином и токсином Шига) и в заражение энтеровирусами, тогда как путь IL-2Rβ может обеспечивать проникновение в клетку ротавирусов(табл.).

Клатрин-независимые пути эндоцитоза, опосредованные липидными рафтами

Еще одна группа эндоцитарных механизмов описывается концепцией «гликолипид–лектин», согласно которой сшивание интегрированных в мембрану гликолипидов или гликопротеинов внеклеточными лектинами создает локальное напряжение в мембране, которое разрешается спонтанной тубуляцией. Иными словами, лектины с внешней стороны плазматической мембраны сшивают заякоренные в мембране молекулы и «заворачивают мембрану на себя», что ведет к формированию трубчатых эндоцитарных ямок, а затем — везикул. Одним из вариантов такого механизма является эндоцитарный путь CLIC/GEEC, в ходе которого формируются мелкие (50–80 нм) трубчатые или серповидные везикулы — клатрин-независимые переносчики (CLIC), которые затем сливаются друг с другом и созревают в ранние эндоцитарные компартменты, обогащенные гликозидфосфатидилинозитол-заякоренными белками (GEEC) [94].

В норме CLIC/GEEC транспортируют в клетку лектины галлектин-3 и -8, интернализуют белки, закрепленные с наружной стороны мембраны гликозидфосфатидилинозитольнымякорем (CD55, CD59, СD90/Thy-1), а также трансмембранные гликопротеины (рецептор фолиевой кислоты и CD44). Кроме того, CLIC/GEEC участвуют в захвате значительного объема жидкости и в перераспределении поглощенных участков наружной мембраны при движении клеток и морфогенезе органов. Наконец, этот путь эндоцитоза используют некоторые вирусы, в частности, аденоассоциированный вирус 2 и вирус SV40 (обезьяний вирус) (табл.). Судьба материала, поглощенного с помощью CLIC/GEEC, определяется в ходе сортировки в ранних эндосомах и зависит от степени гликозилирования и взаимодействия с галектином. Поскольку путь CLIC/GEEC чувствителен к истощению запасов холестерина, а гликозидфосфатидилинозитол-заякоренные белки располагаются в липидных рафтах, предполагается, что везикулы CLIС формируются из этих особых участков плазмалеммы [58].

Липидные рафты используются клетками при реализации еще нескольких путей эндоцитоза. Наиболее известным является эндоцитоз с помощью кавеол — липидных рафтов специфической вогнутой колбообразной формы размером 50–100 нм. Ключевую роль в формировании этих структур играет белок кавеолин-1, интегрированный в цитоплазматическую поверхность кавеолы. При биогенезе кавеол кавеолин-1 олигомеризуется в эндоплазматическом ретикулуме и переносится в аппарат Гольджи для мультимеризации на участке мембраны, который обогащается холестерином. Этот предшественник липидного рафта затем транспортируется к плазматической мембране в виде небольших везикул, которые открываются наружу и интегрируют в свою мембрану другие липиды и белки, в частности, кавины. С помощью кавеол осуществляется транспорт различных веществ [76], включая трансцитоз — сквозной перенос веществ через эндотелиальные или эпителиальные клетки [89], а также поглощение некоторых мелких вирусов (табл.).

Кавеолы были впервые обнаружены у эндотелиальных, эпителиальных и мышечных клеток, а также у адипоцитов и фибробластов, а затем появились сообщения об использовании этого механизма при поглощении наноразмерных объектов другими клетками, включая ДК. Например, сообщалось, что наноструктура, собранная посредством электростатического взаимодействия катионного пептидного антигена и анионного polyIC (агонист TLR3, играющий роль адъюванта), поглощается CD11c⁺ ДК мыши с помощью кавеол, причем около 40% поглощенного материала направляется по эндолизосомальному пути, что свидетельствует о принципиальной возможности презентации собранных антигенов на МНС II [17]. Однако в экспериментах с поглощением частиц разного размера эпителиальными и эндотелиальными клетками переход к кавеолярному пути эндоцитоза сопровождался утратой ассоциации поглощенного материала с эндолизосомальным путем деградации [42, 85]. Таким образом, судьба груза, поглощенного кавеолами, может быть различной и, возможно, зависит от типа клетки или характера поглощаемого груза [58].

Следует отметить, что в некоторых работах [17, 85] кавеолярный тип эндоцитоза идентифицируют только с помощью ингибитора филиппина, который связывает холестерин. По нашему мнению этого недостаточно для точной идентификации кавеолярного типа поглощения, поскольку истощение холестерина может влиять на другие пути эндоцитоза, ассоциированные с липидными рафтами. Выше уже упоминалось, что с рафтами ассоциированы CLIC/GEEC. Кроме того, плоские липидные рафты могут быть вовлечены в эндоцитоз по флотиллин-зависимому пути и по Arf6-зависимому пути. Везикулы, сформированные с участием флотиллина, сливаются с поздними эндосомами и направляют поглощенный материал на деградацию по эндолизосомальному пути, тогда как путь Arf6 ведет к сортировке поглощенного материала и рециклированию мембраны обратно на клеточную поверхность [58]. В связи с этим Arf6-зависимый эндоцитоз служит безопасными входными воротами для некоторых вирусов (табл.).

Пути эндоцитоза частиц с различными размерами

Приведенный выше перечень путей эндоцитоза является неполным (в него не включены пути поглощения нейромедиаторов), однако со всей очевидностью свидетельствует о том, что эволюция поддержала множество механизмов, позволяющих эффективно поглощать и сортировать различные грузы в зависимости от их химических свойств и размеров. Химические свойства поверхности частиц определяют взаимодействие с тем или иным рецептором, связанным с конкретным путем поглощения. Что касается размеров поглощаемых объектов, то связь микрометровых размеров с фагоцитозом и макропиноцитозом не вызывает сомнений. Весьма заманчивым представляется предположение о том, что другие пути эндоцитоза используются клеткой для сортировки нанометровых объектов по размеру, однако данные об оптимальном размере частиц для этих путей противоречивы. Так, в работе Wang с соавт. [99] у эндотелиальных клеток оптимальным для кавеол был диаметр < 40 нм, причем в одну кавеолу помещалось до трех частиц размером 20 нм или до двух частиц размером 40 нм. В исследовании Rejman с соавт. [85] микросферы с диаметром < 200 нм эффективно поглощались с помощью КОЭ, тогда как увеличение диаметра до 500 нм направляло материал по пути, чувствительному к филиппину, который авторы (возможно, не вполне корректно) определяют как кавеолярный. В работе Grosse с соавт. [42] эпителиальные клетки дыхательных путей поглощали комплексы ДНК с полимерными носителями размером ≤ 100 нм с помощью кавеол, частицы с размером 100–200 нм — с помощью КОЭ, а частицы с диаметром > 200 нм — с помощью макропиноцитоза. При поглощении вирусов наиболее распространенным и универсальным способом эндоцитоза является КОЭ, макропиноцитоз характерен для крупных вирусов, а CLIC/GEEC и кавеолярный путь — для самых мелких вирусов (табл.).

Пути эндоцитоза ВПЧ

ВПЧ часто используют путь поглощения исходного вируса, однако могут иметь большую свободу выбора путей эндоцитоза в зависимости от конкретных условий. Так, основным путем поглощения вируса HPV-16 является КОЭ (табл.), и ВПЧ этого вируса также могут поглощаться клетками Лангерганса и ДК с помощью КОЭ [19]. Однако в других экспериментальных условиях [103] ДК поглощали эти ВПЧ с помощью фагоцитоза и макропиноцитоза, а клетки Лангерганса — с помощью кавеол. При этом, как ДК, так и клетки Лангерганса были способны перекрестно презентировать антигены этих ВПЧ. Смена типа вируса также может изменять путь эндоцитоза. Так, в одних и тех же условиях ВПЧ HPV-16 и HPV-58 поглощались с помощью КОЭ, а ВПЧ HPV-31 — с помощью рафт-ассоциированного эндоцитоза [20].

Крупные ВПЧ вируса Эбола с диаметром около 80 нм и длиной до 2 мкм, так же как и настоящие вирионы, поглощаются с помощью макропиноцитоза [75]. Однако небольшое количество этих ВПЧ может проникать в клетки за счет КОЭ, что, возможно, объясняется гетерогенностью ВПЧ или модификацией процесса КОЭ [6].

Различные полиомавирусы человека поглощаются с помощью кавеол или КОЭ (табл.). ВПЧ полиомавируса мыши, так же как и исходный вирус, поглощаются фибробластами и эпителиальными клетками и транспортируются в перинуклеарную зону с помощью кавеол [87].

Вирус гепатита В проникает в клетки с помощью КОЭ, а также может транспортироваться в кавеолах (табл.). ВПЧ из корового белка HBcAg, воспроизводящие нуклеокапсид вируса, взаимодействуют с сульфатированными гепарансульфатными протеогликанами на различных типах клеток, включая макрофаги и В-лимфоциты, поглощаются с помощью КОЭ и подвергаются расщеплению по эндолизосомальному пути [29]. ВПЧ, состоящие из малого белка оболочки вируса гепатита В, подавляют функцию плазмоцитоидных ДК, но поглощаются классическими ДК и могут доставлять антиген на молекулы MHC II, а в субпопуляции кДК1 — вызывать еще и перекрестную презентацию антигена на MHC I [73]. Вирус гепатита С также проникает в клетки с помощью КОЭ. Этот вирус обладает липидной оболочкой, но в сыворотке инфицированных пациентов обнаруживаются голые нуклеокапсиды. ВПЧ, воспроизводящие эти субвирусные структуры, вызывают сильный иммунный ответ. В клетках печени эти ВПЧ интернализуются КОЭ, достигая ранних и поздних эндосом и, наконец, лизосом [55]. Нативные вирионы и ВПЧ вируса гепатита Е проникают в клетки с помощью КОЭ [54].

Вирус гриппа А проникает в клетки клатрин-зависимым путем (табл.), тогда как ВПЧ вируса гриппа А поглощаются не только с помощью КОЭ, но и посредством клатрин-независимого эндоцитоза, а также макропиноцитоза и фагоцитоза [60]. Эти ВПЧ получали экспрессией гемагглютинина (ГА) гриппа в Nicotiana benthamiana. Они состояли из липидной оболочки размером ~100 нм, в которую было интегрировано 30–50 «шипов» гомотримерного ГА. Через 45 мин после начала поглощения частиц ГА локализовывался внутри клеток вместе с Rab5 (маркер ранних эндосом), Rab7 (маркер поздних эндосом), Rab11 (маркер рециклирующих эндосом), а также MHC II и MHC I. Это свидетельствует о разнообразии путей поглощения ВПЧ, направлении антигенного материала как в поздние, так и в статические ранние эндосомы и его доступности для «прямой» и перекрестной антигенной презентации, что представляется полезным для ВПЧ-вакцин.

Применение ВПЧ для доставки внутрь клеток лекарств или генно-инженерных конструкций предъявляет иные требования к эндоцитозу, а именно: 1) избирательность поглощения ВПЧ клетками — мишенями лечебного воздействия; 2) использование эндоцитарного пути, защищающего материал от эндолизосомальной деградации. Разработка таких векторов может осуществляться с помощью выбора ВПЧ, которые соответствуют этим требованиям, или с помощью искусственного «нацеливания» ВПЧ на определенные эндоцитарные рецепторы. Так, для целевой доставки цитостатиков ВПЧ полиомавируса мыши «нацеливали» на рецептор трансферрина, который может сильно экспрессироваться на раковых клетках. Поскольку поглощение трансферрина осуществляется с помощью КОЭ, то и ВПЧ, конъюгированные с трансферрином, проникали в клетки-мишени клатрин-зависимым путем, который не используется родительским вирусом [106]. Пример подбора ВПЧ-вектора, не требующего искусственного «нацеливания», приведен в работе Caulier B. и соавт. [23], где в качестве потенциального вектора доставки цитостатика в клетки острого миелоидного лейкоза использовали мелкие (30 нм) ВПЧ, имеющие форму додекаэдра и состоящие из 12 копий белка основания пентона (Pb) — одного из структурных белков капсида аденовируса человека серотипа 3. Эти ВПЧ по своей структуре не соответствовали настоящему вириону — икосаэдру размером 70–90 нм, в котором пентамеры Pb образуют только углы капсида. Однако Pb отвечает за взамодействие вириона с интернализуемыми рецепторами (интегринами αV/β3 и αV/β5) [101]. Поэтому ВПЧ из Pb хорошо поглощаются с помощью КОЭ мишенями вируса — моноцитами, В-лимфоцитам и, особенно, клетками в митозе [39], в частности, клетками острого миелоидного лейкоза [23].

Интересна попытка использовать ВПЧ вируса Джона Каннингема для доставки лекарственных агентов через гематоэнцефалический барьер. Латентная инфекция этого вируса широко распространена и, по-видимому, безвредна, однако ее активация на фоне иммунодефицита ведет к переносу вируса в центральную нервную систему и развитию прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии. В эксперименте ВПЧ этого вируса быстро связывались с покрытыми клатрином ямками на люминальной поверхности эндотелиальных клеток гематоэнцефалического барьера, и вскоре обнаруживались в ранних эндосомах, затем накапливались в перинуклеарной области и через 4 ч начинали покидать клетку с базального полюса. Авторы не наблюдали ассоциации ВПЧ с лизосомально-ассоциированным мембранным белком 1 (LAMP1). Соответственно, ВПЧ не подвергались эндолизосомальной деградации и проходили сквозь клетку в виде неразрушенных частиц [104].

Заключение

ВПЧ могут проникать в клетки с помощью различных механизмов эндоцитоза. Не вызывает сомнения, что при конструировании ВПЧ для вакцин или для адресной доставки лекарственных веществ полезно знать механизм эндоцитоза частиц и судьбу поглощенных веществ. При конструировании ВПЧ-вакцин наиболее актуальными показателями представляются эффективность сбора материала и особенности презентации антигенов (или конечный результат презентации — вовлечение антиген-специфических CD4⁺ и/или CD8⁺ Т-клеток в ответ на ВПЧ). Влиять на эти показатели можно, выбирая ВПЧ, взаимодействующие с определенными эндоцитарными рецепторами, или вводя в ВПЧ дополнительные компоненты, «нацеливающие» частицы на выбранный рецептор.

About the authors

Vladimir Yu. Talayev

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Author for correspondence.
Email: talaev@inbox.ru

DSc (Medicine), Professor, Head of the Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Irina Ye. Zaichenko

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: talaev@inbox.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Olga N. Babaykina

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: talaev@inbox.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Maria V. Svetlova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: talaev@inbox.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod

Elena V. Voronina

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: talaev@inbox.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunology

Russian Federation, Nizhny Novgorod

References

Supplementary files