Molecular and genetic characteristics of Nizhny Novgorod Regionepstein–Barr virus isolates in children with infectious mononucleosis and healthy virus carriers

Full Text

Введение

Согласно современной таксономии вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Gammaherpesvirinae, роду Lymphocriptoviruses, виду Human gammaherpesvirus 4 (HHV4). Первая полногеномная последовательность ВЭБ (прототипный штамм B95-8) получена R. Baer и соавт. в 1984 г. (регистрационный номер GenBank: V01555) [14]. Многочисленные зарубежные исследования свидетельствуют о выраженной гетерогенности популяции ВЭБ, циркулирующего во всем мире [2, 10, 12, 13, 16, 17, 23, 24, 31, 33, 37, 40, 41]. Предложено несколько классификаций на основе подхода «гена-кандидата» (EBNA-2, EBNA-3, EBNA-1, LMP-1, BZLF1, BARF1, BART, EBERs и др.) ¹, широко изучена географическая распространенность отдельных геновариантов ВЭБ [23, 24, 34, 36]. К настоящему времени доказано существование специфических подтипов вируса с высокой онкогенностью при раке носоглотки (РНГ) в эндемичном районе Китая [25, 46]. С 2014 г. по настоящее время в GenBank представлено около 1000 полногеномных последовательностей ВЭБ [17, 42, 46]. Реаннотирован референсный штамм ВЭБ дикого типа (RefSeq HHV4, регистрационный номер GenBank: NC_007605) [30, 36].

В России вопросу изучения генетического разнообразия ВЭБ посвящено ограниченное число публикаций (15 работ за последние 5 лет). Внимание исследователей сконцентрировано на изучении онкогена, кодирующего латентный мембранный белок 1 (LMP-1) [1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10]. Для характеристики генетического разнообразия ВЭБ используется преимущественно одна из нескольких классификаций, в основе которых лежит структурно-функциональный полиморфизм гена LMP-1. Объектом исследований является исключительно взрослое население в контексте изучения онкологических заболеваний или разных этнических групп. До сих пор ни одна из нуклеотидных последовательностей российских изолятов ВЭБ не была депонирована в базу данных GenBank.

Целью настоящего исследования явилась оценка молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ у детей с ВЭБ-инфекцией в Нижегородском регионе.

Материалы и методы

Характеристика групп исследования. Проведен молекулярно-генетический анализ 178 изолятов ВЭБ из лейкоцитов крови и слюны, полученных от 69 детей в возрасте 1–17 (медиана 5 [2; 10]) лет, находившихся на лечении в ГБУЗ НО «Детская инфекционная больница № 8 г. Нижнего Новгорода» с диагнозом «Инфекционный мононуклеоз ВЭБ-этиологии» (группа ВЭБ-ИМ), и 32 ребенка сопоставимого пола и возраста без клинических признаков данного заболевания, проходивших диспансеризацию в ООО «Тонус Кроха и Семейная Стоматология», г. Нижний Новгород (группа ВЭБ-ЗД). Работа выполнена с соблюдением этических требований. Информированное согласие родителей или опекунов на проведение исследовательской работы в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) было получено лечащими врачами медицинских организаций. Работа получила одобрение на заседании локального этического комитета ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (Протокол № 3 от 11.11.2021 г.).

Сбор биологического материала. Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь, стабилизированная К3ЭДТА, и нестимулированная смешанная слюна (далее слюна). В работе использовались остаточные количества образцов цельной крови, полученных для проведения стандартных диагностических исследований в клинической практике. Сбор биоматериала производили однократно: у пациентов с ИМ в первые 3–10 дней от начала клинических проявлений заболевания, а у здоровых волонтеров в день обследования.

Определение ДНК ВЭБ. Для получения фракции лейкоцитов периферической крови использовали реагент «Гемолитик» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Пробоподготовку слюны выполняли оптимизированным нами ранее способом [4]. Выделение тотальной нуклеиновой кислоты проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУНЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) с модификациями [4, 5]. Выявление и количественное определение ДНК ВЭБ в лейкоцитах крови и слюне выполняли с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с применением коммерческого набора «АмплиСенс^® EBV/CMV/HHV6-cкрин-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) на амплификаторе Rotor-Gene Q 5plex HRM (Qiagen, Германия). Лабораторный протокол на всех этапах ПЦР-РВ соблюдали согласно инструкции производителя.

Дифференциальная детекция ВЭБ-1/ВЭБ-2 методом ПЦР. Для раздельной детекции основных типов ВЭБ (ВЭБ-1 и ВЭБ-2) применен оптимизированный нами ранее вариант однораундовой ПЦР на основе гена EBNA-2 [4, 5].

ПЦР-анализ фрагмента гена LMP-1 ВЭБ. Положительные образцы, содержащие ДНК ВЭБ (по результатам ПЦР-РВ), были использованы для амплификации С-концевого фрагмента гена LMP-1 вируса методом ПЦР. ПЦР-анализ проводили не в двухраундовой «полугнездовой» ПЦР, описанной в статье M.K. Smatti и соавт. [41], а в однораундовом варианте. При этом использовали праймеры, ранее предназначавшиеся для первого раунда: А1 5′-AGT CAT AGT AGC TTA GCT GAA-3′ и A2 5′-CCA TGG ACA ACG ACA CAG T-3′ [41]. Состав реакционной смеси общим объемом 25 мкл включал следующие реагенты: праймеры (5 пкМ в реакцию) (ДНК-синтез, Россия); 5-кратный Taq Red буфер 12,5 мМ Mg²⁺ (Евроген, Россия); 5 е.а. Taq-F ДНК-полимеразы (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия); смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (до конечной концентрации 0,1 мМ) (Евроген, Россия); деионизированную воду I типа (Milli-Q Integral 3, Франция). В качестве матрицы использовали выделенную ДНК в объеме 5 мкл на реакцию. Условия амплификации: инициация 95°С — 15 мин, 40 циклов (95°С — 5 мин, 53°С — 1 мин, 72°С — 1 мин), финальная элонгация 72°С — 10 мин. Амплификацию специфичных фрагментов проводили на амплификаторе MaxyGene Gradient (Axygen, США). В результате амплифицировали фрагмент С-концевой области гена LMP-1 размером 602 п.н. [41].

Продукты ПЦР-амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,8% агарозном геле, содержащем бромид этидия (0,02% по объему). В качестве стандарта для определения длины двуцепочечных молекул ДНК был использован маркер длин фрагментов (М) «100+ bp DNA Ladder» (Евроген, Россия). Результаты детектировали на трансиллюминаторе InGenius 3 с использованием программного обеспечения GeneSys (Syngene, Великобритания). Полученные данные выражали в качественном формате — обнаружено или не обнаружено.

Секвенирование по Сэнгеру фрагмента гена LMP-1 ВЭБ. Выделение и очистку полученных ампликонов LMP-1 из агарозного геля проводили с помощью коммерческого набора «ФБиоГель» (Фрактал Био, Россия), в соответствии с инструкцией производителя. Конечный объем элюата составил 30 мкл. Концентрацию очищенной ДНК определяли с помощью спектрофотометра Eppendorf BioPhotometer plus (Eppendorf, Германия). В среднем количество ДНК составляло 150–300 нг на образец.

Для реакции мечения прямой и обратной последовательностей ДНК флуоресцентными терминальными нуклеотидами использовался набор «Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, США). Лабораторный протокол на всех этапах анализа соблюдали согласно инструкции производителя. Очистку меченой ДНК LMP-1 от компонентов реакционной смеси проводили с использованием ацетата натрия (рН = 7,0) и изопропанола. Очищенный фрагмент элюировали в 20 мкл HiDi формамида (Applied Biosystems, США).

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК LMP-1 осуществлялось на генетическом анализаторе AB-3500 genetic analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием оригинального программного обеспечения 3500 Data Collection Software v. 1.0.

Биоинформационный анализ. Биоинформационный анализ данных проводился с помощью открытого программного обеспечения MEGA X (Mega Software, США) ². Полученные исходные нуклеотидные последовательности выравнивались по алгоритму ClustalW. В качестве референсных последовательностей служили полученные из базы данных GenBank ³ полногеномные последовательности прототипного штамма B95-8 (V01555.2) и референсного штамма HHV4 (NC_007605.1), а также нуклеотидные последовательности гена LMP-1 — штаммы China 1 (AY337723.1), China 2 (AY337724.1), Med– (AY337721.2), Med+ (AY337722.2), NC (AY337726.2), Alaskan (AY337725.1) и CAO (X58140.1). Нуклеотидные последовательности исследуемых изолятов ВЭБ и референтов транслировались в аминокислотные последовательности по стандартному генетическому коду. Построение филогенетических деревьев выполнено на основе метода максимального правдоподобия (Maximum likelihood). Принадлежностьисследуемых последовательностей LMP-1 к определенным вариантам в рамках классификации R.H. Edwards и соавт. [24] устанавливалась по наличию сигнатурных аминокислотных замен (согласно табл. 1 в [24]).

 

Таблица 1. Распределение вариантов LMP-1 ВЭБ по группам ВЭБ-ИМ и ВЭБ-ЗД

Table 1. Distribution of EBV LMP-1 variants by EBV-IM (Infectious Mononucleosis) and EBV-HVC (Healthy Virus Carriers) groups

Группа сравнения Сomparison group	Единицы измерения Units	Варианты LMP-1 ВЭБ по классификации R.H. Edwards и соавт.* EBV LMP-1 variants according to R.H. Edwards et al. classification*
		В95-8	China 1	Med–	NC	Alaskan	Коинфекция Coinfection
ВЭБ-ИМ EBV-IM (n = 66)	абс./abs.	40	11	3	11	0	1**
	P±σp, %	60,6±6,0	16,7±4,6	4,5±2,5	16,7±4,6	0	1,5±1,5
ВЭБ-ЗД EBV-HVC (n = 31)	абс./abs.	13	3	6	8	1	0
	P±σp, %	41,9±8,9	9,7±5,3	19,4±7,1	25,8±7,9	3,2±3,2	0
Уровень значимости различий р-value		р = 0,085	р = 0,547	р = 0,049	р = 0,291	р = 0,711	р = 0,711

Примечание. *R.H. Edwards и соавт. 1999 [24]; **China 1 в лейкоцитах крови и B95-8 в слюне.

Note. *R.H. Edwards et al. 1999 [24]; **China 1 in blood leukocytes and B95-8 in saliva.

 

Полученные нуклеотидные последовательности нижегородских изолятов ВЭБ депонированы в базе данных GenBank/NCBI от 09.08.2022 г. под регистрационными номерами OP105219–OP105376.

Статистическая обработка данных. Статистический анализ выполнен на основе языка программирования R версия 4.0.0 (The R Foundation for Statistical Computing, Inc) ⁴ и среды RStudio версия 1.4.1106 (RStudio, PBC) ⁵. При оценке распространенности ВЭБ-1/ВЭБ-2 и геновариантов LMP-1 совпадающие результаты исследования изолятов ВЭБ, выделенных одновременно из лейкоцитов крови и слюны от одного источника вируса, из анализа исключались. Частоту показателя (долю) описывали с указанием стандартного отклонения процентной доли (P±σ_p) в %. Оценку различий относительных показателей в анализируемых группах проводили с применением критерия χ² (хи-квадрат) с поправкой Йетса и критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Оценка распространенности ВЭБ-1 и ВЭБ-2.По результатам ПЦР-анализа клинических изолятов ВЭБ тип вируса был идентифицирован у всех детей. При этом в группе ВЭБ-ИМ как в лейкоцитах крови, так и в слюне выявлялся только ВЭБ-1. В группе ВЭБ-ЗД доминирующим типом вируса также являлся ВЭБ-1 (93,8±4,3% (30/32)). Только у двух детей в лейкоцитах крови обнаружен ВЭБ-2, что составило 6,2±4,3% от общего числа здоровых вирусоносителей. Случаев коинфекции двумя типами вируса не выявлено.

Оценка молекулярно-генетического разнообразия ВЭБ на основе метода секвенирования по Сэнгеру С-концевого фрагмента гена LMP-1.Предварительно проведенный сравнительный анализ нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей двух референсных штаммов ВЭБ из базы данных GenBank — B95-8 (V01555.2) и RefSeq HHV4 (NC_007605.1)показал, что они являются идентичными друг другу в координатах нуклеотидной последовательности анализируемого нами участка гена LMP-1 (168258–168320), что соответствует положению аминокислот 187–386 в белке LMP-1.

Дальнейшее субтипирование ВЭБ в нижегородских изолятах осуществлено на основе метода секвенирования по Сэнгеру самого вариабельного участка генома ВЭБ, а именно фрагмента С-концевой области гена LMP-1. Из 178 изолятов ВЭБ было секвенировано 165 нуклеотидных последовательностей. Последующий анализ полученных аминокислотных последовательностей нижегородских изолятов ВЭБ проводили по нескольким направлениям: 1) дифференциальный анализ вариантов LMP-1ВЭБ на основе классификации R.H. Edwards и соавт. [24]; 2) поиск делеций и вставок; 3) характеристика тандемных повторов; 4) аминокислотные замены.

В результате на основе общеизвестной и широко используемой классификации ВЭБ по R.H. Edwards и соавт. [24] дана оценка штаммовой принадлежности нижегородских изолятов ВЭБ. По итогам филогенетического анализа сформировались 5 клад, которые представляют 5 из 7 известных штаммов вируса, а именноВ95-8, China 1, Med, NC и Alaskan (рис. 1). Отметим, что вариант LMP-1 Med был представлен исключительно Med– (не содержащий САО-подобную делецию 30 н.о./10 а.к.). Варианты LMP-1 Med+, China 2 и China 3 не были идентифицированы ни в одном из нижегородских изолятов ВЭБ. Для подтверждения филогенетической группировки проверены сигнатурные аминокислотные замены, определенные авторами классификации в семи основных локусах LMP-1 ВЭБ в позициях 229, 306, 312, 322, 334, 338, 344. При удалении локуса 344 и повторении анализа, как ранее было описано [24], дискриминация между штаммами сохранялась.

 

Рисунок. Филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения аминокислотных последовательностей С-концевого фрагмента LMP-1, принадлежащих 165 нижегородским изолятам ВЭБ, и 8 референсных последовательностей, полученных из базы данных GenBank/NCBI (метод максимального правдоподобия)

 

Данные табл. 1 демонстрируют, что какого-то конкретного штамма LMP-1 ВЭБ, ассоциированного с ВЭБ-ИМ у детей, не существует. Однако доминирующее положение в нижегородских изолятах ВЭБ занял вариант LMP-1 В95-8, что отмечалось как при активной, так и латентной форме ВЭБ-инфекции. При сравнительной оценке в группе ВЭБ-ИМ варианты В95-8 и China 1 были выявлены в 1,4 и 1,7 раза чаще, чем в группе ВЭБ-ЗД (различия статистически незначимы), а вариант Med– встречался в 4,3 раза реже (р = 0,049). Установлен единственный случай коинфицирования разными вариантами LMP-1, когда у пациента с ВЭБ-ИМ одновременно были выявлены отличающиеся варианты вируса в слюне (B95-8) и лейкоцитах крови (China 1).

Осуществлен поиск делеций и вставок. Всего выявлено 4 варианта делеций: две из них, так называемые САО-подобные делеции (30 н.о./10 а.к., охватывающая кодоны 246–355, и 15 н.о./5 а.к. в области повторяющихся повторов в положении 276–280), а две другие делеции выявлены впервые (6 н.о./2 а.к. в положениях аминокислот 215–216 и 63 н.о./21 а.к. в координатах 335–355). Общая частота делеций в группе детей с ВЭБ-ИМ составила 60,6±6,0%, а ВЭБ-ЗД — 77,4±7,5% (р = 0,162) (табл. 2).

 

Таблица 2. Делеции в С-концевой области LMP-1 ВЭБ и частота их встречаемости в группах ВЭБ-ИМ и ВЭБ-ЗД

Table 2. Deletions in the C-terminal region of EBV LMP-1 and their frequency in the EBV-IM (Infectious Mononucleosis) and EBV-HVC (Healthy Virus Carriers) groups

Группа сравнения Сomparison group	Единицы измерения Units	Делеции/Deletions					Без делеций Not deleted
		6 н.о./2 а.к.(а.к. 215–216) 6 nt./2 aa.(aa. 215–216)	15 н.о./5 а.к.(а.к. 276–280) 15 nt./5 aa.(aa. 276–280)	30 н.о./10 а.к.(а.к. 346–355) 30 nt./10 aa.(aa. 346–355)	63 н.о./21 а.к.(а.к. 335–355) 63 nt./21 aa.(aa. 335–355)	Всего Total
ВЭБ-ИМ EBV-IM (n = 66)	абс./abs.	1	26	12	1	40	26
	P±σp, %	1,5±1,5	39,4±6,0	18,2±4,7	1,5±1,5	60,6±6,0	39,4±6,0
ВЭБ-ЗД EBV-HVC (n = 31)	абс./abs.	1	20	3	0	24	7
	P±σp, %	3,2±3,2	64,5±8,6	9,7±5,3	0	77,4±7,5	22,6±7,5
Уровень значимости различий р-value		р = 0,832	р = 0,021	р = 0,433	–	р = 0,162	р = 0,162

 

Все последовательности ДНК ВЭБ с делецией 30 н.о./10 а.к. были ассоциированы с вариантом LMP-1 China 1. Они выявлялись как в группе ВЭБ-ИМ (18,2±4,7%), так и в группе ВЭБ-ЗД (9,7±5,3%). Различия данных показателей между группами были статистически незначимыми (р = 0,433). Делеция 6 н.о./2 а.к. обнаружена только в изолятах вируса, относящихся к варианту LMP-1 Med–, у одного пациента с ВЭБ-ИМ и одного здорового вирусоносителя. Единственным источником вируса (вариант LMP-1 В95-8), несущего делецию 63 н.о./21 а.к., являлся больной ребенок.

Проведен анализ числа и аминокислотного состава повторяющихся мотивов в области тандемных повторов С-концевого участка LMP-1 (а.к. 253–306). Табл. 3 демонстрирует существенный вклад области тандемных повторов в генетическое разнообразие нижегородских изолятов ВЭБ. Полученные нами последовательности отличались по числу повторов, которое колебалось от 3 до 7, наличию делеции из 5 а.к., присутствию модифицированных повторяющихся мотивов и спектру аминокислотных замен в них. В половине (50,5±5,1%) анализируемых последовательностей был представлен прототипный вариант из 4,5 повторов, все они были ассоциированы исключительно с вариантом LMP-1 В95-8. В изолятах China 1, NС, Med– и Alaskan число повторов варьировало в установленном диапазоне, при этом мотив из 5 а.к. между повторами из 11 а.к. во всех этих последовательностях отсутствовал.

 

Таблица 3. Характеристика числа и аминокислотного состава повторяющихся мотивов в С-концевой области LMP-1 ВЭБ

Table 3. Characteristics of the number and amino acid composition of repeating motifs in the C-terminal region of EBV LMP-1

Штамм Strain	ВЭБ-ИМ EBV-IM (n = 66)	ВЭБ-ЗД EBV-HVC (n = 31)	Повторяющиеся мотивы в С-концевой области LMP-1 ВЭБ (а.к. 253–306) Repeated motifs in the C-terminal region of EBV LMP-1 (aa. 253–306)	Повторы Repeats
NC_007605.1 (RefSeq HHV4)			PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL - - - - - - - PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	4,5
В95-8	38/41	11/13	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL - - - - - - - PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	4,5
	1/41	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL - - - - - - - PQDPDNTDDNG PQDPDNTEDNG PHDPL	4,5
	2/41	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL - - - - - - - PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	5,5
	–	1/13	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	4
	–	1/13	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNADDNG PHDPL	4
China 1	1/12	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	3
	9/12	2/3	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	5
	1/12	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDGNG PQDPDNTDDNG PHDPL	5
	1/12	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	6
	–	1/3	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPL	7
Med–	–	1/6	PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	4
	1/3	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDDG PQGPDNTDDDG PHDPL	4
	–	1/6	PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	4
	1/3	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	5
	–	2/6	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	5
	–	1/6	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	6
	–	1/6	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTNDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	7
	1/3	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPL	7
NC	5/11	1/8	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	3
	–	1/8	PQDPDNTNDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	3
	1/11	–	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQD - - - - - - NG PQDPDNTDDNG PHDPQ	3,5
	3/11	3/8	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	4
	–	1/8	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDANG PHDPQ	4
	–	1/8	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	5
	2/11	1/8	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PHDPQ	6
ALASKAN	–	1/1	PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQDPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PQGPDNTDDNG PHDPР	5

Примечание. PQDPDNTDDNG — повторяющийся мотив из 11 а.к., PHDPL — повторяющийся мотив из 5 а.к., полужирным выделены аминокислотные замены.

Note. PQDPDNTDDNG -11 aa. repeated motif; PHDPL — 5 aa. repeated motif; amino acid substitutions are in bold.

 

Показано, что в любом варианте LMP-1 (B95-8,China 1, Med– и NC) в области тандемных повторов могут быть обнаружены аминокислотные замены. Однако вариант LMP-1 Med– отличался наибольшей вариабельностью в области тандемных повторов. Практически каждая из 9 анализируемых последовательностей Med– была уникальной за счет комбинации разного числа повторов и расположения друг относительно друга повторяющихся прототипных и модифицированных последовательностей из 11 а.к. Модифицированные последовательности в варианте Med– характеризует замена аспарагиновой кислоты на глицин в третьем положении аминокислоты во втором — седьмом мотивах: D266G, D277G, D282G, D293G. Аминокислотные транзиции D282G, D293G также выявлялись в изоляте LMP-1 Alaskan. В мотиве PHDPL, завершающем область тандемных повторов, в отдельных последовательностях присутствовали штамм-характерные аминокислотные замены в положении 306 аминокислоты: в варианте NC — лейцина на глутамин L306Q (PHDPQ), в Alaskan — лейцина на пролин L306P (PHDPP).

Выявлено, что изоляты ВЭБ из разных компартментов (лейкоциты крови и слюна) от одного источника и отнесенные к одному варианту LMP-1 могут быть гетерогенными по своей структуре за счет вариации в области тандемных повторов или по составу аминокислотных замен. Так, в изоляте из лейкоцитов крови ребенка с ВЭБ-ИМ (China 1) область тандемных повторов включала четыре прототипных и один модифицированный (D288G) мотив из 11 а.к., в то время как в последовательности белка вируса, выделенного из слюны, все пять были типичными.

Осуществлен поиск полного спектра аминокислотных замен в пределах анализируемого С-концевого фрагмента белка LMP-1 с 187 по 386 а.к. Суммарно в нижегородских изолятах ВЭБ идентифицировано 100 мутаций аминокислот в 65 локусах (относительно референсной последовательности NC_007605.1). Последовательностей, идентичных дикому штамму ВЭБ, не выявлено. Минимальное число аминокислотных замен (две) обнаружено в единственном изоляте LMP-1 B95-8, а наиболее дивергентная последовательность (16 замен) характеризовала изолят LMP-1 Med–. Для наглядного сравнения степени дивергенции между вариантами LMP-1 проведен расчет индекса, характеризующего среднее число аминокислотных замен, приходящихся на одну последовательность. Анализ выполнен дифференцировано в группах ВЭБ-ИМ и ВЭБ-ЗД. Получены следующие значения индекса: В95-8 — 3,9 и 4,1; China 1 — 6,7 и 6,7; Med– — 12,0 и 12,3; NC — 11,5 и 11,3 соответственно. В единственном изоляте Alaskan содержалось 14 аминокислотных замен. Все выявленные замены по частоте распространения были объединены в три группы.

I группу составили наиболее распространенные в популяции ВЭБ Нижегородского региона 4 замены: G212S, S366T, E328Q и S309N. Замены G212S и S366T присутствовали во всех пяти выявленных вариантах LMP-1, их частота в группе ВЭБ-ИМ составила 95,5±2,1 и 97,0±2,1%, а в группе ВЭБ-ЗД — 100±0 и 83,9±6,6% соответственно. Замена серина на аспарагин в 309 позиции (S309N) присутствовала в составе всех анализируемых последовательностей вариантов China 1, NC, Med– и Alaskan. Аминокислотная транзиция E328Q выявлена только в изолятах LMP-1 B95-8 в 100% последовательностей.

Во II группу включены аминокислотные замены с частотой 10–25% от общего числа изолятов. В их числе 10 сигнатурных аминокислотных замен в 6 основных локусах (S229T, L306Q, L306P, D312N, Q322E, Q322N, Q322T, Q334R, L338S, L338P), которые используются при дифференциальной оценке вариантов LMP-1 по классификации R.H. Edwards и соавт. [24]. В эту группу вошли также дополнительные штамм-характерные мутации для China 1 (E214Q), NC (D250N, S313P, G331Q, H352N, H358P) и Med– (замена аспарагиновой кислоты на глицин в третьем положении аминокислоты в повторяющемся мотиве из 11 а.к.: D266G, D282G, D293G и т.д.).

III группа представлена широким спектром аминокислотных замен, которые в нижегородских изолятах ВЭБ встречались спорадически (< 10%). Среди них D210A, G243A, G252A, D317Y, E326D, D349N, H352R, T361M, L364W, S366A, S367Y обнаруживали в единичных изолятах, отнесенных к разным вариантам LMP-1, независимо от формы ВЭБ-инфекции. Кроме того, замены E214Q, S229T, D250N, S309N, Q322T, Q334R, L338P, L338S встречались в нехарактерных штаммах. Отдельные аминокислотные замены выявлялись только в каком-то одном варианте LMP-1, при этом определенная часть из них не дублировала друг друга в группах ВЭБ-ИМ и ВЭБ-ЗД:

• B95-8: ВЭБ-ИМ/ВЭБ-ЗД — E328Q; ВЭБ-ИМ — A207P, D209H, D210Y, E214D, E214K, E214N, H225R, D298E, G315E, G351S, H352K, G354S, G355N, G355V, D356N, P357S, T361K; ВЭБ-ЗД — D210S, E214H, D216H, D216N, E221D, D285A, D288A, L323F, G331S, S350P, L359R, L364F;
• China 1: ВЭБ-ИМ/ВЭБ-ЗД — Q322N; ВЭБ-ИМ — D288G;
• Med–: ВЭБ-ИМ/ВЭБ-ЗД — D277G, D282G, D293G, Q322E, V327D, D333H; ВЭБ-ИМ — G246E, N289D, Q322D, Q334K, P337A; ВЭБ-ЗД — G222A, G222S, R223T, H225N, D266G, S311I, A314T, E328G, K330T, D333A, G335S, H348Y, G351A, D356P;
• NC: ВЭБ-ИМ/ВЭБ-ЗД — L306Q, S313P, G331Q, H352N, H358P; ВЭБ-ИМ — G335D, P357Q, G368S; ВЭБ-ЗД — G243H, G260N, G331R;
• Alaskan: ВЭБ-ЗД — G232A, L306P, S309N, D312N, S313A, G331A, L338P, G353R, G345S, G354D, G355T.

Наиболее «горячими» точками замен стали аминокислоты в положениях 214 (пять), 322 и 331 (по четыре). Отметим, что относительно часто и только при ВЭБ-ИМ встречались транзиции D209H в изолятах В95-8 (5/41) и G335D в изолятах NC (5/11).

Анализ изученных ранее другими исследователями аминокислотных замен в контексте так называемых САО-подобных мутаций (первый штамм, полученный от пациента с РНГ в Китае) показал, что в нижегородских изолятах замены G212S и S366T имеются практически во всех установленных последовательностях, Q322N является уникальной заменой для штамма China 1, а Q334R, L338S — сигнатурные замены, характеризующие штаммы China 1 и Med–. Такие транзиции, как Q189P, S192T и E328A, в анализируемых последовательностях обнаружены не были.

Обсуждение

К настоящему времени литературные данные, полученные разными исследовательскими группами, продемонстрировали высокую степень генетической гетерогенности ВЭБ, циркулирующего во всем мире [2, 10, 12, 13, 16, 17, 23, 33, 37, 40, 41]. Исторически первой классификацией ВЭБ и, как подтверждают современные работы, главным паттерном его генетического разнообразия является деление на два основных типа — ВЭБ-1 и ВЭБ-2 [22]. Однако на момент начала проведения настоящего исследования данные о типовой структуре вирусной популяции ВЭБ в РФ отсутствовали. В представленной работе оптимизированный нами ранее методический подход к дифференциальной детекции ВЭБ-1/ВЭБ-2 [4, 5] позволил оценить распространенность разных типов вируса в детской популяции Нижегородского региона. Полученные данные о доминирующем положении ВЭБ-1 среди нижегородских изолятов соответствуют предыдущим оценкам распространенности ВЭБ-1 и ВЭБ-2 среди населения разных регионов мира.

Известно, что оба типа ВЭБ встречаются повсеместно. Однако ВЭБ-1 преобладает среди населения Европы, Северной и Южной Америки, Китая, Юго-Восточной Азии, Австралии [12, 16, 29, 31, 37, 41]. В то же время ВЭБ-2 считается характерным типом вируса, циркулирующим в регионе Африки к югу от Сахары и Папуа — Новой Гвинеи [18, 44]. Относительно небольшой процент представителей европеоидной расы инфицированы ВЭБ-2 [22]. Предполагается, что инфицирование ВЭБ-2 может происходить в условиях хронической иммунной активации, например, в тех частях Африки, где много сопутствующих инфекций, включая малярию, или у иммунокомпрометированных лиц [25, 44].

Основное фенотипическое различие между двумя типами вируса заключается в том, что ВЭБ-1 трансформирует В-лимфоциты человека более эффективно, чем ВЭБ-2 [18, 39]. Но недавние сообщения о том, что ВЭБ-2 инфицирует Т-клетки как в культуре, так и in vivo (например, у кенийских детей) определяют необходимость продолжения исследований биологического значения основных типов ВЭБ [20, 21]. Кроме того, до настоящего времени имеется мало доказательств о связи заболеваний с определенным типом ВЭБ.

Ген LMP-1 ВЭБ и кодируемый им одноименный белок многие десятилетия привлекали внимание ученых всего мира в связи с их выраженным структурно-функциональным полиморфизмом и высоким онкогенным потенциалом. В РФ за последние 20 лет были проведены исследования гена LMP-1 ВЭБ в контексте изучения его особенностей в неэндемичном по ВЭБ-ассоциированным онкологическим заболеваниям регионе мира. Основная часть полученных к настоящему времени результатов российских исследователей была сгенерирована на основе применения методических подходов, включающих секвенирование по Сэнгеру, главным образом, С-концевой области гена LMP-1 с последующей оценкой его геновариантов по классификации R.H. Edwards и соавт. [24]. При ВЭБ-ассоциированных онкологических заболеваниях среди представителей разных регионов России образцы LMP-1 были отнесены к вариантамB95-8, China 1, Med+ и Med– и NC [1, 3, 6]. Результаты исследований среди здорового населения свидетельствуют о том, что частота выявления геновариантов LMP-1 в разных регионах и этнических группах на территории РФ существенно различается. Выявленные в российской популяции варианты LMP-1 «вне варианта» классификации по R.H. Edwards и соавт. [24], а также вновь выявленные точечные мутации до сих пор остаются фенотипически не охарактеризованными [1, 3, 9, 10]. Сведения о проведении полногеномных исследований ВЭБ в России отсутствуют.

В нашем исследовании на основе метода секвенирования по Сэнгеру С-концевого фрагмента гена LMP-1 проведено субтипирование полученных нижегородских изолятов ВЭБ от детей с разными формами ВЭБ-инфекции. Поскольку до настоящего времени другими исследователями вариабельность данного гена оценивалась с позиции изменений аминокислот, а не нуклеотидов, мы также обобщили полученные нами результаты на аминокислотном уровне (в координатах а.к. 187–386). Установлена штаммовая принадлежность нижегородских изолятов ВЭБ по классификации R.H. Edwards и соавт. [24]. В общем выявлено 5 из 7 известных вариантов LMP-1, а именно В95-8, China 1, Med–, NC и Alaskan. Результаты собственных исследований дополняют уже имеющиеся сведения о доминировании на территории Европейской части России прототипного варианта LMP-1 B95-8 [1, 6, 10]. До сих пор варианты LMP-1 China 2, China 3 и Alaskan среди россиян полностью отсутствовали [1, 3, 6, 7, 9]. Впервые в РФ нами обнаружен вариант LMP-1 Alaskan. Отметим, что изолят ВЭБ, в котором он был идентифицирован, принадлежал к типу ВЭБ-2. При сравнительной оценке с данными других исследователей следует учитывать тот факт, что в Нижегородском регионе проживает многонациональное население, и нами впервые были обследованы дети с ВЭБ-инфекцией, а не взрослые.

К настоящему времени накоплены сравнительные данные о биологических свойствах вариантов LMP-1. В разных исследованиях было продемонстрировано, что варианты САО [44], а также Alaskan, China 1 и Med+ повышают активность транскрипционного фактора NF-κB по сравнению с другими вариантами [32]. Особое внимание было сосредоточено на делеции в 30 н.о./10 а.к. (а.к. 346–355) [1, 27, 44]. Делетированный вариант продемонстрировал выраженную транcформирующую активность по сравнению с прототипным В95-8 в фибробластах грызунов или эпителиальных клетках, имплантированных голым мышам [18], а также имел повышенный риск отдаленного метастазирования [35, 44]. В настоящее время установлено широкое распространение вариантов LMP-1 c этой делецией как среди больных ВЭБ-ассоциированными заболеваниями, так и у здоровых носителей ВЭБ во всем мире. Результаты проведенного нами исследования подтверждают неспецифический характер данного полиморфизма для ИМ, но не исключают его влияния на выраженность клинических проявлений инфекции.

В половине нижегородских изолятов в области тандемных повторов выявлена делеция 5 а.к. между повторяющимися мотивами из 11 а.к., которую также относят к числу САО-подобных [27]. Отметим, что интерпретация ее координат остается в разных исследовательских работах неоднозначной (а.к. 275–279 или а.к. 276–280) [7, 27]. В нашем исследовании впервые была обнаружена делеция 63 н.о./21 а.к. в координатах а.к. 335–355. В общем, обширные делеции 64 и 69 п.н, перекрывающие участок делеции из 10 а.к., выявляются, как правило, редко [8]. Считается, что они связаны со снижением активации фактора транскрипции АР-1 [41].

Продемонстрирована существенная вариабельность области тандемных повторов (а.к. 253–306). Известно, что последовательности референсных штаммов ВЭБ имеют четыре идеальных повтора, состоящих из 11 а.к. (PQDPDNTDDNG) с разрывом в 5 а.к. (PHDPL) между вторым и третьим повторами. Аналогичный мотив из 5 а.к. PHDPL является завершающим область тандемных повторов (а.к. 302–306). Отметим, что при предоставлении результатов, характеризующих область тандемных повторов, одни группы исследователей используют вариант обозначения «4,5 повтора» [16, 26], а другие описывают количество всех повторов из 11 а.к. и 5 а.к. по-отдельности [2, 3, 7, 10]. Поскольку последний фрагмент из 5 а.к. во всех последовательностях присутствует постоянно, мы склоняемся к трактованию результатов, основанному на принципе «4,5 повтора». Заслуживают внимания работы, в которых была выявлена статистически значимая связь числа повторов с заболеваниями. Так, аргентинские исследователи установили, что изоляты из ткани опухолей чаще содержат 5,5 повторов [26], а сербские ученые обнаружили, что повышение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы у больных ИМ, всегда ассоциировано с вариантами ВЭБ с 3-мя или 4-мя повторами [16].

Аминокислотные замены G212S, Q322N, L338S и S366T по данным литературы сопряжены с САО-подобными вариантами LMP-1 (China 1 и Med). Несмотря на то, что замена в 212 положении является штамм-характерной для China 1, China 2, China 3 и Alaskan [24], в российских изолятах LMP-1 до недавнего времени отмечалось ее полное отсутствие [1]. Лишь относительно недавно появились сообщения о ее выявлении на территории РФ [9]. Примечательно, что в основной части нижегородских изолятов ВЭБ была выявлена двойная замена G212S/S366T. Данное сочетание, как ранее было изучено, функционально ассоциировано с повышением уровня активации сигнального пути NF-kB и протеинкиназы-В (PKB/Akt) [1, 8]. По данным других исследователей любая из замен (G212S либо S366T) ассоциирована с усилением активации Erk и индукции экспрессии c-Fos [45], что влияет на процессы выживания, пролиферации, дифференцировки и миграции клеток. По данным литературы у больных РНГ из России довольно часто наблюдали замену S366А [6], которая также была нами обнаружена в двух нижегородских изолятах у детей с ИМ (варианты В95-8 и China 1).

Замена E328Q достаточно широко распространена среди жителей России [7, 11], встречается в изолятах ВЭБ от больных ИМ и РНГ в Сербии [15, 16]. Ее функциональную роль связывают со снижением цитотоксичности и усилением трансформирующей активности белка LMP-1. В нижегородских изолятах ВЭБ данная мутация ассоциирована исключительно с вариантом LMP-1 В95-8 с частотой выявления 100%. Предполагается, что обнаруженные аминокислотные замены в 212, 328 и 366 положениях LMP-1 придают этому онкобелку агрессивные характеристики и характерны для высокотуморогенных вариантов [7].

Остальная часть выявленных в настоящем исследовании мутаций остаются фенотипически не охарактеризованными. Можно предположить, что они потенциально могут изменять профиль внутриклеточной активности ряда сигнальных путей и их биологические свойства [9]. Для выяснения роли каждого из них необходимо проведение экспериментальных работ in vitro и in vivo.

Как общая тенденция, при активной ВЭБ-инфекции (ИМ) отмечено появление гетерогенных по структуре последовательностей ВЭБ, выделенных из лейкоцитов крови и слюны от одного инфицированного лица. Отличающиеся геноварианты ВЭБ в одном биологическом образце, так называемые корезидентные варианты, в данном исследовании не были выявлены. По сложившимся представлениям гетерогенность LMP-1 ВЭБ чаще возникает во время репликации вирусного генома в ротоглотке [38]. Отметим, что о множественных штаммах наиболее часто сообщается в работах, выполненных на основе гетеродуплексного анализа [40, 43].

Заключение

Применение оптимизированного варианта однораундовой ПЦР позволило оценить типовую структуру ВЭБ, циркулирующего среди детей в Нижегородском регионе. Во всех клинических изолятах, установленных от больных ВЭБ-ИМ, идентифицирован только ВЭБ-1, среди здоровых вирусоносителей доля ВЭБ-1 составила 93,8±4,3%, а ВЭБ-2 — 6,2±4,3%. Случаев коинфекции обоими типами вируса не выявлено.

С использованием метода секвенирования по Сэнгеру С-концевого фрагмента гена LMP-1получены новые данные о распространенности различных вариантов вируса при активной и латентной ВЭБ-инфекции у детей. Всего выявлено 5 вариантов LMP-1: В95-8, China 1, Med–,NC и Alaskan, среди которых доминировал геновариант В95-8. Вариант Alaskan в РФ выявлен впервые. Варианты Med+, China 2 и China 3 не были обнаружены ни в одном из исследованных образцов.

Определено, что наиболее распространенными в нижегородских изолятах ВЭБ у детей являются 4 аминокислотные замены: G212S, S366T, E328Q и S309N, которые характеризуются высоким трансформирующим потенциалом инфицированных клеток преимущественно за счет активации сигнального пути NF-kB.

Сравнительный анализ показал, что штаммы, делеции, повторы, аминокислотные замены в изолятах ВЭБ из биологических образцов у детей с активной ВЭБ-инфекцией имели общие характеристики с группой здоровых вирусоносителей. Как общая тенденция, при активной форме ВЭБ-инфекции отмечено появление случаев несовпадающих штаммов и вариантов ВЭБ между разными компартментами (лейкоциты крови и слюна) в организме одного инфицированного лица.

В целом оценка генетического разнообразия ВЭБ является основой для решения ключевого вопроса о потенциальной взаимосвязи разных геновариантов ВЭБ с особенностями клинического течения ВЭБ-ассоциированных заболеваний, разработки средств их специфической профилактики и лечения, перспективного развития молекулярно-генетического мониторинга циркулирующих геновариантов вируса и совершенствования системы эпидемиологического надзора за ВЭБ-инфекцией.

 

¹ Сокращенное обозначение генов ВЭБ приведено согласно данным GenBank. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term = Human+gammaherpesvirus+4

² URL: https://www.megasoftware.net

³ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

⁴ URL: https://www.R-project.org

⁵ URL: http://www.rstudio.com

About the authors

Mariia I. Popkova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Author for correspondence.
Email: popmarig@mail.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

Oleg V. Utkin

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Head of Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

Daria A. Bryzgalova

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: popmarig@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

Nikolai A. Sakharnov

Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology

Россия, Nizhniy Novgorod

Evgeniya A. Soboleva

Nizhny Novgorod Regional Center for the Prevention and Control of AIDS and Infectious Diseases

Email: popmarig@mail.ru

Infectologist

Россия, Nizhny Novgorod

Ekaterina A. Kulova

“Tonus Krokha i Semeynaya Stomatologiya” LLC

Email: popmarig@mail.ru

PhD (Medicine), Infectologist, Allergologist and Immunologist

Россия, Nizhniy Novgorod

References

Supplementary files