Molecular genetic characterization of the epstein–Barr Virus: a relationship with the clinical features of pediatric infectious mononucleosis

Maria I. Popkova; Попкова Мария Игоревна; Oleg V. Utkin; Уткин Олег Владимирович; Elena N. Filatova; Филатова Елена Николаевна; Daria A. Bryzgalova; Брызгалова Дарья Алексеевна; Nikolai A. Sakharnov; Сахарнов Николай Александрович; Evgeniya A. Soboleva; Соболева Евгения Андреевна; Lubov V. Nazarova; Назарова Любовь Владимировна

doi:10.15789/2220-7619-MGC-2121

Molecular genetic characterization of the epstein–Barr Virus: a relationship with the clinical features of pediatric infectious mononucleosis

Authors: Popkova M.I.¹, Utkin O.V.¹, Filatova E.N.¹, Bryzgalova D.A.¹, Sakharnov N.A.¹, Soboleva E.A.², Nazarova L.V.³
Affiliations:
1. Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing
2. Nizhny Novgorod Regional Center for the Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases
3. Infectious Clinical Hospital No. 23
Issue: Vol 13, No 3 (2023)
Pages: 481-496
Section: ORIGINAL ARTICLES
Submitted: 16.01.2023
Accepted: 27.03.2023
Published: 26.06.2023
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/2121
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-MGC-2121
ID: 2121

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. Infectious mononucleosis (IM) is an high priority viral infection in children. Epstein-Barr virus (EBV) is the main etiological agent of IM. EBV is classified into two main types — EBV-1 and EBV-2. In addition, different variants of the virus are isolated based on individual genes, among which the LMP-1 gene and the oncoprotein it encodes are the most well known. So far, the study of the clinical significance of EBV genetic diversity in EBV-IM in children in Russia has not been conducted. The aim of the study was to evaluate a relationship between EBV LMP-1 molecular genetic variants and clinical and laboratory manifestations of IM in children.

Materials and methods. The material of the study was presented by blood leukocyte and saliva samples of children aged 1–17 years with EBV-IM (n = 69). A total of 132 EBV isolates were studied. For differential detection of EBV-1/EBV-2, we used a previously optimized one-round PCR variant with electrophoretic detection of amplification products in agarose gel. The nucleotide sequences of the C-terminal region of the LMP-1 gene were determined by Sanger sequencing followed by analysis of the obtained sequences using the MEGA X software. Multiple Factor Analysis was used to search for the relationship between LMP-1 variants and clinical and laboratory manifestations of IM (32 signs and 8 groups of signs).

Results. It was established that only one type of virus, EBV-1, was identified in all children. At the same time, the severity of clinical manifestations of EBV-IM in children varied significantly (from 15.5 to 35.5 scores in total). Molecular genetic analysis of the sequences of the LMP-1 C-terminal region in Nizhny Novgorod region EBV isolates demonstrated a significant heterogeneity of the viral population, which was not limited only to their grouping according to known variants. According to the frequency of detection, B95-8 was the dominant variant of LMP-1 (60.6±6.0% of cases), other variants were less common (China 1, NC, Med– and China 1+В95-8). It was found that EBV-IM proceeded more easily and with less severity of the intoxication syndrome in cases of infection with a virus having the molecular genetic profile of EBV-1/B95-8, in particular EBV-1/B95-8/E214D. Conversely, EBV-1/Med–, as well as EBV-1/Med–/L338S, EBV-1/Med–/S229T, EBV-1/China 1/L338S and EBV-1/NC/S229T profiles were associated with more severe infection.

Conclusion. For the first time, the influence of the genetic diversity of EBV on the clinical manifestations of IM in children was revealed. In the context of the tasks to be solved in this study, it is necessary to conduct a larger-scale and systemic studies in different territories of Russia.

Keywords

Epstein-Barr virus, infectious mononucleosis, EBV-1, EBV-2, LMP-1, sequencing, PCR, genovariants

Full Text

Введение

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) — острое антропонозное вирусное заболевание, сопровождающееся лихорадкой, поражением ротоглотки, лимфатических узлов, печени и селезенки и специфическими изменениями гемограммы [8, 12]. В Российской Федерации (РФ) в последнее десятилетие отмечается значимый экономический ущерб, обусловленный ростом заболеваемости ИМ [9, 10, 21]. При этом в возрастной структуре заболевших по-прежнему преобладают дети до 14 лет [9]. Основным этиологическим агентом ИМ является вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ), на долю которого приходится в среднем 76,6% случаев [5]. По литературным данным ИМ характеризуется выраженным полиморфизмом клинических проявлений. Описаны особенности клинического течения ИМ в зависимости от этиологии, в разрезе разных возрастных групп, а также в сравнении первичной ВЭБ-инфекции или ее реактивации [1, 4, 5, 6, 11, 22, 23]. Однако остается недостаточно изученным вопрос о взаимосвязи различий клинико-лабораторных проявлений ИМ с молекулярно-генетическими характеристиками самого вируса.

Согласно современной таксономии вирусов ВЭБ относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Gammaherpesvirinae, роду Lymphocriptoviruses, виду Human gammaherpesvirus 4 [38]. Анализ мировой литературы показал, что популяция ВЭБ отличается выраженной генетической гетерогенностью [15]. Единой, унифицированной системы, учитывающей все генетическое разнообразие ВЭБ, не существует. Основной классификацией остается разделение вируса на два типа — ВЭБ-1 и ВЭБ-2 (на основе последовательностей генов ядерного антигена вируса, а именно EBNA-2 и EBNA-3) [32, 33, 36, 43]. Показано, что разные типы вируса отличаются по географическому распределению, тропности к В- и Т-клеткам, фенотипическим характеристикам in vitro [25, 26, 30, 31, 36, 43, 44, 48]. Информации о связи заболеваний с определенным типом ВЭБ недостаточно. В РФ изучение типов ВЭБ ограничивается единичными работами, посвященными только оценке распространенности ВЭБ-1 и ВЭБ-2 среди взрослого условно здорового населения [3, 20].

Основное внимание зарубежных и российских исследователей сосредоточилось на изучении структурно-функционального полиморфизма наиболее вариабельного участка генома ВЭБ — гена латентного мембранного протеина 1 (LMP-1) и кодируемого им одноименного онкобелка, а также поиске САО-подобных изолятов вируса в контексте ВЭБ-ассоциированных онкологических заболеваний у взрослых [2, 7, 17, 19, 24, 28, 37, 39, 46]. Преимущественно использовалась наиболее популярная классификация вариантов ВЭБ по R.H. Edwards и соавт., основанная на характерных аминокислотных (а.к.) паттернах С-концевой области LMP-1 [34]. В современный период достаточно широко изучаются особенности распространения вариантов LMP-1 на разных территориях при широком спектре доброкачественных и злокачественных заболеваний, продолжается интенсивный поиск генетических подтипов ВЭБ высокого онкогенного риска. При этом вопросу изучения молекулярно-генетической характеристики вируса при ВЭБ-инфекции у детей уделяется недостаточно внимания. Оценка клинической значимости генетического разнообразия ВЭБ при ИМ у детей в РФ до сих пор не проводилась.

Цель исследования — оценить взаимосвязь молекулярно-генетических вариантов LMP-1 ВЭБ с клинико-лабораторными проявлениями ИМ у детей.

Материалы и методы

Характеристика групп исследования. Проведен молекулярно-генетический анализ 132 изолятов ВЭБ из лейкоцитов крови и слюны, полученных от 69 детей в возрасте 1–17 (медиана 5 [2; 10]) лет, находившихся на лечении в ГБУЗ НО «Детская инфекционная больница № 8 г. Нижнего Новгорода» с диагнозом «инфекционный мононуклеоз, вызванный ВЭБ» (ВЭБ-ИМ).

Соблюдение этических требований. Информированное согласие родителей или опекунов на проведение исследовательской работы в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) было получено лечащими врачами медицинской организации. Работа получила одобрение на заседании локального этического комитета ФБУН ННИИЭМ имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (Протокол № 3 от 11.11.2021 г.).

Сбор биологического материала. Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь, стабилизированная К3ЭДТА, и нестимулированная смешанная слюна (далее слюна). В работе использовались остаточные количества образцов цельной крови, полученных для проведения стандартных диагностических исследований в клинической практике. Сбор биоматериала производили однократно при поступлении в стационар.

Определение ДНК ВЭБ. Для получения фракции лейкоцитов периферической крови использовали реагент «Гемолитик» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Пробоподготовку слюны выполняли оптимизированным нами ранее способом [16]. Выделение тотальной нуклеиновой кислоты проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) с модификациями [14, 16]. Выявление и количественное определение ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови и слюне выполняли с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с применением коммерческого набора «АмплиСенс^® EBV/CMV/HHV6-cкрин-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) на амплификаторе Rotor-Gene Q 5plex HRM (Qiagen, Германия). Лабораторный протокол на всех этапах ПЦР-РВ соблюдали согласно инструкции производителя.

Дифференциальная детекция ВЭБ-1/ВЭБ-2 методом ПЦР. Для раздельной детекции основных типов ВЭБ (ВЭБ-1 и ВЭБ-2) применен оптимизированный нами ранее вариант однораундовой ПЦР на основе гена EBNA-2 [14, 16].

ПЦР-анализ фрагмента гена LMP-1 ВЭБ. Положительные образцы, содержащие ДНК ВЭБ (по результатам ПЦР-РВ), были использованы для амплификации С-концевого фрагмента гена LMP-1 вируса методом ПЦР. ПЦР-анализ проводили не в двухраундовой «полугнездовой» ПЦР, описанной в статье M.K. Smatti и соавт. [47], а в однораундовом варианте. При этом использовали праймеры, ранее предназначавшиеся для первого раунда: А1 5′-AGT CAT AGT AGC TTA GCT GAA-3′ и A2 5′-CCA TGG ACA ACG ACA CAG T-3′ [47]. Состав реакционной смеси общим объемом 25 мкл включал следующие реагенты: праймеры (5 пкМ в реакцию) (ДНК-синтез); 5-кратный Taq Red буфер 12,5 мМ Mg²⁺ («Евроген»); 5 е.а. Taq-F ДНК-полимеразы (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора); смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (до конечной концентрации 0,1 мМ) (Евроген); деионизированную воду I типа (Milli-Q Integral 3, Франция). В качестве матрицы использовали выделенную ДНК в объеме 5 мкл на реакцию. Условия амплификации: инициация 95°С – 15 мин,40 циклов (95°С – 5 мин,53°С – 1 мин,72°С – 1 мин.), финальная элонгация 72°С – 10 мин. Амплификацию проводили на амплификаторе MaxyGene Gradient (Axygen, США). В результате амплифицировали фрагмент С-концевой области гена LMP-1 размером 602 п.н. [47]. Продукты ПЦР-амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,8% агарозном геле, содержащем бромид этидия (0,02% по объему). Результаты детектировали на трансиллюминаторе InGenius 3 с использованием программного обеспечения GeneSys (Syngene, Великобритания).

Секвенирование по Сэнгеру фрагмента гена LMP-1 ВЭБ. Выделение и очистку полученных ампликонов LMP-1 из агарозного геля проводили с помощью коммерческого набора «ФБиоГель» (Фрактал Био) в соответствии с инструкцией производителя. Конечный объем элюата составил 30 мкл. Концентрацию очищенной ДНК определяли с помощью спектрофотометра Eppendorf BioPhotometer plus (Eppendorf, Германия). В среднем количество ДНК составляло 150–300 нг на образец. Для реакции мечения прямой и обратной последовательностей ДНК флуоресцентными терминальными нуклеотидами использовался набор «Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, США). Лабораторный протокол на всех этапах анализа соблюдали согласно инструкции производителя. Очистку меченой ДНК LMP-1 от компонентов реакционной смеси проводили с использованием ацетата натрия (рН = 7,0) и изопропанола. Очищенный фрагмент элюировали в 20 мкл HiDi формамида (Applied Biosystems, США). Определение нуклеотидных последовательностей ДНК LMP-1 осуществлялось на генетическом анализаторе AB-3500 genetic analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием оригинального программного обеспечения 3500 Data Collection Software v. 1.0.

Биоинформационный анализ. Биоинформационный анализ данных проводился с помощью открытого программного обеспечения MEGA X (Mega Software, США)¹. Полученные исходные нуклеотидные последовательности выравнивались по алгоритму ClustalW. В качестве референсных служили полученные из базы данных GenBank² последовательности анализируемого участка гена LMP-1 штаммов B95-8 (V01555.2), China 1 (AY337723.1), China 2 (AY337724.1), Med– (AY337721.2), Med+ (AY337722.2), NC (AY337726.2), Alaskan (AY337725.1). Нуклеотидные последовательности полученных изолятов ВЭБ и референтов транслировались в аминокислотные последовательности по стандартному генетическому коду. Принадлежность исследуемых последовательностей LMP-1 к определенным вариантам в рамках классификации R.H. Edwards и соавт. [34] устанавливалась по наличию сигнатурных аминокислотных замен (согласно табл. 1 в [34]).

Полученные нуклеотидные последовательности нижегородских изолятов ВЭБ от больных ВЭБ-ИМ детей депонированы в базе данных GenBank/NCBI от 09.08.2022 г. под регистрационными номерами OP105256-OP105376.

Статистическая обработка данных. Статистический анализ выполнен на основе языка программирования R версия 4.1.2 (The R Foundation for Statistical Computing, Inc)³ и среды RStudio версия 2022.02.0+443 «Prairie Trillium» Release (RStudio, PBC)⁴. Числовые данные описывали в виде Me [Q1; Q3], где Ме — медиана, а Q1 и Q3 — первый и третий квартиль соответственно. Долю описывали с указанием стандартного отклонения процентной доли (P±óp), в %. Наличие взаимосвязей между факторными переменными оценивали с применением точного теста Фишера. Различия значений количественных переменных в группах сравнения оценивали с применением рангового критерия Манна–Уитни с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественные сравнения. Различия анализируемых признаков описывали с указанием Ä (ДИ = CI.ll–CI.ul), где Ä — разница положений распределений, CI.ll и CI.ul — нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала (ДИ) разницы. Результат считали статистически значимым при скорректированном р < 0,05.

При оценке взаимосвязи особенностей клинического течения ВЭБ-ИМ с молекулярно-генетическими вариантами LMP-1 вируса из всей совокупности клинико-лабораторных данных о каждом пациенте поэтапно по разработанному нами алгоритму были выделены три категории признаков: исходные, анализируемые и значимые. На первом этапе исходные качественные параметры (клинические симптомы) выражали в ранговых единицах (категориях) 0/1/2, при этом оценку степени тяжести проводили по алоритму О.А. Поповой и соавт. [13], где 0 обозначал отсутствие или слабо выраженный признак,1 — умеренно выраженный признак,2 — значительно выраженный признак. Количественные параметры (результаты лабораторных исследований) для нивелирования возможных различий, обусловленных полом и возрастом пациентов, также выражали в категориях (–1)/0/1, где (–1) соответствовал значениям ниже возрастной и половой нормы,0 — значениям в пределах возрастной и половой нормы,1 — значениям, превышающим возрастную и половую норму.

По результатам нормализации неизменяющиеся признаки из последующего анализа исключались. Оценка взаимосвязи проводилась на основе анализируемых параметров (32 признака и сформированные из них 8 групп признаков), представленных в табл. 1.

Таблица 1. Группировка анализируемых клинических и лабораторных признаков ВЭБ-ИМ у детей и их обозначение

Table 1. Grouping of analyzed clinical and laboratory signs of EBV-IM in children and their designation

Группа признаков и ее обозначение

Group of signs and its designation

Клинические и лабораторные признаки

Clinical and laboratory signs

Обозначение признаков

Signs designation

Биохимические показатели крови — БХ

Biochemical blood indicators — BC

Глюкоза

Glucose

Синдром цитолиза — ЦИТ

Cytolysis syndrome — CYT

Аланинаминотрансфераза

Alanine aminotransferase

Аспартатаминотрансфераза

Aspartate aminotransferase

Билирубин общий

Bilirubin total

Билирубин прямой

Bilirubin direct

Билирубин непрямой

Bilirubin indirect

Гепатоспленомегалия — ГС

Hepatosplenomegaly — HS

Увеличение размера печени

Liver enlargement

Увеличение размера селезенки

Spleen enlargement

Лимфаденопатия — ЛА

Lymphadenopathy — LA

Увеличение лимфатических узлов

Lymph nodes enlargement

Гематологические показатели — ГЕМ

Hematological indicators — HEM

Эритроциты

Erythrocytes

Тромбоциты

Platelets

Гемоглобин

Hemoglobin

Скорость оседания эритроцитов

Erythrocytes sedimentation rate

Синдром поражения рото- и носоглотки — ТОН

Syndrome of oropharyngeal and nasopharyngeal lesions — TON

Отечность лица

Puffiness of the face

Увеличение миндалин

Tonsil enlargement

Гиперемия

Hyperemia

Налеты

Plaques

Заложенность носа

Nasal congestion

Храп

Snore

Синдром интоксикации — ТОКС

Syndrome of intoxication — TOX

Вялость

Lethargy

Беспокойство

Anxiety

Снижение аппетита

Decreased appetite

Нарушение сна

Sleep disturbance

Приглушенные тоны сердца

Muffled heart sounds

Тахикардия

Tachycardia

Рвота

Vomit

Лейкоцитарные показатели — ЛЕЙ

Leukocyte indicators — LEU

Лейкоциты

Leukocytes

Палочкоядерные нейтрофилы

Stab neutrophils

Сегментоядерные нейтрофилы

Segmented neutrophils

Моноциты

Monocytes

Лимфоциты

Lymphocytes

Ядерный индекс интоксикации

Nuclear Intoxication Index

Для оценки комплекса анализируемых признаков применяли множественный факторный анализ (Multiple Factor Analysis, МФА) [27]. При этом использовали два первых измерения (две первые компоненты), суммарно объясняющих 32,36% дисперсии. Значимость переменных групп признаков и каждого признака по отдельности оценивали, анализируя их вклад (contribution). Значимыми считали переменные, чей вклад в компоненты превышал средний рассчитанный (вклад, который делала бы каждая переменная при условии равенства их значимости). Незначимые переменные из дальнейшего анализа исключали.

Среди полученных и охарактеризованных по вариантам (согласно классификации R.H. Edwards и соавт. [34]) и субвариантам (на основе выявленных делеций, аминокислотных замен и числа тандемных повторов) нижегородских изолятов ВЭБ для последующего анализа отбирали только такие, которые выявлялись у трех и более больных детей. Для каждого варианта и субварианта LMP-1 оценивали различия суммы баллов по группам признаков или по совокупности установленных значимых признаков. Баллы признаков суммировали по модулю.

Результаты

Молекулярно-генетическая характеристика ВЭБ у детей при ВЭБ-ИМ

Анализ молекулярно-генетического разнообразия нижегородских изолятов ВЭБ из лейкоцитов крови и слюны детей при ВЭБ-ИМ проводился по нескольким направлениям: определение типа вируса, варианта и субварианта LMP-1. По результатам типирования ВЭБ на основе гена EBNA-2 была выявлена принадлежность всех полученных изолятов только к одному типу вируса — ВЭБ-1.

Также во всех положительных на ДНК ВЭБ (по результатам ПЦР-РВ) пробах была проведена амплификация С-концевого фрагмента гена LMP-1 с последующим секвенированием продуктов ПЦР-реакции. Всего было получено 123 сиквенса С-концевого фрагмента гена LMP-1 ВЭБ от 66 пациентов с ВЭБ-ИМЕНИ Результативность секвенирования ДНК из лейкоцитов крови и слюны составила 93,2% (123 из 132 анализированных последовательностей). Для последующего анализа полученные нуклеотидные последовательности были транслированы в аминокислотные.

На основе классификации ВЭБ по R.H. Edwards и соавт. [34] в нижегородских изолятах вируса у детей с ВЭБ-ИМ было выявлено 4 из 7 известных вариантов LMP-1, а именно: В95-8, China 1, NC и Med. Отметим, что изоляты LMP-1 Med были представлены исключительно вариантом Med– (не содержащий САО-подобную делецию 10 а.к. в координатах 346–355 а.к.). Варианты LMP-1 Med+, China 2, China 3 и Alaskan не были обнаружены ни в одном исследованном образце.

По частоте выявления доминирующим вариантом являлся В95-8 (60,6±6,0% детей с ВЭБ-ИМ). Значительно реже встречались варианты China 1 (16,7±4,6%), NC (16,7±4,6%) и Med– (4,5±2,5%). Коинфицирование разными вариантами (в лейкоцитах крови — China 1, в слюне — B95-8) было установлено только в одном случае ВЭБ-ИМЕНИ У остальных пациентов на момент постановки диагноза в лейкоцитах крови и слюне был выявлен один и тот же вариант LMP-1.

Последующий анализ последовательностей С-концевого участка LMP-1 нижегородских изолятов ВЭБ продемонстрировал выраженное молекулярно-генетическое разнообразие за счет вариабельности области тандемных повторов, наличия делеций и аминокислотных замен (табл. 2).

Таблица 2. Молекулярно-генетическая характеристика C-концевой области LMP-1 нижегородских изолятов ВЭБ от детей при инфекционном мононуклеозе (относительно прототипного штамма В95-8)

Table 2. Molecular and genetic characteristics of LMP-1 C-terminal region in Nizhny Novgorod region EBV isolates from children with infectious mononucleosis (relative to the prototype strain B95-8)

Варианты LMP-1 ВЭБ/EBV LMP-1 variants

В95-8

(n = 40)

China 1

(n = 11)

Med–

(n = 3)

(n = 11)

Референсные последовательности

Reference sequences

Номер регистрации в GenBank

GenBank accession number

V01555.2

AY337723.1

AY337721.2

AY337726.2

Аминокислотные замены

Amino acid substitutions

Прототипный штамм с нулевым уровнем мутаций

Zero Mutation Prototype Strain

G212S

S309N

Q322N

Q334R

L338S

S366T

S229T

S309N

Q322E

Q334R

L338S

H352R

S366T

G212S

L306Q

S309N

S313P

Q322T

G331Q

L338P

H352N

H358P

S366T

Делеции

Deletions

5 а.к.

а.к. 276–280

10 а.к.

а.к. 346–355

5 аa.

aa. 276–280

10 aa.

aa. 346–355

5 а.к.

а.к. 276–280

5 аa.

aa. 276–280

5 а.к.

а.к. 276–280

5 аa.

aa. 276–280

Тандемные повторы

Tandem repeats

4,5

4,0

Нижегородские изоляты ВЭБ

EBV isolates from Nizhny Novgorod region

Перечень аминокислотных замен (n)

List of amino acid substitutions (n)

A207P (1)

D209H (5)

D210A (1)

D210Y (1)

G212S (37)

E214D (3)

E214K (2)

E214N (1)

H225R (2)

G243A (1)

D250N (1)

G252A (1)

D296E (1)

G315E (1)

D317Y (1)

E328Q (40)

D349N (2)

G351S (1)

H352K (1)

H352R (2)

G354S (3)

G355N (1)

G355V (1)

D356N (1)

P357S (1)

T361K (1)

T361M (1)

L364W(1)

S366A (1)

S366T (39)

G212S (11)

E214Q (5)

D288G (1)

S309N (11)

D317Y (1)

Q322N (11)

E326D (2)

Q334R (11)

L338S (11)

S366A (1)

S366T (11)

G212S (3)

S229T (3)

G246E (1)

G252A (1)

D277G (2)

D282G (2)

N289D (1)

D293G (1)

D304G (1)

S309N (3)

Q322D (1)

Q322E (2)

V327D (1)

D333H (1)

Q334K (1)

Q334R (2)

P337A (1)

L338S (3)

D349N (1)

H352R (2)

S366T (3)

G212S(11)

S229T (2)

G243A (1)

D250N (10)

L306Q (11)

S309N (11)

S313P (11)

Q322T (11)

G331Q (10)

Q334R (2)

G335D (5)

L338P (11)

H352N (9)

H358P (9)

P357Q (1)

T361M (1)

S366T (11)

G368S (1)

Делеции (n)

Deletions (n)

21 а.к. (1)

а.к. 335–355

21 аa. (1)

aa. 335–355

5 а.к. (11)

а.к. 276–280

10 а.к. (11)

а.к. 346–355

5 аa. (11)

aa. 276–280

10 aa. (11)

aa. 346–355

2 а.к. (1)

а.к. 215–216

5 а.к. (3)

а.к. 276–280

2 аa. (1)

aa. 215–216

5 аa. (3)

aa. 276–280

5 а.к. (11)

а.к. 276–280

5 аa. (11)

aa. 276–280

Тандемные повторы (n)

Tandem repeats (n)

4,5 (38)

5,5 (2)

3,0 (1)

5,0 (9)

6,0 (1)

4,0 (1)

5,0 (1)

7,0 (1)

3,0 (5)

3,5 (1)

4,0 (3)

6,0 (2)

Примечание. Жирным шрифтом выделены молекулярно-генетические признаки, которые совпадали с соответствующей референсной последовательностью. В скобках указано число пациентов (n).

Note. Molecular genetic characteristics that matched the corresponding reference sequence are shown in bold. The number of patients is shown in parentheses (n).

На основе полученных данных были отобраны молекулярно-генетические характеристики LMP-1 ВЭБ, которые встречались у трех и более человек. Именно они составили основные анализируемые субварианты. Одни из них отличались специфичностью для конкретного варианта LMP-1, обусловливая внутри- и межвариантные различия в исследуемой области гена, другие были вариант-независимыми (выявлялись с разной частотой в нескольких вариантах вируса). Так, в число анализируемых вариант-специфичных характеристик нижегородских изолятов LMP-1 В95-8 вошли аминокислотные замены D209H, E214D, E328Q, G354S. Наоборот, аминокислотная замена S309N и делеция 5 а.к. (а.к. 276–280) присутствовали во всех нижегородских изолятах China 1, Med– и NC, но не в B95-8. Только в последовательностях China 1 были обнаружены делеция 10 а.к. (а.к. 346–355) и аминокислотные замены E214Q, Q332N, а в NC — L306Q, S313P, Q322T, L338P, G335D и D250N+G331Q+H358P. Независимо от варианта LMP-1 встречались такие мутации как G212S (B95-8, China 1, Med–, NC), S229T (Med–, NC), Q334R (China 1, Med–, NC), L338S (China 1, Med–), H352R (B95-8, Med–), а также тандемные повторы ≤ 4,5 или ≥ 5,0.

Оценка взаимосвязи вариантов и субвариантов LMP-1 ВЭБ с клинико-лабораторными проявлениями ВЭБ-ИМ у детей

Клиническая картина ВЭБ-ИМ у детей характеризовалась типичным течением. Такие ведущие синдромы как лихорадка, интоксикация, лимфаденопатия и поражение рото- и носоглотки присутствовали у всех пациентов, гепатоспленомегалия развилась у 91,3±3,4% детей. Несмотря на то, что все анализируемые случаи ВЭБ-ИМ у детей были ассоциированы только с ВЭБ-1, применение алгоритма балльной оценки степени тяжести ИМ, разработанного О.А. Поповой и соавт. [13] показало, что выраженность отдельных клинических и лабораторных признаков ИМ и рассчитанная сумма баллов степени тяжести заболевания индивидуально для каждого пациента варьировала от 15,5 до 35,5 баллов. Кроме того, у 8,7±3,4% детей с общей суммой баллов, равной 29,0 и выше, была верифицирована тяжелая форма заболевания. Остальные дети перенесли ВЭБ-ИМ средней степени тяжести (оценивается в интервале от 15,0 до 28,0 баллов).

Полученные данные о различной выраженности клинических и лабораторных признаков ВЭБ-ИМ у наблюдаемых нами детей стали предпосылками для продолжения исследований, направленных на поиск взаимосвязи особенностей клинического течения инфекции и генетической гетерогенности вирусной популяции ВЭБ-1. Мы предполагали, что симптомы заболевания и тяжесть их проявлений могут быть обусловлены известными вариантами LMP-1, а также другими молекулярно-генетическими характеристиками вируса, которые не ограничиваются только их группировкой по вариантам, описанным в классификации R.H. Edwards и соавт. [34].

Рисунок 1. Расположение пациентов с ВЭБ-ИМ в координатах двух первых измерений. Эллипсами показан 95% доверительный интервал барицентра местоположений пациентов с соответствующим вариантом LMP-1 в координатах измерений

Figure 1. A position of patients with EBV-IM in the coordinates of the first two measurements. Ellipses show the 95% confidence interval of the barycenter of patient locations with the corresponding LMP-1 variant in measurement coordinates

По разработанному нами алгоритму была проведена оценка взаимосвязи выявленных молекулярно-генетических характеристик ВЭБ с особенностями проявлений ВЭБ-ИМ у детей по 32 анализируемым признакам и 8 группам признаков (табл. 1). На первом этапе исследования МФА показал, что в рамках двух первых компонент выделяются два ключевых фактора, ассоциированных с различиями клинико-лабораторных проявлений ВЭБ-ИМ: возраст пациента и вариант вируса (рис. 1). Как видно на рис. 1, в координатах двух первых компонент пациенты младшей (до 6 лет) и старшей (6 и более лет) возрастных групп формировали противопоставленные кластеры с барицентрами во втором и четвертом квадрантах. Вдоль оси второй компоненты наблюдали формирование субкластеров пациентов, инфицированных разными вариантами LMP-1 ВЭБ. Таким образом, рис. 1 демонстрирует, что первая компонента характеризует разнообразие клинических и лабораторных признаков ВЭБ-ИМ у пациентов в зависимости от возраста, а вторая — в зависимости от инфицирующего варианта вируса.

Далее нами были проанализированы клинико-лабораторные признаки, вносившие значимый вклад в формирование второй компоненты. В результате показано, что в ее формирование значимый вклад внесли такие группы признаков как синдром интоксикации и гематологические показатели (рис. 2А), а также значимые переменные признаки: концентрация гемоглобина, увеличение лимфоузлов, беспокойство, отечность лица, снижение аппетита, нарушение сна, вялость, уровень глюкозы, увеличение селезенки и количество моноцитов (рис. 2Б).

Рисунок 2. Характеристики групп признаков и значимых признаков ВЭБ-ИМ у детей

Figure 2. Characteristics of groups of signs and significant signs of EBV-IM in children

Примечание. А — расположение переменных групп признаков в координатах двух первых измерений. Б — вклад переменных признаков в состав второго измерения. Пунктирной линией обозначен уровень среднего рассчитанного вклада (3,1%). Отображены 15 переменных с наибольшим вкладом. Обозначения признаков и групп признаков представлено в таблице 1.

Note. A — the location of the variable groups of signs in the coordinates of the first two dimensions. B — the contribution of variable signs to the composition of the second dimension. The dotted line indicates the level of the average calculated contribution (3.1%). The 15 variable signs with the largest contribution are displayed. Designations of signs and groups of signs are presented in Table 1

Обобщая полученные данные МФА (рис. 1 и рис. 2А), отметим, что в контексте первой компоненты возраст пациента оказывает влияние преимущественно на степень выраженности цитолитического синдрома, в то время как анализ второй компоненты указывает на то, что различные варианты LMP-1 детерминируют разную выраженность синдрома интоксикации. Основываясь на расположении барицентров пациентов в координатах второго измерения, инфицирование вариантами China 1 и Med– ассоциировано с наиболее выраженными, а B95-8 — с наименее выраженными проявлениями синдрома интоксикации у детей.

На заключительном этапе проведена оценка различий выраженности клинико-лабораторных признаков и групп признаков, вносящих весомый вклад во вторую компоненту, у пациентов с различными вариантами и субвариантами LMP-1 ВЭБ. В результате выявлены статистически значимые различия (скорректированный р < 0,05) по сумме баллов синдрома интоксикации для варианта В95-8 и субвариантов, содержащих аминокислотные замены E214D, L338S, а также по сумме баллов совокупности значимых признаков для вариантов В95-8, Med– и субвариантов с мутациями S229T, L338S (табл. 3).

Таблица 3. Различия суммы баллов всех значимых признаков и групп признаков ВЭБ-ИМ при инфицировании вирусом с разными молекулярно-генетическими характеристиками LMP-1

Table 3. Differences in the sum of scores of all significant signs and groups of signs of EBV-IM in case of infection with a virus with different molecular genetic characteristics of LMP-1

Вариант/субвариант Variant/ Subvariant	Δ (95% ДИ) (нет–есть) / Δ (95% CI) (absent–present)
Вариант/субвариант Variant/ Subvariant	Сумма баллов всех значимых признаков Sum of scores of all significant signs	Сумма баллов синдрома интоксикации Sum of scores of intoxication syndrome
*В95-8*	2 (1–4)	2 (0–3)
*Med*–	–4 (–8 – 0)	–
E214D	–	3 (0–6)
S229T	–4 (–6 – –1)	–
L338S	–2 (–4 – 0)	–2 (–4 – 0)

Примечание. В таблице приведены только выявленные статистически значимые различия (р < 0,05).

Note. Only significant differences are shown (р < 0.05).

Выявлено, что при инфицировании вариантом В95-8 по сравнению с другими вариантами LMP-1 вируса, ВЭБ-ИМ у детей характеризовался менее выраженными проявлениями синдрома интоксикации и суммы баллов значимых признаков в целом, что соответствовало более легкому течению заболевания. При этом с еще меньшей выраженностью синдрома интоксикации были ассоциированы случаи ВЭБ-ИМ, вызванные субвариантом, содержащим аминокислотную замену E214D (выявлена в 8% последовательностей ДНК изолятов В95-8).

Наоборот, утяжеление синдрома интоксикации и проявлений одновременно всех значимых признаков ВЭБ-ИМ наблюдали у пациентов, инфицированных субвариантом, содержащим аминокислотную замену L338S (сигнатурная аминокислотная замена, характеризующая варианты China 1 и Med–). Кроме того, при инфицировании вариантом Med– или субвариантом, содержащим аминокислотную замену S229T (выявлена в 100% изолятов Med– (сигнатурная замена) и 18% изолятов NC), сумма баллов всех значимых признаков ВЭБ-ИМ также была выше по сравнению с другими вариантами или субвариантами LMP-1 ВЭБ. Суммарно доля случаев инфицирования вариантом Med– и субвариантами, несущими аминокислотные замены L338S и S229T, составила 24,6%. Дополнительно отметим, что только при инфицировании субвариантом LMP-1, несущим аминокислотную замену S229T, было установлено статистически значимое превышение в 7 раз концентрации вирусной ДНК в лейкоцитах крови по отношению к случаям ВЭБ-ИМ, вызванным вирусом с другими молекулярно-генетическими характеристиками (790 (95% ДИ: 39–2781) копий ДНК ВЭБ/10⁵ клеток, р = 0,038). При этом медиана вирусной нагрузки составила 1105 [297; 2848] против 158 [70; 481] копий ДНК ВЭБ/10⁵ клеток.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что особенности клинико-лабораторных проявлений ВЭБ-ИМ у детей могут зависеть от молекулярно-генетических характеристик вируса. При этом отдельные типичные признаки заболевания и степень их выраженности ассоциированы с конкретным вариантом или субвариантом LMP-1. В анализируемой группе детей ВЭБ-ИМ протекал легче и с меньшей выраженностью синдрома интоксикации в случаях инфицирования вирусом, имеющим молекулярно-генетический профиль (тип/вариант/субвариант) ВЭБ-1/В95-8, в частности ВЭБ-1/В95-8/E214D. В то время как ВЭБ-1/ Med–, а также ВЭБ-1/Med–/L338S, ВЭБ-1/Med–/S229T, ВЭБ-1/China 1/L338S и ВЭБ-1/NC/S229T, по сравнению с другими вариантами вируса, были ассоциированы с более тяжелым течением инфекции.

Обсуждение

Особенности клинико-лабораторных проявлений ИМ при инфицировании разными типами и молекулярно-генетическими вариантами ВЭБ остаются мало изученным вопросом, особенно у детей. Впервые в РФ нами проведено исследование, посвященное оценке клинической значимости генетического разнообразия ВЭБ при ИМ.

Оптимизированный нами ранее методический подход к дифференциальной детекции ВЭБ-1 и ВЭБ-2 на основе метода ПЦР [14, 16] позволил оценить типовую структуру вируса при ВЭБ-ИМ у детей, проживающих в Нижегородской области. При этом во всех клинических случаях в лейкоцитах крови и в слюне был выявлен только ВЭБ-1. Тип ВЭБ-2 не был обнаружен ни в одном исследованном образце. Отметим, что в наших предыдущих исследованиях в нижегородской популяции встречались единичные случаи обнаружения ВЭБ-2 в лейкоцитах крови условно здоровых детей [14].

Полученные нами результаты соответствуют данным немногочисленных зарубежных публикаций, свидетельствующих о том, что ИМ чаще ассоциирован с типом ВЭБ-1 [25, 26, 41, 42]. Однако характеристика клинико-лабораторных особенностей ИМ при инфицировании разными типами вируса у детей отсутствует. Ранее сообщалось, что у лиц 14 лет и старше при инфицировании ВЭБ-1 активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотиансферазы, гамма-глутамилтранспептидазы была значительно выше по сравнению с теми, у кого был выявлен ВЭБ-2 или коинфекция обоими типами вируса [42]. Основная часть исследований фенотипических характеристик ВЭБ-1 и ВЭБ-2 до сих пор была посвящена изучению их трансформирующей активности и роли в канцерогенезе [36, 44].

Классификация ВЭБ, основанная только на типах вируса, не позволяет полностью учитывать все его естественное разнообразие (современный обзор представлен в [15]). Полученные нами результаты оценки молекулярно-генетического разнообразия C-концевой области LMP-1 ВЭБ в крови и слюне детей с ВЭБ-ИМ, проживающих на территории Нижегородской области, значительно расширяют существующие представления о генетической гетерогенности вируса в целом.

Выявление четырех из семи охарактеризованных R.H. Edwards и соавт. вариантов LMP-1 (В95-8, China 1, Med– и NC) соответствовало описанному распределению в Европейской части России, с доминированием низкодивергентного варианта В95-8 (данные по взрослым вирусоносителям) [2, 17, 19]. По данным зарубежной литературы, структура популяции и преобладающий вариант LMP-1 ВЭБ при ИМ у детей в разных географических регионах мира значительно варьируют, при этом определенного варианта LMP-1, ассоциированного только с ИМ, не выявлено [26, 35, 40, 41]. Как показали собственные исследования, возбудителем ИМ являлся, как правило, один из вариантов вируса. Коинфицирование разными вариантами LMP-1 при ВЭБ-ИМ у детей в проведенном нами исследовании было редким событием. Аналогичные результаты отражены в работах научно-исследовательских групп из Китая и Аргентины [25, 41]. Вместе взятые, они контрастируют с данными других авторов, указывающих на возможность множественного инфицирования разными штаммами ВЭБ, результаты которых были получены не с помощью методов секвенирования, а на основе применения гетеродуплексного анализа [35, 40].

Проведенный нами детальный анализ аминокислотных последовательностей позволил выявить широкий спектр мутаций С-концевой области LMP-1 в нижегородских изолятах ВЭБ (в соответствии с табл. 2). Наиболее распространенные из них ранее были достаточно хорошо охарактеризованы в работах как зарубежных, так и российских исследователей. В первую очередь это относится к сигнатурным аминокислотным заменам, которые специфичны для разных вариантов LMP-1 [34]. Делеция 30 п.н., кодирующая 10 а.к. в координатах 346–355 а.к., известная своим высоким трансформирующим потенциалом in vitro и in vivo, была выявлена исключительно в штаммах China 1 (100%), что соответствует его принадлежности к так называемым САО-подобным штаммам. Наличие двойных аминокислотных замен G212S/S366T и уникальной E328Q в последовательностях LMP-1 В95-8 ранее было описано как набор мутаций, характерных для российских изолятов ВЭБ (данные по взрослым здоровым вирусоносителям и онкологическим больным) [2, 17, 19].

В нашем исследовании продемонстрирована существенная вариабельность области тандемных повторов LMP-1 (а.к. 253–306) по числу (от 3,5 до 7,0) повторяющихся мотивов из 11 а.к. (идеальный мотив PQDPDNTDDNG) и аминокислотным заменам в них, а также по наличию и местоположению между ними мотива из 5 а.к. (PHDPL, а.к. 275–279). Только изоляты Med– имели типичное для них чередование идеальных и модифицированных (присутствует замена аспарагиновой кислоты на глицин в третьем положении аминокислоты в элементе — D277G, D282G, D293G, D304G) мотивов из 11 а.к. Отличительной особенностью нижегородских изолятов ВЭБ явилось то, что мотив из 5 а.к. (а.к. 275–279) отсутствовал во всех без исключения последовательностях China 1, Med– и NC. Отметим, что в работе зарубежных авторов данный мотив встречался в разных вариантах LMP-1 ВЭБ, в том числе в изолятах, установленных от детей с ИМ [41]. Значительная часть других выявленных в нашем исследовании мутаций встречались спорадически и остаются фенотипически не охарактеризованными.

Ранее только в одном исследовании была проведена оценка связи клинических особенностей ИМ у детей с разными молекулярно-генетическими характеристиками LMP-1 ВЭБ. Было показано, что повышение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы происходило при инфицировании ВЭБ, у которого в тандемных последовательностях LMP-1 насчитывалось 3 или 4 повтора [26]. Однако в нашем исследовании эти данные не подтвердились. Кроме того, МФА показал, что на степень выраженности цитолитического синдрома оказывает влияние преимущественно возраст детей. Именно эта возрастная особенность наиболее часто отмечалась в многочисленных клинических наблюдениях за больными ИМ [1, 11, 22, 23]. А в одной из работ российских авторов было установлено, что достижение ребенком возраста 5,5 лет на фоне ВЭБ-инфекции приводит к повышению в 1,5 раза риска развития гепатита с синдромом цитолиза [11].

На основе проведенного МФА клинико-лабораторных показателей нами впервые были определены синдромы и отдельные признаки (симптомы) ВЭБ-ИМ у детей, выраженность которых обусловлена геновариантом вируса. В числе значимых были определены синдром интоксикации, а на уровне отдельных признаков — увеличение лимфоузлов, беспокойство, отечность лица, снижение аппетита, нарушение сна, вялость, увеличение селезенки, изменение концентрации гемоглобина, глюкозы и количества моноцитов. Кроме того, оценка влияния определенных вариантов и субвариантов LMP-1 вируса на течение ИМ позволила получить новые данные о клинической значимости генетического разнообразия ВЭБ. Установлено, что у пациентов, инфицированных вариантом LMP-1 В95-8, ВЭБ-ИМ протекает легче и с наименее выраженным синдромом интоксикации. В то время как инфицирование вариантом Med– и субвариантами, несущими аминокислотные замены L338S и S229T, было ассоциировано с более тяжелыми случаями заболевания, доля которых суммарно составила 24,6% (каждый четвертый из госпитализированных детей). Мутация L338S (присутствует в 100% штаммов China 1 и Med–) к тому же была связана с более выраженными проявлениями интоксикации. Случаи инфицирования субвариантом ВЭБ, несущим мутацию S229T (встречалась в штаммах Med– и NC), отличались наибольшей вирусной нагрузкой в лейкоцитах крови. На наш взгляд, важным аспектом является изучение функциональных свойств именно этих мутаций, в том числе с учетом данных недавно проведенных масштабных исследований, продемонстрировавших повышенный риск развития злокачественных новообразований у лиц, перенесших ВЭБ-ИМ в анамнезе, особенно в тяжелой форме (был установлен более чем 10-кратный риск) [29, 45].

Заключение

Впервые в РФ проведена оценка клинической значимости генетического разнообразия ВЭБ при ИМ у детей.

Показано, что не только варианты LMP-1 ВЭБ как таковые, но и более детальные характеристики вируса (например, аминокислотные замены и другие) могут влиять на течение ВЭБ-ИМ.

Установлена взаимосвязь определенных вариантов и субвариантов LMP-1 ВЭБ, циркулирующих на территории Нижегородской области, с клинико-лабораторными проявлениями ИМ у детей. В анализируемой группе детей ВЭБ-ИМ протекал легче и с меньшей выраженностью синдрома интоксикации при инфицировании вирусом, имеющим молекулярно-генетический профиль ВЭБ-1/В95-8, в частности ВЭБ-1/В95-8/E214D. Случаи более тяжелого течения инфекции были ассоциированы с ВЭБ-1/Med–, ВЭБ-1/Med–/L338S, ВЭБ-1/Med–/S229T, ВЭБ-1/China 1/L338S и ВЭБ-1/NC/S229T (суммарно 24,6% госпитализированных пациентов).

По результатам проведенного исследования предлагается следующий алгоритм дифференциальной диагностики клинической значимости разных вариантов ВЭБ. На первом этапе методом МФА по двум первым осям определяют наличие различий между наборами нормализованных клинических и лабораторных признаков ИМ в зависимости от варианта ВЭБ. Далее выделяют группы симптомов и симптомы, обладающие максимальной значимостью для выявленных различий. На заключительном этапе, применяя методы традиционной статистики, исследуют различия значений наборов симптомов при инфицировании определенными вариантами ВЭБ.

Полученные результаты имеют важную практическую направленность, позволяя выявлять группы риска в зависимости от особенностей течения заболевания при инфицировании различными вариантами ВЭБ, а также с точки зрения оптимизации и индивидуализации ведения и лечения пациентов. Оценка генетического разнообразия ВЭБ лежит в основе перспективной разработки средств специфической профилактики и терапии ВЭБ-инфекции. В контексте решаемых в данном исследовании задач необходимо проведение более масштабных и системных исследований на разных территориях РФ с участием профильных специалистов научного и врачебного сообществ.

------------------------------------------------------------

¹ URL: https://www.megasoftware.net

² URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

³ URL: https://www.R-project.org

⁴ URL: http://www.rstudio.com

About the authors

Maria I. Popkova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Author for correspondence.
Email: popmarig@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5864-5862
SPIN-code: 4485-2459
https://nniiem.ru/structure/laboratories/molbiol.html

PhD (Мedicine), Leading Researcher of Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology