Microbiological evaluation of probiotic therapy in patients with pulmonary tuberculosis

Full Text

Введение

Микробиом человека — это фундаментальная основа его здоровья. Микробиота оказывает влияние на все виды обмена веществ человека, иммунологическую реактивность, пищеварение, детоксикацию, реализацию генетической программы, а также ассоциирована с развитием некоторых заболеваний [2, 3]. В настоящее время применение биологических препаратов на основе живых микроорганизмов в схемах лечения пациентов с различной нозологией позволяет снизить тяжесть основного заболевания, предупредить развитие осложнений и побочных эффектов от антимикробных препаратов [3, 8, 17].

Сохранение и коррекция кишечного микробиома у пациентов с туберкулезом приобретает все большую значимость, в связи с необходимостью улучшения качества и продолжительности жизни больных при длительной многокомпонентной противотуберкулезной терапии, обусловливающей стойкие нарушения микробиоты [16]. Дисбаланс в микробиоме сопровождается появлением гастроинтестинального синдрома, формированием резистентности возбудителей на фоне мальабсорбции и снижением комплаентности пациентов к лечению [14, 27]. Поэтому пациенты фтизиатрического профиля нуждаются в стабильной, функционально активной микробиоте.

В настоящее время имеются ограниченные данные по использованию бактерийных иммунобиологических препаратов на фоне этиотропной терапии у пациентов с туберкулезом, вызванным штаммами микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [16]. Поэтому сложно говорить о длительности и количестве курсов пробиотикотерапии для туберкулезных пациентов, о характере влияния комбинированной терапии на тяжесть заболевания и эффективность противотуберкулезных препаратов в отношении резистентных возбудителей. Для оптимизации пробиотикотерапии в когорте пациентов фтизиатрического профиля необходимо понимать характер воздействия пробиотических штаммов на состав и функциональное состояние микробиоты после их применения по стандартным схемам, зависимость клинической эффективности от степени восстановления количества и видового состава микробиоты.

Цель исследования — оценить изменения кишечного микробиома после курса пробиотиков на фоне противотуберкулезной химиотерапии у пациентов с МЛУ туберкулезом.

Материалы и методы

Дизайн исследования — проспективное на связанной выборке малого объема (n = 30). Группа была сформирована на принципах добровольности и информированности на базе Кузбасского клинического фтизиопульмонологического медицинского центра имени И.Ф. Копыловой (протокол этического комитета ФГБОУ ВО КемГМУ № 290/к от 14.09.2021). Средний возраст пациентов составил 45±6 лет. Распределение по полу было таковым: 21 мужчина (70%) и 9 женщин (30%). Противотуберкулезная терапия включала фторированные хинолоны (Fq), бедаквилин (Bq), аминогликозиды, циклосерин (Cs), пиразинамид (Z), пара-аминосалициловую кислоту (PAS), линезолид (Lzd), этамбутол (E). Комбинация препаратов была регламентирована клиническими рекомендациям и подбиралась в соответствии с клиническим течением заболевания [19]. Критерии включения в группу: туберкулез органов дыхания, МЛУ возбудителя, прием не менее 30 доз противотуберкулезных препаратов по IV или V режиму химиотерапии, наличие гастроинтестинального синдрома как следствие этиотропной терапии. Критерии исключения из исследования: воспалительные и инфекционные заболевания печени, кишечника; прием пробиотических препаратов менее чем за 2 месяца до начала исследования.

Гастроинтестинальный синдром у пациентов проявлялся тошной (66,6%), метеоризмом (56,6%), болевым абдоминальным синдромом (46,6%), диареей (36,6%), запорами (33,3%). На момент развития гастроинтестинального синдрома медиана принятых доз противотуберкулезных препаратов составила 34,5 (30; 57,5). Курс приема биопрепарата составил 21 день. В состав препарата входила композиция из 2 видов бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum и B. animalis) и 4 видов лактобацилл (Lactobacillus casei, L. plantarum, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus). Форма препарата — кишечнорастворимая капсула. Содержание бифидобактерий в дозе препарата составило 2,2 × 10⁹ КОЕ, лактобацилл — 2,6 × 10⁹ КОЕ [7]. Пациенты принимали пробиотический препарат по 1 капсуле 2 р/сут под контролем медицинских работников среднего звена.

Исследование микробиома кишечника проводили до начала пробиотикотерапии и спустя 7 дней после окончания приема препарата. В качестве материала использовали фекалии, которые в количестве не менее 1–3 г собирали утром в стерильные емкости (ООО «Полимерные изделия»). Транспортировку в лабораторию проводили в течение 2 ч. Готовили десятикратные разведения материала и проводили посев на селективные и дифференциально-диагностические среды. Идентифицировали выделенные чистые культуры микробов с помощью коммерческих тест-систем производства Lachema diagnostica s.r.o, Чехия. Было выделено 116 штаммов энтерококков,38 штаммов стафилококков,53 культуры грибов рода Candida.

Проведено исследование частоты экспрессии факторов вирулентности у условно-патогенных микроорганизмов. Определение синтеза гемолизинов проводили на 5% кровяном мясо-пептонном агаре, липаз — на агаре с трибутирином (HIMEDIA, Индия). Протеолитические свойства изучали с помощью набора «МикроЖелатиназа» (НИЦФ, Санкт-Петербург).

Кислотообразование у микроорганизмов изучали титрометрическим методом с помощью 0,1 н раствора гидроксида натрия. Титровали бульонную культуру бактерий (V = 10 мл) в присутствии фенолфталеина до появления стойкого слабо-розового окрашивания, которое не исчезало в течение 3 мин. Титруемая кислотность выражается в условных градусах Тернера (°T).

Состав жирных кислот энтерококков исследовали с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ГХ-МС). Липидную фракцию клеточных стенок энтерококков выделяли из отмытой культуры, выращенной на мясо-пептонном бульоне. Пробоподготовка заключалась в том, что к образцу добавляли 1 мл 5% раствора Н₂SO₄ в MeOH и 300 мкл толуола. К полученному раствору добавляли внутренний стандарт (1 мкг метилундеканоата). Затем образец нагревали при 90°С в течение часа. Далее проводили экстракцию с помощью 700 мкл гексана. Объем отобранной гексановой фракции концентрировали отдувкой растворителя до объема 200 мкл. Полученные пробы, содержащие жирные кислоты в виде метиловых эфиров, использовали для анализа. Анализ проводили на хроматомасс-спектрометре Agilent 7000B. Объем пробы 2 мкл, ввод без деления потока. Колонка: ZB-WAX,30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм. Условия хроматографирования: Oven Program 100°C до 0 мин затем 8°C/мин до 250°C — 5 мин, Flow — 1 мл/мин.

Накопление, систематизация исходной информации и визуализация полученных данных были реализованы в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016. Статистическую обработку результатов, полученных на парных выборках осуществляли с помощью сервиса IBM SPSS Statistics/PS IMAGO. Проверку нулевых гипотез о распределении данных осуществляли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Применяли непараметрические методы статистики (критерий W-критерий Уилкоксона, критерий ÷²), так как полученные результаты отличались от нормального распределения. Цифровой материал представлен в виде относительных показателей (%) и в виде медианы с 1 и 3 квартилями [Me (LQ; UQ)]. Критический уровень ошибки при проверке статистических гипотез принимался равным или менее 0,05.

Результаты

Результаты бактериологического исследования кишечного микробиома показали, что у пациентов с туберкулезом органов дыхания, получавших химиотерапевтические средства, отмечены сниженные относительно региональных значений [25] титры микроорганизмов Bifidobacterium до 7,5 (7,0; 8,0) lg КОЕ/г, Lactobacillus до 5,2 (4,0; 6,0) lg КОЕ/г, Escherichia coli lac+ до 6,5 (4,0; 6,0) lg КОЕ/г, Enterococcus faecalis до 5,5 (5,0; 6,0) lg КОЕ/г, E. faecium до 5,6 (5,0; 6,0) lg КОЕ/г.

У 60% пациентов из кишечного микробиома выделяли Staphylococcus spp. с количественным уровнем 2,1 (1,0; 4,0) lg КОЕ/г, а грибы рода Candida — у 93% больных в титрах 3,7 (3,0; 4,0) lg КОЕ/г. Установлена высокая частота колонизации слизистой кишечника пациентов с туберкулезом анаэробными грамположительными клостридиями — Clostridium perfringens (36%), количественные уровни которых в среднем составили 1,5 (1,0; 2,0) lg КОЕ/г. У 33% пациентов в кишечном микробиоме обнаруживали лактозонегативные кишечные палочки в титрах 4 (1,0; 5,0) lg КОЕ/г.

После курса пробиотикотерапии статистически значимых различий по изменению колонизационных уровней большинства резидентов кишечного микробиома не выявлено. Титры бифидобактерий не достигли региональных значений нормы, так как увеличились до 7,8 (7,0; 8,0) lg КОЕ/г (p = 0,35). Количественный уровень лактозопозитивных эшерихий остался низким и не превышал 6,7 (5,0; 6,0) lg КОЕ/г (p = 0,55). Не изменился и уровень энтерококков: E. faecalis — 5,3 (4,0; 7,0) lg КОЕ/г (p = 0,81), E. faecium — 5,7 (5,0; 7,0) lg КОЕ/г (p = 0,95). Среди представителей резидентной микробиоты отмечали только статистически значимое повышение титров лактобацилл до 6,1 (6,0; 8,0) lg КОЕ/г по сравнению с исходным значением (p = 0,05). После приема бактерийных препаратов снизилась до 46,6% частота обнаружения стафилококков (p = 0,98). Они имели низкий количественный уровень равный 1,5 (1,0; 3,0) lg КОЕ/г, но он статистически не отличался от исходных титров (p = 0,33). Значимо изменилось содержание и частота обнаружения грибов рода Candida. После пробиотикотерапии грибы были выделены только у 46,7% пациентов (p = 0,001), их средний количественный уровень достигал региональных значений нормы и составил 2,1 (1,0; 5,0) lg КОЕ/г (p = 0,03). Также снизилась до 10% частота колонизации слизистой эшерихиями со слабыми ферментативными свойствами (p = 0,05), а их титры в среднем составили 1,6 (1,0; 6,0) lg КОЕ/г (p = 0,026).

Далее была проведена оценка влияния приема пробиотиков на вирулентность условно-патогенной микробиоты. Установлено, что результатом приема биопрепаратов стало снижение продукции гемолизинов. Так, частота выделения гемолизинпродуцирующих стафилококков до курса пробиотиков была 38%, после — 2% (p = 0,009), среди энтерококков 7% штаммов выделяли цитолизины (гемолизины), после приема курса пробиотиков энтерококков с гемолитической активностью выделено не было. Кроме продукции цитотоксинов у энтерококков после коррекции микробиома пробиотиками достоверно уменьшилось число штаммов с липазной активностью — с 18,6 до 8,8% (p = 0,05), а также продуцирующих протеолитические ферменты — с 12 до 2% (p = 0,05). Однако, среди микромицетов рода Candida сохранилась высокая частота обнаружения культур, продуцирующих липазу, которая составила до коррекции 38%, после — 31,5% (p = 0,7).

 

Таблица. Состав и содержание жирных кислот в клеточных мембранах микроорганизмов рода Enterococcus от фтизиатрических пациентов (в мкг на 0,01 г сухого остатка)

Table. Composition and level of cell membrane fatty acids in genus Enterococcus from phthisiological patients (in micrograms per 0.01 g of dry pellet)

Химическая формула Chemical formula	Название жирной кислоты (тривиальное) The name of the fatty acid (trivial)	Enterococcus faecalis (n = 5)		Enterococcus faecium (n = 5)
		До пробиотиков Before probiotic therapy	После пробиотиков After probiotic therapy	До пробиотиков Before probiotic therapy	После пробиотиков After probiotic therapy
Насыщенные жирные кислоты Saturated fatty acids		0,0681	0,071	0,0761	0,081
C12:0	Лауриновая Lauric acid	0,001 (0,001; 0,002)	0,001 (0,0008; 0,0013)	0,001 (0,0007; 0,002)	0,011** (0,009; 0,013)
С14:0	Миристиновая Myristic acid	0,014 (0,009; 0,0016)	0,024 (0,020; 0,028)	0,020 (0,016; 0,028)	0,010 (0,006; 0,014)
С15:0	Пентадециловая Pentadecyl acid	0,001 (0,0007; 0,0015)	0,001 (0,0007; 0,001)	0,002 (0,001; 0,003)	0,002 (0,001; 0,003)
С16:0	Пальмитиновая Palmitic acid	0,042 (0,021; 0,046)	0,033 (0,027; 0,035)	0,039 (0,021; 0,042)	0,032 (0,028; 0,04)
С17:0	Маргариновая Margarine acid	0,0001 (0,000; 0,0001)	0,001* (0,0005; 0,0013)	0,001 (0,0008; 0,002)	0,002 (0,001; 0,004)
С18:0	Стеариновая Stearic acid	0,008 (0,006; 0,009)	0,007 (0,005; 0,008)	0,010 (0,005; 0,024)	0,014 (0,011; 0,016)
С22:0	Бегеновая Begenovaya acid	0,001 (0,0005; 0,002)	0,002 (0,001; 0,004)	0,001 (0,0009; 0,0025)	0,001 (0,0008; 0,0012)
С23:0	Трикоциловая Tricocyl acid	0,001 (0,00098; 0,002)	0,001 (0,0008; 0,002)	0,002 (0,001; 0,003)	–
С24:0	Лигноцериновая Lignocerine	–	0,001 (0,0006; 0,002)	0,0001 (0,0001; 0,0002)	0,001* (0,0007; 0,0015)
Ненасыщенные жирные кислоты Unsaturated fatty acids		0,053	0,077	0,072	0,077
С14:1	Миристолеиновая Myristolein acid	0,001 (0,0008; 0012)	0,002 (0,001; 0,004)	0,001 (0,0007; 0,002)	0,001 (0,0008; 0,002)
7-С16:1	Цис-7-Пальмитолеиновая Cis-7-Palmitoleic acid	0,001 (0,0009; 0,001)	0,001 (0,0008; 0,002)	0,003 (0,001; 0,004)	0,006* (0,005; 0,0068)
9-С16:1	Цис-9-Пальмитолеиновая Cis-9-palmitoleic acid	0,012 (0,010; 0,014)	0,010 (0,007; 0,02)	0,008 (0,006; 0,009)	0,001** (0,0007; 0,002)
7-С18:1	Цис 7- вакценовая Cis-7-vaccene acid	0,002 (0,0017;0,0022)	0,003 (0,001; 0,004)	0,004 (0,003; 0,0045)	–
9-С18:1	Олеиновая Oleic acid	0,002 (0,001; 0,0023)	0,023* (0,01; 0,031)	0,027 (0,01; 0,032)	0,055* (0,042; 0,065)
С18:1	Элаидиновая Elaidine acid	0,010 (0,0095; 0,012)	0,007 (0,005; 0,008)	0,008 (0,006; 0,009)	0,004 (0,001; 0,0047)
С18:2	Линолевая Linoleic acid	–	0,001 (0,001; 0,002)	0,001 (0,0006; 0,002)	0,004* (0,003; 0,005)
С19:1	Цис-нонадекаен-10,13-овая Cis-nonadecaen-10,13-ovaya acid	0,023 (0,01; 0,028)	0,029 (0,01; 0,035)	0,019 (0,007; 0,023)	0,003** (0,001; 0,005)
С19:2	Цис, цис-нонадекадиен-10,13-овая Cis, cis-nonadecadiene-10,13-ovaya acid	0,002 (0,001; 0,0025)	0,001 (0,0007; 0,002)	0,001 (0,0005; 0,003)	0,002 (0,001; 0,003)
Общая масса Total weight		0,1211	0,148	0,1481	0,158

Примечание. * — p < 0,05; ** p ≤ 0,01.

Note. * — p < 0.05; ** p ≤ 0.01.

 

В связи с тем, что в состав пробиотического препарата входили анаэробные представители «филометаболического звена микробиома», осуществляющего регуляцию состава и свойств всего сообщества микроорганизмов (лактобациллы и бифидобактерии), одной из задач исследования была оценка их влияния на биологические свойства других микросимбионтов, в частности энтерококков. Предметом исследования стал жирнокислотный состав бактериальной мембраны бактерий рода Enterococcus до и после курса пробиотикотерапии с последующей косвенной оценкой биохимической активности энтерококков на основе активности кислотообразования в процессе ферментирования углеводов.

В целом у энтерококков в составе клеточных мембран были детектированы 9 насыщенных и 9 ненасыщенных жирных кислот (табл.), общая масса которых у разных видов энтерококков до и после применения пробиотических штаммов не отличалась (p > 0,05). У E. faecalis изменилось содержание отдельных жирных кислот с насыщенной и ненасыщенной ацильной цепью. После приема пробиотиков повысилось в 10 раз содержание маргариновой (С17:0) (p = 0,04) и олеиновой (С9-С18:1) жирных кислот (p = 0,03).

У E. faecium в 11 раз возросла масса насыщенной лауриновой кислоты (С12:0) (p = 0,001) и в 10 раз увеличилось содержание длинноцепочечной насыщенной лигноцериновой кислоты (С24:0) (p = 0,02). При этом в 2 раза увеличилась масса цис-7-пальмитолеиновой (С 7-С16:1) и олеиновой (9-С18:1) жирных кислот (p = 0,05), в 4 раза увеличилось содержание линолевой (С18:2) кислоты (p = 0,04). При этом масса цис-нонадекаен-10,13-овой (С19:1) и цис-9-пальмитолеиновой (9-С16:1) кислот снизилась в 6 и 8 раз соответственно (p = 0,001).

После курса приема пробиотиков регистрировали достоверно значимое увеличение продукции энтерококками органических кислот. Кислотообразование у E. faecalis было 28,9°Т (20,2; 36,4), а увеличилось до 44,3°Т (40,1; 45,5) (p = 0,007). Среднее значение кислотообразования у E. faecium до курса пробиотиков составило 27,5°Т (17,7; 37,9), после 42,5°Т (40,4; 44,5) (p = 0,001).

Обсуждение

Основополагающим механизмом действия пробиотических штаммов является создание временного микробиоценоза на основе восполнения количественного уровня микросимбионтов пациента [11]. Кроме этого, пробиотические штаммы вступают в антагонистические взаимоотношения с патогенными и условно-патогенными штаммами, которые элиминируются из кишечного биотопа, нормализуют pН кишечника, активизируют мукозальный иммунитет, метаболизируют различные субстраты и нормализуют пищеварение [2, 12, 15]. Для получения клинического эффекта от пробиотиков специалистами Российской гастроэнтерологической ассоциации рекомендуется минимальная эффективная доза не менее 10⁸–10⁹ КОЕ [7, 9], что и послужило основой назначаемой дозировки. Так как прием пробиотического препарата осуществлялся на фоне противотуберкулезных средств, которые обладают антибактериальной активностью, то кратность применения минимальной дозы составила 2 раза в день для того, чтобы восстановить количественный уровень бифидобактерий и лактобацилл у пациентов. Для пробиотикотерапии фтизиатрических пациентов были использованы кишечнорастворимые капсулы, которые обеспечивают доставку пробиотических штаммов до кишечника. Однако по результатам микробиологических исследований у пациентов после одного курса пробиотикотерапии длительностью 21 день не происходило восстановление количественного уровня микроорганизмов рода Bifidobacterium. Титры Lactobacillus spp. достоверно повышались по сравнению с исходным уровнем, но были ниже, чем региональные значения нормы [25]. Можно предположить, что у пациентов с туберкулезом легких формируются стойкие микроэкологические нарушения кишечника, сопровождающиеся значительным снижением количественных уровней доминантных кишечных микросимбионтов и нарушением регуляторных механизмов, поэтому одного курса пробиотикотерапии недостаточно для восстановления титров микробиоты [3]. Лактобациллы и бифидобактерии обладают множеством механизмов, с помощью которых они регулируют количественный уровень других микроорганизмов [5, 12, 22]. В связи с этим под влиянием пробиотических штаммов родов Bifidobacterium, Lactobacillus могут восстанавливаться титры факультативно-анаэробных резидентов кишечного микробиома — типичной кишечной палочки и энтерококков [21]. У больных туберкулезом уровни E. coli lac+, E. faecalis, E. faecium остались низкими. Но после курса пробиотиков сократилось в 2 раза число пациентов, у которых в микробиоме регистрировали грибы рода Candida в диагностически значимых титрах, в 3 раза сократилось число лиц с лактозонегативными эшерихиями, то есть уменьшилась частота обнаружения условно-патогенных микроорганизмов.

Установлено, что даже один курс пробиотикотерапии оказывает положительное влияние на биологические свойства энтерококков. О роли этих микроорганизмов в кишечном микробиоме идут споры, так как их функции и свойства при эубиозе [4, 23, 18] и при микроэкологических нарушениях отличаются [6, 24]. Они могут быть продуцентами бактериоцинов, органических кислот — молочной, уксусной — с выраженным антибактериальным действием [18, 23]. Но при определенных условиях энтерококки способны проявлять вирулентность — синтезировать гемолизины, липазу, желатиназу, гиалуронидазу [10]. Они обладают свойством инактивировать низкомолекулярные биологически активные вещества организма человека [13]. По результатам исследования установлено, что несмотря на сохранение низких колонизационных уровней энтерококков изменились их биологические свойства. Достоверно снизилось число энтерококков, продуцирующих цитолизины (гемолизины), в 6 раз — желатиназу, в 2 раза — энтерококков, обладающих липазной активностью, то есть в целом уменьшились риски инвазии энтерококков через слизистую кишечника.

Под влиянием пробиотиков произошли изменения жирнокислотного состава мембраны энтерококков, от которого зависит ее физическое состояние и, соответственно, функциональные свойства [26]. Так, у E. faecalis достоверно увеличилось содержание ненасыщенной олеиновой кислоты. У E. faecium увеличилось количество олеиновой, линолевой и цис-7-пальмитолеиновой жирных кислот. Все эти жирные кислоты придают мембране микроорганизмов пластичность и текучесть [1, 20, 26]. По данным литературы ненасыщенные кислоты в составе мембраны микроорганизмов повышают гидрофобность клеточной поверхности и увеличивают адгезивные свойства, а также поддерживают активность белков метаболизма бактерий [1, 26]. Установлено, что у энтерококков после курса пробиотикотерапии в 2 раза увеличивалась активность продукции органических кислот при ферментации глюкозы, что подтверждает литературные данные и демонстрирует качественные молекулярные изменения, произошедшие под влиянием живых бактерийных препаратов.

Заключение

Результаты исследования показали, что однократный курс пробиотикотерапии многокомпонентным пробиотиком на основе бифидобактерий и лактобацилл у пациентов с туберкулезом легких и МЛУ возбудителя не позволяет восстановить количественный уровень резидентных микросимбионтов — бифидобактерий, лактобацилл, типичных эшерихий, но в целом положительно влияет на микробиом. Происходят качественные изменения микробиоты, характеризующиеся снижением частоты колонизации и титров условно-патогенных микроорганизмов с вирулентными свойствами. Установлены молекулярные изменения мембран энтерококков, связанные с ростом массы ненасыщенных жирных кислот, придающих оболочке пластичность и функциональную активность, что сопровождается увеличением кислотообразования. Продемонстрированы механизмы воздействия пробиотических штаммов на кишечный микробиом, основанные на регуляции количественных уровней и свойств условно-патогенной микробиоты, а также их влияние на состав и активность клеточной мембраны непатогенных энтерококков. Полученные данные перспективны для проведения рандомизированных клинических исследований по определению длительности и количества курсов пробиотикотерапиии у пациентов с туберкулезом легких, с последующей оценкой влияния пробиотиков на течение основного заболевания и эффективность противотуберкулезной терапии.

Благодарности

Коллектив исследователей выражает благодарность лаборантскому составу кафедры микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВО КемГМУ за техническое обеспечение микробиологических исследований.

About the authors

Larisa Yu. Otdushkina

State Medical Academy of Ministry of Health of Kemerovo

Email: lara276@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4126-4312

Assistant of the Department of Microbiology and Virology

Россия, 22а, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056

Yuliyа V. Zakharova

State Medical Academy of Ministry of Health of Kemerovo

Author for correspondence.
Email: yvz@bk.ru

MD, PhD, Professor, Department of Microbiology and Virology

Россия, 22а, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056

Artem A. Kholodov

State Medical Academy of Ministry of Health of Kemerovo

Email: artyomkass96@gmail.com

clinical resident, Phthisiatria Department

Россия, 22а, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056

Tatyana V. Pyanzova

State Medical Academy of Ministry of Health of Kemerovo

Email: pyanzova.tv@kemsma.ru

MD, PhD, Professor, Head Phthisiology Department

Россия, 22а, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056

References

Supplementary files