Changes in in vitro GM-CSF-exposured monocyte subset composition and phagocytic activity in children with infectious mononucleosis

Full Text

Введение

Исследования, связанные с механизмами регуляции иммунных процессов при вирусных инфекциях, постоянно привлекают пристальное внимание [1, 22]. Это связано с необходимостью понимания фундаментальных процессов иммунных реакций, определяющих быструю и полную элиминацию вируса, что позволит разрабатывать новые методы лечения вирусных инфекций. Одним из таких заболеваний является инфекционный мононуклеоз (ИМ). На современном этапе, ИМ остается одной из актуальных проблем педиатрии и детской инфектологии. В последнее десятилетие отмечается тенденция к росту заболеваемости, и ИМ входит в рейтинг инфекционных болезней, представляющих наибольшую экономическую значимость (в 2020 г. экономический ущерб составил 2 299 817,4 тыс. рублей), причем в возрастной структуре ИМ преобладают дети до 14 лет, составляя 72,8–76,9% [3, 6, 7].

В настоящее время отсутствует единая концепция патогенеза ИМЕНИ В основе патогенетических изменений при данном заболевании лежит лимфопролиферативный процесс, следствием которого является увеличение размеров периферических органов иммунной системы и количества различных субпопуляций лимфоцитов в крови [32, 40]. Так, особенностью Эпштейна–Барр вируса (ВЭБ) является его свойство стимулировать инфицированные В-лимфоциты к неопределенно долгой пролиферации, отмечена активация регуляторных Т-клеток, что тормозит пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов [3, 10, 43].

Моноциты являются клетками врожденного иммунитета, которые осуществляют важные функции в иммунопатогенезе вирусных инфекций. Доказано участие моноцитов в механизмах системного воспалительного ответа, развивающегося на фоне инфекционного процесса [17, 27, 39]. Моноциты также принимают участие в механизмах регуляции иммунных процессов при вирусных инфекциях [1, 15, 23]. Иммунорегуляторными факторами моноцитов являются цитокины, а также активные формы азота и кислорода, которые интенсивно продуцируются клетками при их активации. [19, 20, 38]. Важным фактором иммунопатогенеза вирусных инфекций является то, что активированные моноциты мигрируют в ткань и дифференцируются в макрофаги и дендритные клетки, которые помимо эффекторных функций являются регуляторными и антигенпрезентирующими клетками и способны индуцировать развитие адаптивного иммунного ответа [14, 21, 25].

Исходя из уровней экспрессии молекул CD14 и CD16,моноциты делятся на три субпопуляции. Клетки, экспрессирующие только высокоаффинный рецептор к бактериальному липополисахариду и липополисахарид-связывающим белкам (корецептор к TLR4,CD14) и не экспрессирующие низкоаффинный рецептор для IgG (FcãRIII — CD16), определяются как классические моноциты (CD14⁺⁺CD16^–, classical monocytes). Данная субпопуляция моноцитов принимает активное участие в процессах фагоцитоза, синтезирует провоспалительные цитокины [12, 37, 42]. Клетки, слабее экспрессирующие молекулу CD14,но также экспрессирующие CD16-антиген, классифицируются как неклассические моноциты (CD14⁺CD16⁺, non-classical monocytes). Данная фракция моноцитов является противовоспалительной, обладает высокой тропностью к эндотелию и миграционной активностью [11, 28, 30, 35]. Моноциты с фенотипом CD14⁺⁺CD16⁺ характеризуются как промежуточные (intermediate monocytes), обладают фагоцитарной активностью, способны процессировать и презентировать антигены, реализуют провоспалительную функцию [33].

Разработка новых подходов к терапии ИМ является одним из важнейших направлений современной медицины. Наиболее интересными в этой связи являются биологически активные регуляторные молекулы — цитокины, продуцируемые иммунокомпетентными клетками человека, обладающие выраженными плейотропными свойствами и участвующие в регуляции различных систем организма [1, 34]. К ним, в частности, относится гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF), уже нашедший применение в клинической практике, в том числе при лечении лейкозов и лейкопений [9, 24]. Считается, что основные иммунологические эффекты GM-CSF связаны с его влиянием на клетки моноцит/макрофагального ряда. В литературе доминирует мнение, что GM-CSF является провоспалительным цитокином, который способствует миграции макрофагальных клеток на периферию и поддерживает активацию М1-макрофагов [24, 26].

Целью исследования явилось изучение особенностей изменения субпопуляционного состава моноцитов и их фагоцитарной активности у детей с ИМ при воздействии GM-CSF in vitro.

Материалы и методы

Под нашим наблюдением находилось 84 ребенка в возрасте от 3 до 11 лет с ВЭБ-инфекцией, госпитализированных в инфекционное отделение КГБУЗ «Красноярская межрайонная детская клиническая больница № 1» г. Красноярска за период с 01.11.2019 г. по 09.06.2020 г. Критериями включения в исследование являлись: возраст пациентов мужского и женского пола от 3 до 6 лет и от 7 до 11 лет, диагноз ИМ средней и тяжелой степени. Критериями исключения из группы исследования явились больные с негладким течением ИМ (тяжелая нейтропения, тромбоцитопения и повышение аминотрансфераз более 5 норм), пациенты в возрасте до 3 лет и старше 11 лет, использование противовирусных и антибактериальных лекарственных средств, или препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием в течение последних 14 дней, предшествующих поступлению в стационар, наличие другого инфекционного заболевания, перенесенного в течение последнего месяца перед включением пациента в исследование, а также его отказ от участия (отказ от подписания информированного согласия на участие в клиническом исследовании). Все наблюдаемые нами пациенты имели положительный тест на ДНК ВЭБ в лимфоцитах крови и серологические маркеры острой ВЭБ-инфекции (ВЭБ-VCAIgM (+), ВЭБ-EA-DIgG (+)). Контрольную группу составили 40 практически здоровых детей аналогичного возрастного диапазона.

Взятие крови для проведения исследований проводили утром натощак с 8 до 9 часов. Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности Histopaque^®-1077 (Sigma-Aldrich, США) (ρ = 1,077). Моноциты выделяли путем адгезии к пластику (чашки Петри, ЗАО «Олданс») в средеRPMI-1640 в присутствии 10% аутологичной сыворотки. Выделенные моноциты разделяли на две пробы: контрольная (без GM-CSF) и опытная (50 нг GM-CSF на 1 мл клеточной суспензии). Определение субпопуляционного состава и фагоцитарной активности моноцитов в обеих пробах осуществляли после инкубации в течение 1 ч при температуре 37°С в CO₂-инкубаторе (Sanyo, Япония).

Субпопуляционный состав моноцитов и их фагоцитарную активность в обеих пробах исследовали методом проточной цитометрии с использованием прямой иммунофлуоресценции цельной периферической крови с моноклональными антителами (Beckman Coulter, США), меченных PE (phycoerythrin), ECD (phycoerythrin-Texas Red-X) и PC7 (phycoerythrin-cyanin 7) в следующей панели: CD14-PE/CD45-ECD/CD16-PC7. Распределение антител по каналам флуоресценции проводили в соответствие с принципами формирования панелей для многоцветных цитофлуориметрических исследований [2]. Пробоподготовку осуществляли по стандартной методике [18]. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США) Центра коллективного пользования КНЦ СО РАН [41]. В каждой пробе анализировали не менее 50 000 моноцитов.

Для оценки фагоцитарной активности моноцитов использовали FITC-меченный (fluorescein isothiocyanate) стафилококковый белок А [4]. Конъюгацию выполняли следующим образом: к стафилококковому белку А (разведен в бикарбонатном буфере, рН = 9,0) добавляли FITC (предварительно растворяли в ДМСО до концентрации 1 мкг/мл), инкубировали в темноте в течение 1 ч, трижды отмывали и по стандарту мутности доводили концентрацию белка до 1 млн/мл. К 100 мкл гепаринизированной крови добавляли 10 мкл FITC-меченного белка А и инкубировали 30 мин при температуре 37°С. Лизис эритроцитов проводили по безотмывочной технологии с использованием реагента VersaLyse (Beckman Coulter, США). Для гашения адгезированного на поверхности моноцитов FITC-меченного белка А к суспензии клеток добавляли раствор трипанового синего (0,2 мг/мл). Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США) Центра коллективного пользования КНЦ СО РАН. В каждой пробе анализировали не менее 50 000 моноцитов. Подсчитывали процент флуоресцирующих моноцитов (определяли как фагоцитарный индекс — ФИ) и средний уровень флуоресценции клеток (фагоцитарное число — ФЧ).

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартального размаха в виде 25 и 75 процентилей (Q₁ и Q₃). Достоверность различий между показателями независимых выборок (при сравнении показателей больных ИМ с контрольными значениями) оценивали по непараметрическому критерию Манна–Уитни (Mann–Whitney U test). Достоверность различий контрольных проб (без GM-CSF) с опытными пробами (с GM-CSF) определяли по критерию Вилкоксона (Wilcoxon matched pairs test). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., 2007).

Результаты

У больных ИМ детей в возрасте 3–6 лет на фоне снижения абсолютного количества моноцитов в крови выявляются атипичные моноциты (табл. 1). При этом обнаружены изменения субпопуляционного состава моноцитов, которые выражаются в увеличении процентного содержания CD14⁺⁺CD16⁺ клеток, но при снижении количества CD14⁺CD16⁺-моноцитов по сравнению с контрольными значениями. После воздействия GM-CSF и в группе здоровых детей и у больных ИМ наблюдается понижение процентного уровня CD14⁺⁺CD16⁺ клеток. Причем у больных детей содержание моноцитов с данным фенотипом остается значительно выше по сравнению с уровнем, выявленным у детей контрольной группы. Кроме того, у детей с ИМ в возрасте 3–6 лет под влиянием GM-CSF отмечается повышение процентного количества CD14⁺CD16⁺-моноцитов относительно исходного уровня, что приводит к увеличению содержания этих клеток и относительно контрольных значений.

Абсолютное количество моноцитов в крови у детей с ИМ в возрасте 7–11 лет также понижено по сравнению с контрольными показателями (табл. 2). При этом в крови у больных данной возрастной группы обнаружены атипичные моноциты. Особенностью субпопуляционного состава моноцитов у детей с ИМ является увеличение процентного содержания CD14⁺⁺CD16⁺-клеток на фоне повышения уровня CD14⁺CD16⁺-моноцитов по сравнению с контрольными значениями. После инкубации моноцитов с GM-CSF у больных ИМ в возрасте 7–11 лет выявляется пониженный уровень CD14⁺⁺CD16^–-клеток и более высокое содержание CD14⁺⁺CD16⁺- и CD14⁺CD16⁺-моноцитов по сравнению с контрольными значениями. Причем количество CD14⁺CD16⁺-клеток у детей с ИМ значительно повышается под влиянием GM-CSF и по сравнению с исходными значениями.

При сравнении величин показателей количества моноцитов и их субпопуляционного состава в двух возрастных группах обнаружено, что у детей контрольной группы в возрасте 7–11 лет снижено процентное содержание CD14⁺⁺CD16⁺- и CD14⁺CD16⁺-моноцитов без GM-CSF (р = 0,018 и р = 0,034 соответственно) (см. табл. 1 и 2). Различий в величинах данных показателей у детей с ИМ в зависимости от возраста не обнаружено.

 

Таблица 1. Субпопуляционный состав моноцитов крови у детей с инфекционным мононуклеозом в возрасте 3–6 лет [Ме (Q₁–Q₃)]

Table 1. blood monocytes subset composition in 3–6 year-old children with infectious mononucleosis [Ме (Q₁–Q₃)]

Показатели Parameters	Контрольная группа Control group	Больные ИМ Patients of IM	р
Моноциты, 109/л Monocytes, 109/L	1,06 (0,77–1,59)	0,45 (0,21–1,04)	0,028
Моноциты, % Monocytes, %	8,0 (6,0–11,0)	6,5 (4,0–10,0)
Атипичные моноциты, 109/л Atypical monocytes, 109/L	0,0	1,57 (1,00–2,99)	< 0,001
Атипичные моноциты, % Atypical monocytes, %	0,0	12,5 (7,0–20,0)	< 0,001
Контроль/Control
CD14++CD16–, %	71,93 (41,90–89,15)	83,66 (78,33–84,50)
CD14++CD16+, %	4,39 (2,99–8,11)	9,23 (5,97–12,66)	0,011
CD14+CD16+, %	23,72 (15,33–44,76)	9,31 (2,92–9,37)	< 0,001
GM-CSF
CD14++CD16–, %	88,86 (74,41–90,00)	78,34 (74,66–92,57)
CD14++CD16+, %	1,28 (0,56–2,87) р = 0,038	4,78 (3,29–6,11) р = 0,045	0,003
CD14+CD16+, %	9,57 (7,81–18,29)	17,88 (11,25–48,04) р = 0,004	0,022

 

При исследовании фагоцитарной активности моноцитов у больных ИМ 3–6 лет при отсутствии регуляторного воздействия для клеток с фенотипами CD14⁺⁺CD16^– и CD14⁺⁺CD16⁺ характерно снижение ФИ и ФЧ по сравнению с контрольными значениями (табл. 3). Кроме того, для моноцитов с фенотипом CD14⁺CD16⁺ выявляется пониженный уровень ФИ относительно значений, выявленных у детей контрольной группы. После воздействия GM-CSF на моноциты обнаружено повышение значений ФИ и ФЧ для клеток с фенотипом CD14⁺CD16⁺ у детей контрольной группы и для CD14⁺⁺CD16^– моноцитов у детей с ИМЕНИ При этом, если после воздействия GM-CSF уровень ФИ для CD14⁺⁺CD16^– клеток у больных детей 3–6 лет остается пониженным по сравнению с контрольными значениями, то величина ФЧ для моноцитов с данным фенотипом при ИМ повышается относительно контрольного диапазона. Уровни ФИ и ФЧ у больных детей после инкубации с GM-CSF для клеток с фенотипами CD14⁺⁺CD16⁺ и CD14⁺CD16⁺ снижены относительно контрольных значений.

 

Таблица 2. Субпопуляционный состав моноцитов крови у детей с инфекционным мононуклеозом в возрасте 7–11 лет [Ме (Q₁–Q₃)]

Table 2. blood monocyte subset composition in 7–11 year-old children with infectious mononucleosis [Ме (Q₁–Q₃)]

Показатели Parameters	Контрольная группа Control group	Больные ИМ Patients with IM	р
Моноциты, 109/л Monocytes, 109/L	1,11 (0,49–1,71)	0,38 (0,16–0,74)	0,033
Моноциты, % Monocytes, %	8,0 (5,0–11,5)	6,0 (3,5–8,5)
Атипичные моноциты, 109/л Atypical monocytes, 109/L	0,0	1,06 (0,11–2,79)	< 0,001
Атипичные моноциты, % Atypical monocytes, %	0,0	8,5 (1,0–19,5)	< 0,001
Контроль/Control
CD14+CD16–, %	81,77 (78,87–88,84)	89,05 (78,06–90,90)
CD14+CD16+, %	1,56 (0,81–3,76)	3,51 (2,25–15,16)	0,040
CD14+CD16+, %	15,82 (8,74–20,06)	6,68 (6,15–7,47)	0,009
GM-CSF
CD14+CD16–, %	83,48 (78,39–92,80)	70,69 (51,55–79,11)	0,010
CD14+CD16+, %	1,50 (0,90–3,95)	5,46 (4,28–8,03)	0,004
CD14+CD16+, %	14,81 (5,82–20,69)	23,07 (19,64–40,06) р < 0,001	0,036

 

Таблица 3. Фагоцитарная активность моноцитов крови у детей с инфекционным мононуклеозом в возрасте 1–3 года [Ме (Q₁–Q₃)]

Table 3. Blood monocyte phagocytic activity in 1–3 year-old children with infectious mononucleosis [Ме (Q₁–Q₃)]

Показатели Parameters	Контрольная группа Control group		Больные ИМ Patients with IM		р
	ФИ, % PI, %	ФЧ PN	ФИ, % PI, %	ФЧ PN
Контроль/Control
CD14++CD16	81,18 (76,96–93,28)	3,75 (3,20–4,58)	26,94 (22,02–27,11)	2,64 (2,59–2,68)	ФИ | PI = 0,002 ФЧ | PN = 0,042
CD14++CD16+	99,98 (99,56–99,99)	8,01 (6,12–10,19)	37,75 (37,30–47,41)	2,77 (2,42–4,44)	ФИ | PI < 0,001 ФЧ | PN < 0,001
CD14+CD16+	99,07 (97,79–99,46)	5,65 (4,98–6,49)	38,30 (23,07–42,62)	3,62 (2,66–9,86)	ФИ | PI < 0,001
GM-CSF
CD14++CD16	93,09 (80,81–93,24)	3,76 (3,63–4,70)	46,09 (34,23–64,07) р < 0,001	5,64 (4,89–8,03) р = 0,004	ФИ | PI = 0,003 ФЧ | PN = 0,009
CD14++CD16+	100,00 (100,00–100,00)	9,65 (8,27–11,40)	42,38 (34,22–50,60)	3,72 (2,84–6,06)	ФИ | PI < 0,001 ФЧ | PN < 0,001
CD14+CD16+	100,00 (99,17–100,00) р = 0,049	6,34 (5,52–11,10) р = 0,043	45,03 (33,12–52,52)	3,47 (2,41–6,78)	ФИ | PI < 0,001 ФЧ | PN = 0,029

Примечание. ФИ — фагоцитарный индекс (в %), ФЧ — фагоцитарное число (в о.е.).

Note. PI — phagocytic index (in %), PN — phagocytic number (in r.u.).

 

Таблица 4. Фагоцитарная активность моноцитов крови у детей с инфекционным мононуклеозом в возрасте 7–11 лет [Ме (Q₁–Q₃)]

Table 4. Blood monocyte phagocytic activity in 7–11 year-old children with infectious mononucleosis [Ме (Q₁–Q₃)]

Показатели Parameters	Контрольная группа Control group		Больные ИМ Patients with IM		р
	ФИ, % PI, %	ФЧ PN	ФИ, % PI, %	ФЧ PN
Контроль/Control
CD14++CD16–	24,34 (20,68–87,46)	3,74 (3,15–4,01)	22,37 (15,00–28,79)	2,77 (2,54–4,99)
CD14++CD16+	99,58 (66,66–100,00)	5,44 (2,64–7,89)	42,43 (26,42–47,12)	3,69 (1,95–5,87)	ФИ | PI = 0,004
CD14++CD16+	77,77 (66,11–98,12)	5,49 (5,12–6,36)	42,09 (23,34–52,68)	4,93 (2,92–7,28)	ФИ | PI = 0,006
GM-CSF
CD14++CD16–	25,97 (21,78–85,68)	3,55 (3,02–5,32)	48,34 (39,42–62,08) р = 0,006	6,36 (5,78–8,40) р = 0,003	ФЧ | PN = 0,007
CD14+CD16+	97,71 (61,90–100,00)	6,93 (3,73–9,19)	47,06 (37,68–62,20)	3,80 (3,11–5,86)	ФИ | PI = 0,008 ФЧ | PN = 0,047
CD14+CD16+	77,87 (62,35–98,62)	5,13 (4,05–6,33)	44,49 (28,67–60,03)	3,85 (2,86–6,44)	ФИ | PI = 0,009 ФЧ | PN = 0,002

Примечание. ФИ — фагоцитарный индекс (в %), ФЧ — фагоцитарное число (в о.е.).

Note. PI — phagocytic index (in %), PN — phagocytic number (in r.u.).

 

У больных ИМ в возрасте 7–11 лет в контрольных пробах наблюдается снижение величин ФИ для моноцитов с фенотипами CD14⁺⁺CD16⁺ и CD14⁺CD16⁺ относительно контрольных значений (табл. 4). При инкубации с GM-CSF только у больных детей выявляется повышение уровней ФИ и ФЧ для CD14⁺⁺CD16^– клеток. При этом, у детей с ИМ для клеток с фенотипом CD14⁺⁺CD16^– наблюдается увеличение ФЧ относительно контрольных значений, тогда как для моноцитарных фракций с фенотипами CD14⁺⁺CD16⁺ и CD14⁺CD16⁺ установлено понижение величин ФИ и ФЧ.

При сравнении показателей фагоцитарной активности у детей в зависимости от возраста обнаружено, что у детей контрольной группы в возрасте 7–11 лет понижена величина ФИ в контрольных пробах для моноцитов с фенотипами CD14⁺⁺CD16^– (р = 0,007) и CD14⁺CD16⁺ (р = 0,045) (см. табл. 3 и 4). Кроме того, у детей контрольной группы в возрасте 7–11 лет после инкубации с GM-CSF по сравнению с показателями детей 3–6 лет снижены величины ФИ для всех трех фракций моноцитов: для CD14⁺⁺CD16^–- (р = 0,006), CD14⁺⁺CD16⁺- (р = 0,048) и CD14⁺CD16⁺-клеток (р = 0,001). У детей с ИМ различий в показателях фагоцитарной активности моноцитов в зависимости от возрастной группы не обнаружено.

Обсуждение

Моноциты являются клетками врожденного иммунитета, которые при вирусных инфекциях реализуют иммуновоспалительные процессы, а их потомки (макрофаги и дендритные клетки) индуцируют реакции адаптивного иммунитета [1, 30]. При этом различные субпопуляции моноцитов, мигрируя в ткань, могут дифференцироваться в макрофаги и дендритные клетки с различной функциональной активностью [5, 13]. В то же время на фоне вирусных инфекций может меняться количество моноцитов, их субпопуляционный состав и функциональная активность [16, 33]. Действительно, нами установлено, что абсолютное количество моноцитов в крови у детей с ИМ снижено в возрастных группах 3–6 и 7–11 лет. Изменения субпопуляционного состава моноцитов при ИМ также не зависят от возрастной группы больных детей и определяются повышением процентного содержания промежуточных моноцитов (CD14⁺⁺CD16⁺) и снижением относительного количества неклассических (CD14⁺CD16⁺). Именно промежуточные моноциты активно экспрессируют антигены MHC II класса, при инфекции синтезируют и секретируют IL-1â и TNFá, а также интенсивно экспрессируют хемокиновые рецепторы CCR2 и CXCR4,что обеспечивает им миграцию в ткань, где они дифференцируются в макрофаги и дендритные клетки с высоким уровнем функциональной активности [13, 31]. Неклассические моноциты определяются как противовоспалительные клетки, усиливают мобилизацию и активность регуляторных Т-лимфоцитов, но слабее дифференцируются в макрофаги [30, 36]. Выявленная особенность перераспределения субпопуляционного состава моноцитов в направлении фракции промежуточных в острый период ИМ у детей характеризует повышение роли провоспалительных процессов, стимулируемых промежуточными моноцитами, и снижение активности противовоспалительных реакций, опосредованных функцией неклассических моноцитов. Также необходимо отметить, что если у здоровых детей в процессе онтогенеза выявляются особенности в субпопуляционном составе моноцитов (снижение процентного количества промежуточных и неклассических моноцитов), то на фоне острого ИМ подобные различия отсутствуют.

На фоне изменения субпопуляционного состава моноцитов выявляется и нарушение их фагоцитарной активности. Однако функциональная активность моноцитов при ИМ зависит от возрастной группы больных детей. Так, у детей 3–6 лет с ИМ снижены уровни ФИ и ФЧ для классических и промежуточных моноцитов, тогда как для фракции неклассических моноцитов определяется понижение величины ФЧ. Следовательно, у больных данной возрастной группы снижено количество провоспалительных клеток, вступающих в процесс фагоцитоза и снижена реактивность самих моноцитов. В то же время, как уже было отмечено выше, для неклассических моноцитов более характерна регуляторная функция, соответственно, у больных 3–6 лет в процесс фагоцитоза вступает меньшее количество клеток данной фракции, но их фагоцитарная активность остается на уровне нормы. У детей с ИМ 7–11 лет фагоцитарная активность классических моноцитов находится на уровне возрастной нормы, тогда как для субпопуляций промежуточных и неклассических моноцитов выявляется снижение количества клеток, вступающих в процесс фагоцитоза. Подобные различия в функциональной реакции моноцитов у детей с ИМ двух возрастных групп, по-видимому, связаны с онтогенетическими процессами в иммунной системе. В частности, в обзоре Moraes-Pinto M.I. и соавт. (2021) отмечено, что фагоцитирующие клетки у детей раннего возраста слабее экспрессируют адгезионные молекулы и обладают пониженной фагоцитарной активностью [29].

После инкубации с GM-CSF in vitro выявляется изменение субпопуляционного состава моноцитов как у здоровых детей, так и больных ИМЕНИ Так, у детей в возрасте 3–6 лет независимо от наличия/отсутствия ИМ в результате воздействия GM-CSF снижается количество промежуточных моноцитов относительно исходных значений, относительное содержание которых, тем не менее, остается повышенным у больных детей. Кроме того, в обеих возрастных группах у детей с ИМ после инкубации с GM-CSF повышалось процентное количество неклассических моноцитов, что привело к превышению их содержания у больных относительно контрольных значений. Также у больных детей 7–11 лет после инкубации с GM-CSF обнаружено снижение количества классических и сохранение повышенного уровня промежуточных моноцитов относительно контрольных значений. Необходимо отметить, что в настоящее время основной концепцией формирования субпопуляций моноцитов является линейная дифференцировка: классические моноциты → промежуточные → неклассические [14, 31, 42]. Следовательно, механизм воздействия GM-CSF на моноциты реализуется в перераспределении субпопуляционного состава при стимуляции их дифференцировки.

Часовая инкубация моноцитов с GM-CSF также повлияла и на их фагоцитарную активность. Так, у здоровых детей 3–6 лет под после инкубации моноцитов с GM-CSF повысилась фагоцитарная активность неклассических моноцитов (по показателям ФИ и ФЧ). В то же время у детей с ИМ обеих возрастных групп инкубация с GM-CSF привела к увеличению функциональной активности классических моноцитов (также по показателям ФИ и ФЧ). Причем, если у больных 3–6 лет ФИ классических моноцитов после воздействия GM-CSF также остается пониженным относительно контрольных значений (как и в контрольных пробах), то ФЧ данной фракции клеток у больных 3–6 и 7–11 лет значительно превышает контрольные уровни. Фагоцитарная активность промежуточных и неклассических моноцитов у детей обеих возрастных групп после инкубации с GM-CSF остается пониженной.

Можно заключить, что GM-CSF влияет и на фагоцитарную активность моноцитов у детей. Известно, что среди клеток крови именно неклассические моноциты являются основными продуцентами GM-CSF [21]. Однако реакция на фактически аутокринную стимуляцию функциональной активности выявлена только у здоровых детей 3–6 лет, что, по-видимому, связано с онтогенетическими особенностями иммунной системы. В то же время у детей с ИМ, независимо от возрастной группы, реакция на GM-CSF выявляется только для классических моноцитов, то есть наименее зрелой фракции моноцитов крови, но реализующих провоспалительные функции и фагоцитарную активность.

Кроме того, выявляются онтогенетические особенности изменения фагоцитарной активности моноцитов. У детей контрольной группы в возрасте 7–11 лет в контрольных пробах снижено количество CD14⁺⁺CD16^–- и CD14⁺CD16⁺-моноцитов, вступающих в фагоцитоз. В то же время после инкубации с GM-CSF у здоровых детей старшей возрастной группы, по сравнению с показателями здоровых детей младшей возрастной группы, снижено количество всех трех субпопуляций моноцитов, вступающих в процесс фагоцитоза. При этом каких-либо онтогенетических изменений у больных ИМ не обнаружено. Известно, что в большинстве случаев в раннем детстве первичное инфицирование ВЭБ протекает бессимптомно или со скудной симптоматикой, тогда как у детей раннего школьного возрастов в 45% случаев возникает типичная клиническая форма ИМ [8]. Исходя из онтогенетических и иммунопатофизиологических особенностей субпопуляционного состава моноцитов и их фагоцитарной активности у детей в возрасте 3–6 и 7–11 лет, можно предположить, что симптоматика ИМ (прежде всего, связанная с иммуновоспалительными процессами), в большей степени, определяется исходным состоянием в иммунной системе, тогда как при инфекционном заболевании онтогенетические особенности нивелируются за счет реакции иммунной системы на возбудитель.

Заключение

Таким образом, у детей на фоне развития ИМ меняется субпопуляционный состав моноцитов в крови и нарушается их фагоцитарная активность. Изменения субпопуляционного состава моноцитов на фоне острого ИМ не зависят от возраста (3–6 и 7–11 лет) и характеризуются повышением количества провоспалительных (промежуточных) моноцитов и снижением содержания противовоспалительных (неклассических) моноцитов. Особенности нарушения фагоцитарной активности моноцитов у детей с ИМ зависят от возраста. У больных 3–6 лет снижена фагоцитарная активность всех субпопуляций моноцитов, тогда как у детей с ИМ 7–11 лет понижена фагоцитарная активность промежуточных и неклассических моноцитов. При воздействии GM-CSF in vitro на моноциты у больных ИМ независимо от возраста значительно повышается уровень противовоспалительных моноцитов, в то время как фагоцитарная активность клеток меняется слабее. У детей 3–6 лет после инкубации с GM-CSF повышается ФЧ для классических моноцитов, тогда как ФИ данной фракции моноцитов остается без изменений. У больных ИМ 7–11 лет также только у классических моноцитов повышается уровень ФИ. Приведенные результаты определяют научную и клиническую ценность изучения механизмов влияния GM-CSF на клетки иммунной системы и доказывают, что данный цитокин может быть использован в новой иммунотерапевтической стратегии лечения ИМ.

About the authors

Andrei A. Savchenko

Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of Medical Problems of the North

Email: aasavchenko@yandex.ru

DSc (Medicine), Professor, Head of the Laboratory of Cellular-Molecular Physiology and Pathology

Russian Federation, 660022, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 3G

Galina Petrovna Martynova

Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: aasavchenko@yandex.ru

DSc (Medicine), Professor, Head of the Department of Pediatric Infectious Diseases

Russian Federation, 660022, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 1A

Lyubov A. Ikkes

Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: aasavchenko@yandex.ru

assistant of the department of childhood infectious diseases with a PE-course of FSBEI of Higher Education

Russian Federation, 660022, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 1A

Alexandr G. Borisov

Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of Medical Problems of the North

Email: 2410454@mail.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Cellular-Molecular Physiology and Pathology

Russian Federation, 660022, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 3G

Igor V. Kudryavtsev

Institute of Experimental Medicine; Pavlov First Saint Petersburg State Medical University; Far Eastern Federal University

Author for correspondence.
Email: igorek1981@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Cell Immunology Laboratory, Department of Immunology, Assistant Professor  Department of Immunology

Russian Federation, 197376, St. Petersburg, Academician Pavlov str.,12; St. Petersburg; Vladivostok

Vasilij D. Belenjuk

Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center» of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Scientific Research Institute of Medical Problems of the North

Email: dyh.88@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Cellular-Molecular Physiology and Pathology

Russian Federation, 660022, Krasnoyarsk region, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznjaka str., 3G

References

Supplementary files