The role of neutrophil extracellular traps (NETs) in the immunopathogenesis of severe COVID-19: potential immunotherapeutic strategies regulating NET formation and activity

Full Text

Введение

На сегодняшний день накоплен довольно большой объем информации об особенностях строения, работы и функций нейтрофильных гранулоцитов (НГ). Известно, что они относятся к наиболее многочисленной популяции циркулирующих в крови лейкоцитов (~57%), являются клетками иммунной системы, которые формируют первую линию защиты [140], обладают мощным микробицидным и регуляторным потенциалом [9], способны осуществлять килинг различных патогенов (бактерий, вирусов, грибов, одноклеточных) в локусах воспаления, используя различные интрацеллюлярные и экстрацеллюлярные механизмы [48]. До недавнего времени в научных кругах считалось, что основным способом борьбы НГ с патогенами является фагоцитоз и способность к высвобождению содержимого своих гранул — дегрануляция, но на рубеже 2004–2005 гг. внимание биологов и врачей было приковано к совершенно новому явлению, которое значительно расширило наше представление о роли этих клеток в организме человека и животных. В институте инфекционной биологии им. Макса Планка в Берлине под руководством Arturo Zychlinsky было обнаружено, что НГ при контакте с патогенами образуют внеклеточные сетеподобные структуры, содержащие ДНК и содержимое гранул: ферментные и неферментные белки и т. д. [6]. Так был открыт нетоз и показана ранее никем не описанная способность НГ к образованию нейтрофильных внеклеточных ловушек NETs (neutrophil extracellular traps) как способу борьбы НГ с различными патогенами. Описаны также две его разновидности: суицидальный нетоз, при котором, образуя экстрацеллюлярные сети, НГ разрушаются и погибают, и витальный нетоз — нелитическое высвобождение NETs из митохондрий в мембранных везикулах с сохранением целостности клеток [35]. NETs — это иммуногенные [82] и токсичные [118] сети ДНК, которые образуются вследствие деконденсации хроматина ядер НГ. В своем составе они имеют гистоны и различные белки, например, эластазу, миелопероксидазу, кателицидины, кальпротектин, α-дефенсины и белки цитоскелета [38, 141]. В естественных условиях (in vivo) стимулом для образования NETs могут служить патогены, индуцирующие нетоз напрямую, компоненты бактерий, активированные тромбоциты, аутоантитела, перекись водорода, IL-8, кристаллы уратов, а также молекулярные паттерны, ассоциированные с опасностью (DAMP) [35]. При этом определенную роль играет размер патогена: к примеру, гифы грибов потенцируют НГ на образование NETs, а мелкие бактерии утилизируются путем фагоцитоза. В то же время кокковые и биопленкообразующие бактерии (Staphilococcus aureus) могут стимулировать образование NETs [35].

Механизмы образования NETs

В зависимости от стимула, образование NETs происходит разными сигнальными путями и может быть опосредованно через рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), а также через хемокиновые и цитокиновые рецепторы, Toll-подобные рецепторы и Fc-рецепторы (FcR) [35]. Сигнал передается внутрь клетки, что приводит к выходу из эндоплазматического ретикулума ионов кальция Ca²⁺ и активации NADPH-оксидазы (NOX). Активность последней приводит к образованию реактивных форм кислорода (ROS — Reactive oxygen species). Однако в экспериментальных работах (in vitro) было показано, что ROS, помимо NOX, имеют митохондриальное происхождение и играют ключевую роль в дальнейшем образовании NETs [142]. ROS действуют на азурофильные гранулы с последующим высвобождением в цитозоль клетки нейтрофильной эластазы (NE) и миелопероксидазы (MPO). В цитоплазме NE разрушает актин, мембрану ядра НГ и вместе с MPO проникает в ядро. Под действием ROS также активируется фермент пептидил-аргининдеиминаза 4 (Peptidylarginine deiminase 4 — PAD4), который вызывает цитруллинирование гистонов нейтрофильной ДНК. Действие на хроматин NE, MPO и цитруллинирование гистонов приводит к деконденсации хроматина ядра. В дальнейшем происходит разрушение ядерной мембраны НГ с выходом деконденсированного хроматина в цитозоль клетки, где с ним связываются цитоплазматические белки и ферменты. Образование NETs завершается разрывом цитоплазматической мембраны НГ под действием гасдермина D и выходом хроматина за пределы клетки [110]. Гистоны MPO, NE и катепсин G в составе NETs обладают выраженным микробицидным действием, уничтожая внеклеточно расположенные микроорганизмы, но при этом они, при определенных условиях, могут являться первичными компонентами деструкции тканей, негативно влиять на физиологическую функцию клеток, в том числе эндотелиальных (ЭК), вызывая воспаление [29]. Недавние исследования показали, что НГ могут иметь неизвестный ранее иммунный механизм в борьбе с инфекционными патогенами, сходный с механизмом клеточной памяти. При повторном контакте с одним и тем же патогеном этот механизм клеточной памяти индуцирует адаптивный ответ наивных НГ [38, 82, 118, 141]: при повторной стимуляции НГ могут рекрутироваться и активироваться, что вызывает более выраженный иммунный ответ. Наряду с этим было показано, что этот процесс может зависеть от концентрации микроорганизмов [82, 141]. Так, низкие дозы микроорганизмов, полученных из микробиоты, вызывают адаптивный ответ НГ, в то время как высокие дозы этих же микроорганизмов могут его ингибировать [141]. Предполагается, что NETs способны улавливать и облегчать элиминацию бактерий, грибов, простейших и даже вирусов [59, 71, 99, 116, 141], но не всегда нетоз может иметь благоприятные последствия.

За последнее время накоплен довольно большой объем клинического материала и экспериментальных работ, которые все больше доказывают негативное влияние гиперактивированных НГ, легко формирующих NETs, на организм человека и связано это с тем, что NETs индуцирует развитие многих патологических процессов, в том числе и при вирусных инфекциях [117]. Нарушение процессов нетоза на фоне нейтрофилеза и гиперактивации НГ, сопровождающееся повышенным образованием NETs, может вызвать повреждение эпителия, а также эндотелия сосудов, ведущее к возникновению эндотелиальной дисфункции (ЭД), индуцировать неконтролируемую воспалительную реакцию и прогрессирование различных иммунозависимых патологических процессов, что приводит к возникновению замкнутого порочного круга и является фактором риска развития острых или обострения хронических сердечно-сосудистых, инфекционно-воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний. При этом следует отметить, что именно изучение иммунопатогенеза некоторых аутоиммунных заболеваний в течение последнего десятилетия, предопределило возникновение нового термина — нетопатии, подчеркивая ведущую негативную роль усиленного формирования NETs при этих иммунозависимых патологических процессах.

В связи с изложенным полагаем, что имеющиеся на сегодняшний день научные и клинические данные диктуют насущную необходимость разработки и внедрения новых диагностических приемов, поиска различных ассоциированных с NETопатиями терапевтических мишеней, а также создания различных вариантов таргетных иммунотерапевтических подходов, действие которых будут направлены на лечение заболеваний, связанных с нетопатиями [153].

Роль NETs при COVID-19

Роль НГ в патогенезе коронавирусной инфекции довольно велика и связана, прежде всего, с рекрутированием НГ в очаги воспаления, активацией их функций и усиленным образованием NETs по вышеописанному механизму.

Неотъемлемым условием для проникновения вируса SARS-CoV-2 в клетку мишень является наличие на последней рецепторов к ангиотензинпревращающему ферменту 2 (angiotensin converting enzyme 2 — ACE2) [73]. Рецепторы к ACE2 экспрессируют многие клетки организма, включая эпителиоциты II типа легких, клетки проксимальных канальцев почек, энтероциты кишечника, эндотелиоциты сосудов, некоторые иммунные клетки и клетки поджелудочной железы [17]. Именно с таким широким распространением данных рецепторов в организме связан системный эффект COVID-19 [23]. Показано, что при коронавирусной инфекции (COVID-19), протекающей в тяжелой форме, данные системы органов поражаются наиболее часто, и связано это с развитием иммунотромбозов и коагулопатий, опосредованных через процессы нетоза [73, 107]. При проникновении вируса SARS-CoV-2 в клетки мишени последние высвобождают паракринные факторы, которые влияют на соседние эпителиальные клетки, пневмоциты, привлекают в место вторжения НГ и другие иммунные клетки. Образующиеся NETs способны уничтожать эпителиальные и эндотелиальные клетки, а входящие в их состав гистоны обладают цитотоксической активностью и нарушают целостность мембран [11, 149]. Это приводит в итоге к повреждению альвеолярных капилляров, их микротромбозу, появлению экссудата в просвете альвеол, отложению фибрина, кровотечениям, инфильтрации иммунными клетками и неоваскуляризации легочной ткани [12, 29, 31, 154]. Было показано, что содержание таких компонентов NETs, как миелопероксидаза (MPO) и цитруллинированные гистоны, увеличивается при остром респираторном дистресс-синдроме (аcute respiratory distress syndrome — ARDS), что может быть использовано для прогноза течения заболевания. Тяжесть заболевания коррелирует с нейтрофилией, что подтверждает прямой вклад НГ в развитие патологии [148]. Циркулирующие компоненты NETs, имеющие в своем составе MPO, могут вызывать микротромбоз сосудов в других органах, а катионные компоненты в их составе, такие как гистоны, могут связываться с отрицательно заряженными мембранами клеток, вызывая их перфорацию и, как следствие, лизис клеток с инициированием воспалительной реакции [47, 125].

NETs содержат в своем составе катионные белки (гистоны, МРО, кателицидины, дефенсины), которые способны оказывать цитопатический эффект на эндотелиоциты сосудов и альвеолоциты легких [85]. К примеру, гистоны способны связываться с отрицательно заряженными мембранами клеток, вызывая повреждение последних с запуском воспаления [85]. По этой причине применение в терапии COVID-19 антигистоновых антител и антител против нейтрофильной эластазы, приводит к снижению повреждение тканей [152].

Проведенные на экспериментальных мышах исследования показали, что NETs и входящие в их состав катионные белки способны активировать макрофаги и другие иммунокомпетентные клетки через TLR с последующей стимуляцией высвобождения TNFa и IL-6 [81]. Также известно, что неконтролируемая активация НГ под действием PAMP и DAMP может привести к сильной активации макрофагов с высвобождением большого количества провоспалительных цитокинов [18].

Обусловленная избыточным образованием NETs деструкция тканей может приводить к усилению SARS-CoV-2-индуцированного цитокинового шторма (ЦШ) и синдрому активации макрофагов (САМ) у пациентов с тяжелой формой COVID-19 [19].

Кроме того, связываясь с рецепторами ACE-2, SARS-CoV-2 может их блокировать и приводить к повышению концентрации ангиотензина-2 в крови, обусловливая этим его негативный эффект, одновременно снижая концентрацию защитного ангиотензина 1–7 и ангиотензина 1–9 типа.

Было также отмечено, что применение в терапии COVID-19 кислородной терапии высокого давления влечет за собой обострение воспалительного процесса в легких, что связано с интенсификацией образования NETs [53].

Пневмонии, сопровождающиеся усиленным образованием NETs в легких при COVID-19, впоследствии могут приводить к развитию таких респираторных заболеваний, как бронхиальная астма (БА), муковисцидоз (МВ) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) [139]. Интенсивность образования NETs в организме коррелирует с тяжестью протекания воспалительного процесса и является прогностическим фактором в развитии новой коронавирусной инфекции [72]. Такие компоненты NETs, как MPO, NE, цитруллинированные гистоны, могут попадать в циркуляторное русло, где их концентрация хорошо коррелирует с тяжестью протекания COVID-19 [156].

В ряде научных работ предполагается, что усиленное образование NETs при COVID-19 может являться причиной развития венозных и артериальных тромбоэмболий [22]. Экспериментально было подтверждено, что образование NETs в циркуляторном русле приводит к развитию венозных тромбозов у мышей [158]. Легкое течение COVID-19 сопровождается развитием физиологического иммунотромбоза, который контролируется системой гемостаза и не имеет широкого распространения в организме. У пациентов с тяжелым течением инфекционного процесса происходит срыв контроля противосвертывающей системы, что приводит к развитию неконтролируемого тромбообразования [44]. Кроме того патологическое тромбообразование приводит, в первую очередь, к повреждению микроциркуляторного русла легких и почек, что сопровождается развитием тяжелой пневмонии и острым повреждением почек [20, 32]. Развивающиеся коагулопатии у детей младенческого возраста при легком течение COVID-19 могут повлечь за собой развитие синдрома Кавасаки [16].

Развитие иммунотромбозов и коагулопатий связано с несколькими причинами, к которым относятся взаимодействие NETs с фосфолипидами мембран тромбоцитов, что активирует плазменную калликреин-кининовую систему с последующим запуском процесса тромбообразования [100]. В основе механизма тромбообразования лежит иммуноопосредованная активация тромбоцитов через P-селектин и образование фибрина, что приводит к агрегации тромбоцитов и образованию тромбов [134]. Гистоны, входящие в состав NETs и находящиеся в свободном состоянии в циркуляторном русле, способны активировать тромбоциты через TLR [106].

Входящие в состав NETs катионные белки, ферменты и оксидные радикалы могут запускать плазменный гемостаз по внешнему пути [97]; высвобождаемый при этом тканевой фактор при повреждении клеток запускает работу системы гемостаза по внутреннему пути [54].

Развитие ЦШ и образование больших количеств цитокинов может приводить к дисфункции эндотелия сосудов с последующим запуском коагуляционного гемостаза [144]. Повреждение сосудов микроциркуляторного русла, вызванное дисфункцией эндотелия и образование антифосфолипидных антител может приводить к развитию ДВС-синдрома [21]. По этой причине повышенный уровень D-димера и изменения в коагулограмме, свидетельствующие о гиперкоагуляции, являются прогностически неблагоприятными признаками и коррелируют с высоким риском смертности людей при тяжелом течении COVID-19 [83].

Различные исследования показали, что в сыворотке крови пациентов, болеющих COVID-19, содержатся в большом количестве иммунные комплексы и аутоантитела, которые способны активировать систему комплемента через С3 компонент [137]. По этой причине оправдано применений в лечении COVID-19 ингибиторов С3 компонента системы комплемента [98]. Кроме того, нуклеокапсид вируса COVID-19 может запускать работу системы комплемента через лектиновый путь [126]. В итоге активация системы комплемента приводит к стимуляции НГ, повреждению тканей с высвобождением тканевого фактора. Последний активирует тромбоциты, запуская процесс тромбообразования [114].

Такие заболевания, как сахарный диабет, гипертоническая болезнь и ожирение, наиболее часто являются факторами риска тяжелого протекания COVID-19. Отмечается довольно высокая летальность среди пациентов с диабетической формой коронавирусной инфекции. Считается, что причиной этого служит чрезмерная активация провоспалительного ответа и нарушение работы в системе врожденного иммунитета [25, 113]. Кроме того, гипергликемия стимулирует НГ и индуцирует образование NETs, влияет и на высвобождение Ca-связывающего белка S100, который стимулирует высвобождение печеночного тромбопоэтина с запуском процесса тромбообразования [56].

Возрастные группы старческого и пожилого возраста, имеющие такие сопутствующие заболевания, как сахарный диабет, гипертоническая болезнь, хронические заболевания почек, склонны наиболее тяжело переносить инфекцию, вызванную SARS-CoV-2 [24]. Было отмечено, что у пациентов данных возрастных групп, тромбоциты менее стабильны и склонны к чрезмерной активации под влиянием воздействия NETs [147]. Также было установлено, что при ассоциации COVID-19 с сахарным диабетом у пациентов повышена выработка IL-6, что также отягощает течение инфекционно-воспалительного процесса [81]. Не рекомендуется назначать пациентам пожилого и старческого возраста липидсодержащие статины, так как их применение ассоциируется с усилением образования NETs [68].

Приведенные выше данные экспериментальных и клинических работ были подтверждены результатами аутопсии. Так было показано, что у пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции отмечены: значительная инфильтрация легочной паренхимы НГ, отложения конгломератов NETs и фибрина в капиллярах, что вызвало острый капиллярит [29]. Гистологическое исследование легкого при развитии ARDS показало окклюзию легочных сосудов конгломератами NETs, что значительно реже наблюдалось при пневмонии, вызванной вирусами гриппа [100, 105].

Ретроспективное исследование, проведенное в группе пациентов с COVID-19, показало, что нейтрофилия и интенсивность образования NETs коррелируют с высоким процентом поражения легочной паренхимы, выявленного при проведении компьютерной томографии [143].

Таким образом, при коронавирусной инфекции иммунные механизмы направлены на формирование острого воспаления и уничтожение SARS-CoV-2, но чрезмерный гиперактивный характер иммунного реагирования обусловливает необратимое поражение тканей [29]. Цитокиновый шторм при COVID-19 приводит к развитию ARDS, полиорганной недостаточности и может быть причиной летального исхода [76]. Гиперактивация НГ и NETs, опосредованная действием провоспалительных цитокинов, хемокинов и циркулирующих гистонов может приводить к прогрессированию неконтролируемого системного гипервоспаления, усилению респираторной декомпенсации, микротромбозу, неадекватному иммунному ответу и в конечном итоге к критическому течению COVID-19. Поэтому в основе поиска возможных адекватных терапевтических воздействий на SARS-CoV-2 должна лежать иммунотерапевтическая регуляция патологических гиперэргических реакций иммунной системы, включающая в том числе, сдерживание гиперактивации НГ и ограничение образования NETs.

Терапевтические стратегии, направленные на борьбу с NETs-опосредованными заболеваниями при COVID-19

Создание для лечения COVID-19 новых терапевтических подходов, направленных на сдерживание гиперактивации НГ и ограничение образования NETs и связанных с ними процессов воспаления является сложной задачей из-за необходимости соблюдения тонкого баланса между иммуносупрессивными воздействиями биологических антицитокиновых препаратов, которые должны ограничить выраженность слишком интенсивной патологической воспалительной реакции при ЦШ, и возникающей на этом фоне вторичной иммуносупрессии, что увеличивает риск возникновения бактериальных инфекций, осложняющих течение заболевания.

Показано, что комбинация противовирусной, противовоспалительной и антикоагулянтной терапии эффективно ингибирует активность SARS-CoV-2 и снижает нарушения регуляции иммунных реакций при COVID-19 [86, 131]. Высказано также предположение, что иммуномодулирующие методы лечения могут снизить уровень медиаторов воспаления и образование NETs, не нарушая при этом бактериальный клиренс. Это открывает новые возможности терапии данных пациентов [131].

При тяжелой форме COVID-19 критической проблемой является инициированное макрофагами и НГ воспаление легких с последующим развитием ARDS. Подавление аберрантной активации НГ может обеспечить эффективную стратегию лечения ARDS, связанного с COVID-19 [123].

В настоящее время возможно применение уже существующих лекарственных препаратов, и разрабатывается целый ряд новых лекарственных средств, иммуномодулирующее действие которых может регулировать количество НГ, позитивно влиять на функции НГ, ограничивать интенсивность формирования NETs, что позволяет предположить возможную перспективность их применения в лечении ARDS при COVID-19.

Биологические антицитокиновые препараты на основе моноклональных антител

Провоспалительные цитокины, такие как TNFα, IL-17, IL-6 и IL-8, могут индуцировать формирование NETs НГ. Впоследствие NETs способствуют большей выработке цитокинов и возникновению стойкого воспаления [61, 75, 76, 111, 115, 145]. При COVID-19 компоненты NETs участвуют как на ранних, так и на поздних стадиях [111] и могут играть ключевую роль в активации макрофагов и процессинге провоспалительных цитокинов [75].

Терапия биологическими препаратами на основе моноклональных антител, к которым относятся антагонисты IL-6 и его рецептора, препараты, направленные на блокирование цитокинов IL-1, IL-17, IL-8 и их рецепторов, а также ингибиторы янус-киназ, стала золотым стандартом патогенетической терапии ЦШ при COVID-19.

Антагонисты IL-6 и его рецептора

Ключевую и центральную роль среди цитокинов, участвующих в патогенезе ЦШ при COVID-19, имеет IL-6 [3, 27].

IL-6 отличается своей плейотропностью благодаря уникальной сигнальной системе, состоящей из IL-6-рецептора (IL-6R) и нисходящих сигнальных молекул, активируя по механизму положительной обратной связи Тh17-клетки, Tfh-клетки, СD8⁺ T-лимфоциты и другие иммунные клетки и вызывая гиперреакцию иммунной системы при COVID-19 [8].

Показано, что IL-6 может индуцировать образование NETs НГ условно здоровых людей in vitro [75]. Также установлено, что IL-6 может стимулировать созревание В-клеток в плазматические клетки, которые способны продуцировать антигены цитруллинированного белка (АСРА), тем самым косвенно способствуя образованию NETs [111].

Для лечения пациентов с COVID-19 широко использовались препараты на основе моноклональных антител (МкАТ) к IL-6 и его рецепторам (IgG1). Согласно временным методическим рекомендациям, тоцилизумаб рекомендован к применению пациентам с тяжелым течением, а сарилумаб и левилимаб — при среднетяжелом течении болезни [3].

Олокизумаб — гуманизированное МкАТ, относящееся к изотипу иммуноглобулина G4/κ. IL-6 взаимодействует с двумя рецепторами, gp80 (также известным как рецептор IL-6 (IL-6R), CD126) и корецепторной молекулой, передающей сигнал. Олокизумаб селективно связывается с IL-6, нейтрализуя эффекты IL-6, блокируя gp130 (CD130) и сигнальные пути, не связывается в значительной степени с другими молекулами семейства IL-6 и не влияет на их функционирование [1, 121]. Эффективность МкАТ для лечения осложнений у пациентов с тяжелым и критическим течением COVID-19 и борьбой с ЦШ связана с тем, что они направленно действуют на сигнальные пути IL-6.

Тоцилизумаб — рекомбинантное гуманизированное МкАТ к рецептору IL-6. Способен селективно связываться, подавляя как растворимые, так и мембранные рецепторы IL-6 (sIL-6R и mIL-6R). При этом отмечается снижение уровня сывороточного С-реактивного белка у пациентов с COVID-19 [57, 128, 150].

Сарилумаб — МкАТ к рецептору IL-6, специфически связывается с растворимыми и с мембранными рецепторами IL-6 (IL-6Rα), подавляя IL-6-опосредованную передачу сигнала с вовлечением сигнального белка гликопротеина 130 (gp130) и STAT-3 белков (трансдукторы сигналов и активаторы транскрипции-3). Сарилумаб способен блокировать сигнальный путь IL-6, измеряемый по степени подавления STAT-3 белков, только в присутствии IL-6 [92].

Левилимаб — рекомбинантное МкАТ к рецептору IL-6. Левилимаб связывается и блокирует sIL-6R и mIL-6R, что позволяет предотвратить развитие IL-6-ассоциированного провоспалительного каскада, в том числе препятствует активации АПК, В- и Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, эндотелиальных клеток, фибробластов и избыточной продукции других провоспалительных цитокинов [4, 91].

Антагонисты цитокинов IL-1, IL-17, IL-8 и их рецепторов

IL-1β — провоспалительный цитокин, который участвует в патогенезе аутовоспалительных состояний, индуцирует продукцию вторичных медиаторов воспаления, включая IL-6. IL-1β и NETs, образуя петлю обратной связи, которая способствует развитию ARDS у пациентов с COVID-19 [46, 152].

Канакинумаб — гуманизированное МкАТ IgG1/κ к IL-1β с высоким аффинитетом связывается с IL-1β, предотвращая взаимодействие IL-1β с его рецепторами, IL-1β-индуцированную активацию генов и продукцию медиаторов воспаления, таких как IL-6 и циклооксигеназа-2. Назначается при невозможности использования или неэффективности тоцилизумаба или сарилумаба [41].

Анакинра — рекомбинантная версия антагониста рецептора IL-1 человеческого, продуцированного штаммом E. coli. Блокирует биологическую активность IL-1α и IL-1β путем конкурентного ингибирования их связей с рецептором IL-1. Назначается как препарат первого выбора и при неэффективности тоцилизумаба или сарилумаба [42, 67].

IL-17A — провоспалительный цитокин, гиперпродукция которого преимущественно обусловлена активацией Th17-лимфоцитов. В рамках врожденного иммунитета IL-17A выполняет защитную роль. При хронических иммуновоспалительных заболеваниях патологическая активация Th17-лимфоцитов и гиперпродукция IL-17A стимулирует Т-клеточный ответ, миграцию НГ и усиленную продукцию других медиаторов воспаления: IL-1, IL-6, TNFa, факторов роста (G-CSF, GM-CSF) и различных хемокинов. Ингибирование IL-17A может оказывать положительное влияние на ряд ключевых факторов патогенеза COVID-19 и рассматриваться как перспективная мишень в терапии данного заболевания [5]. В частности, при COVID-19 использовался нетакимаб — рекомбинантное гуманизированное МкАТ, в терапевтических концентрациях специфически связывающее IL-17A [10, 108]. Также известны другие лекарственные препараты, нейтрализующие IL-17A, используемые для лечения аутоиммунных заболеваний, в патогенезе которых не последняя роль отводится образованию NETs.

Cекукинумаб — полностью человеческое антитело IgG1, селективно связывающее и нейтрализующее IL-17A. Иксекизумаб — гуманизированное МкАТ к цитокину IL-17A и IL-17A/F из подкласса иммуноглобулинов IgG4.

Бродалумаб — с высокой аффинностью связывается с рецептором А IL-17; препарат ингибирует сигнальный путь воспаления, блокируя связь некоторых IL-17 лигандов и рецептора [40, 43].

IL-8, секретируемый макрофагами и эпителиальными клетками, является хемоаттрактантом НГ и Т-клеток при воспалительном процессе. Связывание IL-8 с CXCR2 на НГ приводит к высвобождению NETs, тем самым вызывая гипервоспаление. Было показано, что широкий спектр агонистов хемокиновых рецепторов CXCR2 индуцирует NETs in vivo [133]. Следует предположить, что целенаправленное ингибирование активации НГ и высвобождения NETs может быть достигнуто с помощью антагонистов нейтрофильного хемокинового рецептора CXCR2.

HuMax-IL8 — полностью человеческое МкАТ, ингибирует IL-8, способствующий прогрессированию опухоли и ускользанию от иммунного ответа; представляет собой новый разработанный для противоопухолевого лечения препарат [34]. В настоящее время HuMax-IL8 проходит клинические испытания для применения у пациентов с COVID-19 [43]. Низкомолекулярные антагонисты CXCR2: данириксин и навариксин — доступные ингибиторы НГ — были широко протестированы в клинических испытаниях при астме, ХОБЛ, при легочных заболеваниях, включая бронхоэктазы, вирус-ассоциированные легочные инфекции, и при гриппе [64, 84, 93, 138]. Учитывая их механизм влияния на НГ они могут представлять собой интерес и как препараты для лечения ARDS у пациентов с COVID-19 [104].

Ингибиторы JAKs

На включение в основной арсенал препаратов для таргетной терапии при SARS-CoV-2 могут претендовать и ингибиторы янус-киназ (JAKs). Тяжелое течение SARS-CoV-2 ассоциируется с дисрегуляцией воспалительных процессов, и еще одним из путей передачи сигналов, используемых рецепторами цитокинов является путь — JAK-STAT. JAKs являются цитоплазматическими тирозинкиназами, экспрессируются во всех клетках, и являются ключевыми игроками в передаче сигналов IFN. В рамках отечественных рекомендаций на амбулаторном этапе при среднетяжелом течении заболевания назначаются ингибиторы JAKs в сочетании с этиотропными препаратами [3].

Барицитиниб — селективный и обратимый ингибитор JAK1 и JAK2, механизм действия связан с подавлением сигнализации JAK1/2-зависимых цитокинов (IL-2, 6, 10, IFNα, IFNγ, GM-CSF и др.), участвующих в развитии гипервоспаления при COVID-19. Кроме того, барицитиниб обладает способностью предотвращать инфицирование и репликацию SARS-CoV-2 в клетках альвеол [49, 74].

Тофацитиниб — селективный ингибитор семейства JAKs, обладающий высокой селективностью. Ингибирует JAKs 1, 2, 3 и в меньшей степени — тирозин-киназу-2. Ингибирование JAKs-1 и JAKs-3 под действием тофацитиниба блокирует передачу сигнала посредством общих рецепторов, содержащих γ-цепи, в отношении цитокинов IL-2, 4, 7, 9, 15, 21. Тофацитиниб также модулирует действие IFN и IL-6, снижая высвобождение цитокинов хелперными клетками Тh1- и Тh17-типов, которые участвуют в патогенезе ARDS [58, 94].

Ингибиторы ДНКазы I

ДНКаза I (DNAseI) является генноинженерным вариантом человеческого природного фермента, который расщепляет внеклеточную ДНК. DNAseI способна сдерживать развитие вирусов герпеса, аденовирусов и др., не повреждая при этом ДНК клеток макроорганизма. DNAseI вызывает также деполимеризацию и разжижение гноя. DNAseI с успехом применяется для лечения герпетических кератитов и кератоувеитов, аденовирусных конъюнктивитов и кератитов, абсцессов легких, острого катарального воспаления верхних дыхательных путей аденовирусной природы; для уменьшения вязкости и улучшения эвакуации мокроты и гноя при бронхоэктатической болезни, абсцессах легких, ателектазах, пневмонии; в предоперационном и послеоперационном периодах у больных с гнойными заболеваниями легких, туберкулезом легких [112]. Выдвинуто предположение, что DNAseI может служить средством для разрушения NETs при COVID-19 [112]. Так было показано, что введение дорназы альфа, одобренной FDA, с использованием небулайзера у пациентов с тяжелым ARDS, связанным с COVID-19, может способствовать растворению мокроты и замедлению прогрессирования заболевания [146]. Применение DNAseI на моделях животных с тяжелой бактериальной пневмонией и острым повреждением легких способствовало ингибированию образования NETs и улучшало их выживаемость [85]. Также было отмечено уменьшение слизистых выделений нижних дыхательных путей и улучшение вентиляции легких, замедление прогрессирования ARDS и снижение риска присоединения вторичных инфекций при применении ингаляционной формы DNAseI на фоне снижения количества определяемых NETs [157].

Ингибиторы нейтрофильной эластазы

Нейтрофильная эластаза (NE), являющаяся важным компонентом NETs, участвует в патогенезе ARDS, связанного с COVID-19, способствуя инвазии SARS-CoV-2 в клетки-хозяина, а также может напрямую повреждать легочную ткань [136]. В сыворотке крови содержатся ингибиторы протеаз α1-антитрипсин (А1АТ), α2-макроглобулин, элафин преимущественной мишенью которых является NE. Использование ингибиторов NE может быть перспективным в лечении пациентов с тяжелой формой COVID-19 и ARDS [101]. Показано, что дефицит А1АТ — генетически детерминированное заболевание, выявляется при ХОБЛ, эмфиземе легких, поражении печени и сосудов [7]. Пациенты с перечисленными заболеваниями относятся к группе риска по развитию тяжелого течения COVID-19 [135], и единственным специфическим средством их лечения является внутривенная аугментационная терапия человеческим А1АТ, полученным из пула донорской плазмы. Элафин является мощным ингибитором NE и протеиназы 3, двух сериновых протеаз НГ, проявляет антибактериальные и противо воспалительные свойства, что делает его весьма перспективным для лечения воспалительных заболеваний легких или тяжелых реперфузионных повреждений, возникающих после инфарктов, тяжелых травм и SARS-CoV-2 [130].

В моделях на животных показано уменьшение острого повреждения легких при введении ингибиторов эластазы, таких как сивелестат [77]. В настоящее время сивелестат является единственным одобренным ингибитором NE для лечения ARDS в Корее и Японии [14].Описаны положительные результаты лечения пациентов с ARDS сивелестатом [96]. В частности, использование дозированных аэрозолем или распылителем ингибиторов NE значительно повышает эффективность последних и снижает частоту побочных эффектов [30].

Ингибитор дипептидилпептидазы 1

Дипептидилпептидаза 1 (DPP1), также известная как катепсин С, представляет собой цистеиндипептидиламинопептидазу, которая активирует сериновые протеазы, такие как NE, во время созревания НГ. Чрезмерная активность сериновой протеазы вызывает различные воспалительные заболевания легких, такие как ARDS, и способствует развитию ХОБЛ и БА. Было обнаружено, что ингибитор DPP1 — бренсокатиб снижает активность NE у здоровых людей [109], и в настоящее время он проходит клинические испытания эффективности при бронхоэктатической болезни. Некоторыми авторами предполагается, что введение ингибиторов DPP1 может предотвратить прогрессирование ARDS, вызванного SARS-CoV-2 [78].

Ингибитор респираторного взрыва

N-ацетилцистеин — муколитический препарат с антиоксидантной активностью, применяемый при заболеваниях органов дыхания [103] и заболеваниях кожи [13], также является потенциальным терапевтическим средством для лечения COVID-19 [26]. Показано, что N-ацетилцистеин уменьшает респираторный взрыв активированных НГ, но усиливает фагоцитоз у пациентов с диагнозами «сепсис», «синдром системной воспалительной реакции» или «множественная травма» в системе in vitro [62]. Кроме того, введение N-ацетилцистеина обеспечивает защиту легких в различные фазы ишемически-реперфузионного повреждения, снижая воспаление [60] и подавляя формирование фиброза легких [80]. Было предложено использовать N-ацетилцистеин в сочетании с другими препаратами для лечения ARDS [26, 60, 65]. Показано, что применение в лечении N-ацетилцистеина способствует сокращению пребывания пациентов с ARDS в отделении интенсивной терапии [155]. Основываясь на вышеизложенном, следует предположить, что N-ацетилцистеин может быть полезен при лечении ARDS, вызванного SARS-CoV-2, благодаря его антиоксидантной и противовоспалительной активности при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях легких.

Ингибитор гасдермина D

Гасдермин D (GSDMD) — предшественник порообразующего белка, способствует пироптозу в ответ на микробную инфекцию и сигналы опасности, важен для формирования NETs [127]. Выявлено, что ингибитор GSDMD — дисульфирам — блокирует репликацию SARS-CoV-2 in silico [90]. Кроме того, дисульфирам препятствует образованию пор за счет ковалентного связывания с Cys191/Cys192 GSDMD [67]. В настоящее время проводятся клинические испытания потенциального использования дисульфирама при COVID-19, что может уменьшить формирование NETs при ARDS, вызванном SARS-CoV-2 [43].

Ингибиторы PDE4

Фосфодиэстеразы (PDE) — ферменты, которые метаболизируют внутриклеточные вторичные мессенджеры: циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) и циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ). цАМФ (PDE4) присутствует в иммунных клетках, включая НГ, и способствует опосредованному НГ воспалению легких [28]. Существует ингибиторы PDE4: рофлумиласт — для лечения ХОБЛ, апремиласт — для лечения псориаза, кризаборол — для лечения атопического дерматита и дипиридамол, используемый при лечении тромбоза. Дипиридамол действует путем повышения внутриклеточного уровня цАМФ и блокирует обратный захват аденозина в клетках, что приводит к его антитромбоцитарному и сосудорасширяющему действию [132]. Несколько ингибиторов PDE были предложены в качестве подходящих препаратов для лечения COVID-19 [52]. Так было обнаружено, что дипиридамол ингибирует образование NETs [15]. В исследовании, включавшем пациентов с COVID-19, при применении дипиридамола наблюдалось улучшение состояния пациентов в тяжелых случаях, сопровождающееся значительным снижением уровня D-димера [89]. Предлагается их использование в клинике при ARDS, ассоциированном с COVID-19 [43]. Были начаты клинические испытания при COVID-19 с использованием апремиласта или энзифентрина [43].

β-адреноблокаторы

β1-блокаторы осуществляют избирательное ингибирование адренергической сигнализации. Таким образом, метопролол у больных с инфарктом миокарда вызывает «оглушение» НГ и, действуя на ранней стадии процесса рекрутирования, ингибирует их миграцию, уменьшает участие активированных циркулирующих тромбоцитов, ослабляя воспаление и уменьшая очаг инфаркта [50].

Антигистоновая терапия

Также было показано, что, как и многие медиаторы врожденного иммунитета, цитрулинированные гистоны вызывают воспалительные реакции, повреждение ЭК и активацию каскадной коагуляции [86]. После контакта патогена с рецепторами на мембране клетки происходит активация молекулярных реакций, которые приводят к выходу кальция из эндоплазматического ретикулума, вызывая повышение активности цитоплазматической деиминазы PAD4 (protein arginine deiminases 4), которая представляет собой фермент, играющий важную роль в цитруллинизации гистонов в процессе нетоза [2]. В дальнейшем происходит увеличение ядра НГ, ядерная оболочка распадается на везикулы, мембраны гранул и митохондрий разрушаются, что приводит к смешению цитоплазмы, кариоплазмы и антибактериальных пептидов. Белки гранул адсорбируются на отрицательно заряженных фибриллах деконденсированного хроматина, который служит каркасом для ловушки. В итоге клеточная мембрана разрывается, содержимое клетки выбрасывается наружу и, разворачиваясь в пространстве, образует NETs [37]. Гистоны проявляют эндотелиальную и эпителиальную цитотоксичность, взаимодействуя как с фосфолипидами клеточной мембраны, так и с TLR клеточной мембраны и системой комплемента, тем самым способствуя высвобождению провоспалительных цитокинов и хемокинов через инфламмасомы MyD88, NF-kB и NLRP3-зависимый путь. Кроме того, гистоны могут активировать тромбоциты, индуцируя воздействие фосфатидилсерина, что в конечном итоге приводит к развитию микротромбозов [36, 120, 124]. Провоспалительные, прокоагулянтные и цитотоксические функции внеклеточных гистонов, действующие как DAMP [102, 124] представляют собой последовательность иммунных реакций, которые могут активно способствовать ухудшению клинического течения COVID-19 и увеличению риска неблагоприятных исходов [36]. Недавно проведенное исследование указывает на значительную корреляцию между уровнями гистонов в плазме крови и тяжестью инфекции COVID-19 [120]. Впервые было продемонстрировано, что циркулирующие гистоны играют решающую роль и тесно связаны с тяжелой коагулопатией, воспалением и поражением кардиомиоцитов, что стало ключевым признаком тяжелого течения и повышенной смертности при COVID-19 [87]. Также было обнаружено, что высокий уровень циркулирующих гистонов свидетельствует об увеличении гибели клеток, в частности лимфоцитов с развитием лимфопении и НГ путем нетоза, при этом уровни циркулирующих гистонов в значительной степени коррелируют с уровнями IL-6 и белков острой фазы, включая фибриноген и СРБ, что указывает на индуцированный гистонами ответ острой фазы у пациентов с COVID-19 [120]. Недавняя медицинская гипотеза предполагает, что гистоны, секретируемые НГ при COVID-19 (поликатионы) могут усугублять течение вирусных инфекций, на которые можно воздействовать введением отрицательно заряженных полианионных препаратов (например, гепаринов и гепариноидов) [51]. В частности, лечение COVID-19 гепаринами и гепариноидами продемонстрировало их благотворное влияние через сложные биомолекулярные механизмы, основанные как на неантикоагулянтных, так и на антикоагулянтных свойствах [39, 69, 88, 119]. Согласно этому проводились различные исследования, в рамках которых наблюдали значительно отличающуюся in vitro модуляцию индуцированного гистонами воспаления и коагуляции цельной крови несколькими синтетическими и природными гепаринами и гепариноидами на основе гликозаминогликанов, часто используемыми для лечения COVID-19 в соответствии с рекомендациями ВОЗ по состоянию на 5 февраля 2022 г., такие как нефракционированный гепарин, низкомолекулярные гепарины (НМГ), данапароид натрия, фондапаринукс и сулодексид [33, 39, 129]. Более того, недавний отчет показал, что другие полианионы, такие как смесь олигонуклеотидов дефибротид [122], могут действовать как агенты, нейтрализующие гистоны, тем самым блокируя их патологические эффекты и защищая эндотелий от иммунотромбоза. В дополнение к их хорошо известным ролям и функциям в качестве антикоагулянтов и профибринолитических соединений, отмечается их особая высокая плотность отрицательного заряда, что позволяет им связываться и взаимодействовать с несколькими белками и протеиназами, проявляя противовоспалительные, антикомплементарные, иммуномодулирующие и антидепрессивные свойства вирусной активности независимо от антикоагулянтных свойств [19, 39, 45, 55, 69, 70, 88, 95, 119, 122]. Более того, определение гистонов можно рассматривать как новый биомаркер, который может помочь в стратификации риска у пациентов с COVID-19 [120] и служить прогностическим фактором повреждения сердечной и легочной ткани, а также быть полезным для индивидуального управления антикоагулянтной терапией [63, 66].

Следует заключить, что ни один из препаратов, доступных в настоящее время для воздействия на NETs, не является специфичным. Тем не менее, в совокупности существует несколько индивидуальных или комбинированных и, вероятно, безопасных терапевтических стратегий, доступных на сегодня для противодействия NETs у пациентов с COVID-19. NETs при этом могут быть подходящим биомаркером для проведения исследований и проверки их эффективности. Основываясь на вышеизложенном, следует предположить, что ингибиторы DNAse, NE, DPP1, N-ацетилцистеин, GSDMD, PDE4, β-блокаторы, полианионные препараты могут предотвратить прогрессирование ARDS, вызванного SARS-CoV-2. Данные препараты представляют интерес и были предложены в качестве подходящих для лечения COVID-19 и в дальнейшем предлагается их клиническое рассмотрение при ARDS, ассоциированном с COVID-19 [151].

Заключение

В клинической иммунологии давно сложились устойчивые стереотипы, характеризующие определенное дифференцированное реагирование клеток иммунной системы на вирусную и бактериальную инфекции. Так, нейтрофилез и «сдвиг влево» характерен для острой или обострения хронической бактериальной инфекции, а нейтропения и лимфоцитоз характерны для острой и хронической вирусной инфекции. В то же время при тяжелом COVID-19 наблюдается другая картина: нейтрофилез и лимфопения. Отмечается, что при тяжелом COVID-19 на фоне выраженного регуляторного дисбаланса иммунной системы имеет место необычность, извращенность и двойственность ее функционирования: от дефицита IFN I типа, дисфункций и дефицита Т- и В-лимфоцитов до нейтрофилеза, неттингующих нейтрофилов, формирующих NETs, гиперактивности макрофагов и гиперцитокинемии провоспалительных цитокинов, ведущей к возникновению «цитокинового шторма».

Анализируя роль НГ в патогенезе COVID-19, необходимо отметить их важнейшую парадоксальную роль в иммунопатогенезе этой необычной респираторной вирусной инфекции. У пациентов с тяжелой и критично тяжелой формой COVID-19 вирус SARS-CoV-2 индуцирует нейтрофилез, ассоциированный с их гиперактивностью, усиление процессов формирования большого количества NETs. NETs совместно с активированными тромбоцитами способствуют образованию микро- и макро- иммунотромбозов. Развивается поражение клеток эндотелия, васкулит и иммунотромбирование сосудов малого, среднего и крупного калибра, что дополнительно, на фоне дисрегуляторных процессов в иммунной системе, приводит не только к развитию ARDS, но и появлению мультиорганных расстройств.

В данном обзоре нами проанализирован достаточно большой объем научной литературы, посвященный особенностям формирования NETs, их роли в патогенезе COVID-19, участия в возникновении иммунотромбозов, васкулита, ARDS, мультиорганных поражений. Приведены убедительные данные, четко указывающие на значительное участие NETs в иммунопатогенезе COVID-19 и связанными с ними тяжелыми осложнениями, возникающими в результате усиления процесса воспаления, который является ключевым для течения инфекции SARS-CoV-2. Продемонстрированная роль НГ и NETs, наряду с ролью других клеток иммунной системы и провоспалительными цитокинами, чрезвычайно важна в понимании развития гиперактивного иммунного ответа при тяжелой COVID-19. Полученные научные результаты, доступные на сегодняшний день, позволяют идентифицировать возможности регуляторных воздействий на гиперактивированные НГ, на процессы формирования NETs на различных этапах и на ограничение негативного воздействия уже сформированных NETs на различные ткани и органы. Все вышеперечисленное должно помочь в создании новых, специализированных иммунотерапевтических стратегий, предназначенных для увеличения шансов на выживание, уменьшения тяжести клинических проявлений у пациентов с COVID-19, а также в значительном снижении показателей смертности.

Продолжение исследований роли гиперактивированных НГ и нетоза, а также понимание механизмов регуляции феномена образования и ограничения активности NETs при тяжелом COVID-19, по-видимому, являются приоритетными, поскольку в дальнейшем полученные новые данные могли бы помочь в разработке таргетных подходов не только к иммунотерапии, направленной на ограничение образования и блокирование негативных воздействий уже сформировавшихся NETs при тяжелом COVID-19, но и к иммунотерапии, которую можно было бы использовать в комплексном лечении других нетопатий, в первую очередь, аутоиммунных болезней, аутовоспалительных синдромов, тяжелых гнойно-воспалительных процессов, в том числе бактериального сепсиса и гематогенного остеомиелита.

About the authors

Irina V. Nesterova

Kuban State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; Peoples’ Friendship University of Russia

Author for correspondence.
Email: inesterova1@yandex.ru

DSc (Medicine), Professor, Head Researcher, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Scientific Research Laboratory; Department of Allergology and Immunology, Faculty of Continuing Medical Education

Россия, Krasnodar; Moscow

Margarita G. Atazhakhova

Kuban State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: inesterova1@yandex.ru

PhD Candidate, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics of FAT and PRS

Россия, Krasnodar

Yuri V. Teterin

Kuban State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: inesterova1@yandex.ru

PhD Candidate, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics of FAT and PRS

Россия, Krasnodar

Valeriya A. Matushkina

Kuban State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: inesterova1@yandex.ru

PhD Candidate, Department of Infectious Diseases and Epidemiology of FAT and PRS

Россия, Krasnodar

Galina A. Chudilova

Kuban State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: inesterova1@yandex.ru

DSc (Biology), Associate Professor, Head of the Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology of the Central Scientific Research Laboratory, Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Laboratory Diagnostics of FAT and PRS

Россия, Krasnodar

Marina N. Mitropanova

Kuban State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: inesterova1@yandex.ru

DSc (Medicine), Associate Professor, Head of the Department of Pediatric Dentistry, Orthodontics and Dentofacial Surgery

Россия, Krasnodar

References

Supplementary files