Assessing a potential to improve data quality for accelerated identification of microorganisms derived from positive blood cultures

Almaz V. Khaliulin; Халиулин Алмаз Вадимович; Artem V. Lyamin; Лямин Артем Викторович; Oksana A. Gusyakova; Гусякова Оксана Анатольевна; Dmitry V. Alekseev; Алексеев Дмитрий Владимирович; Vsevolod M. Stepanov; Степанов Всеволод Михайлович

doi:10.15789/2220-7619-AAP-2028

Assessing a potential to improve data quality for accelerated identification of microorganisms derived from positive blood cultures

Authors: Khaliulin A.V.¹, Lyamin A.V.¹, Gusyakova O.A.¹, Alekseev D.V.¹, Stepanov V.M.¹
Affiliations:
1. Samara State Medical University of MH RF
Issue: Vol 13, No 2 (2023)
Pages: 369-375
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 13.09.2022
Accepted: 21.02.2023
Published: 24.04.2023
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/2028
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-AAP-2028
ID: 2028

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Diagnostics of blood-borne infections is still an urgent problem of modern medicine. The main causative agents of septic conditions are gram-positive microorganisms particularly Staphylococcus aureus, enterococci, etc., whereas clinical significance of isolated coagulase-negative staphylococci is ambiguous. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and other enterobacteria, as well as Acinetobacter baumannii prevail among the gram-negative flora. Modern possibilities of accelerated identification of microorganisms derived from positive blood cultures based on mass-spectrometry consist of two approaches. Firstly, the manufacturers’ developed consumables for mass spectrometry are proposed, and secondly, there are “domestic” developments of accelerated sample preparation protocols developed by microbiological laboratories. The approaches used have a number of advantages and disadvantages, but to summarize, the use of the proposed methods in routine practice is quite limited. At the same time, the need to accelerate the issuing a microbiological conclusion related to nosology is great being associated with improved outcomes. In this regard, the aim of the study was to evaluate convergence and accuracy of results for accelerated identification of microorganisms derived from positive blood cultures in blood-borne infections. The study included 87 positive blood cultures, the identification of pathogens from them occurred in four ways: the classical microbiological analysis of blood for sterility, pathogen identification directly from the vial without isolating a pure culture, as well as two sample preparation methods based on ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and potassium ethylenediaminetetraacetate disubstituted (EDTA-K2) as wash additives. It was found that gram-positive and gram-negative flora were isolated from the blood almost evenly often. When evaluating an influence of biomaterial used for mass spectrometry, it turned out that use of wash additives increases chances of successful identification of bacteria from a blood sample. The influence of tinctorial properties on the results of determining the species assignment of isolates was also evaluated. Identification of gram-positive flora is more accurate, since some pathogens were not identified without washing additives, and when using EDTA-K2 and the corresponding acid, assignment to the genus was obtained in the same samples. A similar pattern was also characteristic of gram-negative flora. At the same time, modern manufacturers of laboratory equipment and reagents allow to standardize sample preparation procedures in the protocols used. The effects of EDTA-K2, which allowing to use it as a washing component, are associated with the binding of calcium and magnesium ions in solution, which reduces the adhesion of bacterial cells to blood cells, thereby contributing to better mass spectrometry of microbial sediments with accelerated identification of microorganisms from positive blood cultures. Thus, use of the described additives can provide high quality, timely and adequate diagnostics of serious and life-threatening conditions such as blood-borne infections.

Keywords

sample preparation, rapid identification, bloodstream infections, bacteremia, biomaterial, centrifugation

Full Text

Введение

Инфекции кровотока по-прежнему характеризуются высокой смертностью в структуре инфекционной патологии [2]. Среди грамотрицательных возбудителей септических состояний наиболее часто выделяются Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, а среди грамположительной флоры наиболее часто идентифицируются Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium, у детей особую этиологическую роль играет Streptococcus agalactiae. Отдельно следует отметить, что диагностическая значимость выделения коагулазонегативных стафилококков дискутабельна, и наиболее часто выделение представителей данной группы микроорганизмов указывает на возможную контаминацию пробы кожной микрофлорой [1]. По данным литературы, грибы редко вызывают инфекции кровотока и, в подавляющем большинстве, фунгемия обусловлена представителями рода Candida.

Имеющиеся на данный момент подходы к идентификации микроорганизмов из положительных гемокультур складываются из двух основных направлений: микробиологические лаборатории могут использовать коммерческие наборы, разработанные с учетом процедур валидации и верификации, а также множество разнообразных «домашних» протоколов пробоподготовки, разработанных специалистами «на местах» для последующей идентифкации патогенов. К первой группе методов могут быть отнесены наборы Sepsityperkit^® и RapidSepsityper^® (Bruker Daltonics, Германия), набор для посева крови Vitek MS^® (bioMérieux, Франция), набор RapidBACpro^® II (NittoboMedicalCo., Япония) [5, 10]. Внутренние протоколы лабораторий характеризуются разнообразием используемых технологий, которые могут включать: применение разных режимов центрифугирования, использование пробирок с разделительным гелем, а также различных добавок для лизиса компонентов крови и клеточного детрита, например сапонин, додецилсульфат, тритон Х-100, хлорид аммония, трифторуксусная кислота [6, 15]. Обобщая описанные работы, можно заключить, что если протокол прост и не трудоемок, то частота идентификаций остается невысокой — в пределах 50–70%, в то время как более эффективные методики (80–90% успешных случаев идентификации) требуют больше времени и специальных реагентов, что ограничивает их использование в рутинной микробиологической практике.

Улучшение выживаемости при развитии инфекций кровотока обусловлено ранним назначением этиотропной антибактериальной или противогрибковой терапии [8]. В связи с этим актуальными остаются разработки простых и удобных методов ускоренной идентификации патогенов, в том числе с определением чувствительности к антибактериальным препаратам.

Цель исследования — оценка сходимости и точности результатов разных протоколов пробоподготовки при ускоренной идентификации микроорганизмов, выделенных из положительных гемокультур при инфекциях кровотока, при использовании разных отмывочных растворов.

Материалы и методы

В исследование включено 87 положительных гемокультур, полученных при использовании автоматического микробиологического анализатора Юнона LABSTAR 100» (SCENKER, Китай). Идентификация патогенов проводилась 4 способами: I способ — выделение чистой культуры микроорганизма на коммерческих универсальных питательных средах (классическое микробиологическое исследование крови на стерильность); II способ — идентификация из положительной гемокультуры без выделения чистой культуры из микробного осадка [4]; III способ — 4 мл крови из положительной гемокультуры помещали в пробирку с разделительным гелем, туда же добавляли 1 мл 5% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК); IV способ — 4 мл крови из положительной гемокультуры помещали в пробирку с разделительным гелем и этилендиаминтетраацетатом калия двузамещенным (ЭДТА-К2). Далее проводились идентичные действия с пробирками ЭДТУК и ЭДТА-К2. Центрифугировали при 1000g в течение 12 мин, сливали надосадок. Отмывали осадок 1,5–2,0 мл 0,9% хлорида натрия, отбирали 1,0 мл суспензии, далее центрифугировали при 100g 3 мин, отбирали строго 700 мкл надосадка и центрифугировали его при 10 000g 2 мин, удаляли надосадок, далее добавляли по 25–40 мкл ацетонитрила и 70% муравьиной кислоты (в зависимости от величины осадка), ресуспензировали, центрифугировали при 10 000g 2 мин, удаляли надосадок и на мишень для масс-спектрометрии стерильной петлей наносили материал с осадка, высушивали на воздухе, покрывали матрицей (α-циано-4-гидроксикоричная кислота). Масс-спектрометрию проводили на приборе Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия) в режиме Sepsityper, согласно инструкции производителя. Видовая идентификации достигалась при score более 1,800, родовая идентификация при значении 1,600–1,7999, а при значении показателя 0–1,599 идентификация считалась неудачной. В качестве отрицательного контроля использовали раствор матрицы, положительного контроля — штамм кишечной палочки Американской коллекции типовых культур Escherichia coli (АТСС 25922). Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «ЮУГМУ Минздрава России» (протокол № 9 от 04.12.2021).

Группировку данных и вычисления проводили с использованием пакета программ MicrosoftExcel^® 2013. Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 2.8.7 (разработчик — ООО «Статтех», Россия). Категориальные данные описывались с указанием процентных долей. Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью, критерия хи-квадрат Пирсона (при значениях ожидаемого явления более 10).

Результаты и обсуждение

При идентификации микроорганизмов классической методикой было выявлено следующеераспределение патогенов: отмечается незначительное преобладание частоты выделения грамотрицательной флоры из образцов (53%), 47% заняли представители грамположительной флоры. Среди грамположительных микроорганизмов в подавляющем большинстве случаев выделялся Staphylococcus epidermidis, реже выявлялись S. aureus и Staphylococcus haemolyticus. Редкими изолятами были E. faecalis, а также представители рода Corynebacterium.

Грамотрицательные микроорганизмы в нашем исследовании характеризовались большим видовым разнообразием (рис. 1).

Рисунок 1. Видовое разнообразие грамотрицательной флоры, выделенной из крови пациентов

На первом этапе нами был выполнен анализ частоты успешной идентификации в зависимости от биоматериала (рис. 2).

Рисунок 2. Анализ частоты успешной идентификации в зависимости от биоматериала для масс-спектрометрии

Исходя из полученных данных при оценке идентификации в зависимости от биоматериала, нами были установлены статистически значимые различия (p = 0,002). Таким образом, использование ЭДТА-К2 способствует увеличению частоты идентификации микроорганизмов из положительной гемокультуры.

С целью уточнения того, результат идентификации каких микроорганизмов улучшился, мы провели анализ зависимости точности идентификации от исследуемого материала и тинкториальных свойств микроорганизмов (табл.).

Таблица. Анализ точности идентификации в зависимости от биоматериала и тинкториальных свойств

Table. Analysis of the accuracy of determination depending on the biomaterial and tinctorial properties

	Точность идентификации Accuracy of identification	Биоматериал Biomaterial			p
	Точность идентификации Accuracy of identification	Осадок, % Pellet, %	Осадок-ЭДТУК, % Pellet-EDTA, %	Осадок-ЭДТА-К2, % Pellet-EDTA-K2, %	p
Грамположительные микроорганизмы, n = 47 Gram-positive microorganisms, n = 47	Видовая Species	37,9	33,3	39,1	0,015* p_{Осадок — Осадок-ЭДТА-К2} = 0,012
	Родовая Genus	1,1	10,3	5,7
	Идентифкация не прошла Failed	6,9	2,3	1,1
Грамотрицательные микроорганизм, n = 40 Gram-negative microorganisms, n = 40	Видовая Species	41,4	40,2	43,7
	Родовая Genus	3,4	8,0	10,3
	Идентифкация не прошла Failed	9,2	5,7	0,0

Примечание. * — различия показателей статистически значимы (p < 0,05).

Note. * — significant differences (p < 0.05).

Согласно полученным данным, при сопоставлении точности идентификации и тинкториальных свойств в зависимости от материала были установлены существенные различия (p = 0,015). Выявлено, что при использовании осадка микробов в качестве материала для масс-спектрометрии приемлемый результат идентификации не был получен в 16,1% случаев, в то время как использование отмывочных растворов позволяет более точно определить принадлежность патогена к определенным таксономическим группам: в группе грамположительных микроорганизмовне были идентифицированы 6,9% образцов, в то время как при использовании отмывочных растворов доля неудавшихся идентификаций уменьшилась, а доля родовой и видовой идентификации увеличилась. Для грамотрицательной флоры были получены аналогичные результаты. При этом достоверных различий в результатах идентификации при сравнении групп ЭДТУК и ЭДТА-К обнаружено не было.

Обсуждение

В представленной выборке распределение микрофлоры по тинкториальным свойствам при окраске по методу Грама оказалось следующим: примерно поровну для каждой из групп микроорганизмов.

Результаты оценки факторов преаналитического этапа (в частности выбор протоколов пробоподготовки) показали их приоритетное влияние на качество результата идентификации микроорганизмов. В научной литературе имеются данные о сложностях, связанных с масс-спектрометрией грамположительных микроорганизмов, что может быть связано с отличным от грамотрицательной флоры строением бактериальной стенки. В частности, большинство протоколов ускоренной идентификации микроорганизмов из положительных гемокультур основаны на экстракции микросомальных белков из бактериальных клеток, что может обуславливать ограничения в идентификации грамположительных микробов в силу мощного слоя пептидогликанов, препятствующего выходу белков из цитоплазмы бактерии. Наш протокол предполагает сравнение двух отмывочных добавок: 5% раствор ЭДТУК и ЭДТА-К2. Оказалось, что использование отмывки увеличивает долю идентификации грамположительных патогенов, что связано с конкуренцией ЭДТУК и ЭДТА-К2 за ионы кальция и магния, которые требуются микробным клеткам для адгезии между собой и клетками крови, прежде всего эритроцитами [11]. Подобный эффект описан для моно-, ди- и тринатриевой соли ЭДТУК, однако, как видно из нашей работы, он характерен и для дикалиевой соли ЭДТА. Согласно литературным данным, описано действие солей и собственно ЭДТУК на грамположительную, грамотрицательную микрофлору, грибы и амебы [7]. Грамотрицательная флора требует присутствия двухвалентных катионов, таких как Mg²⁺ и Ca²⁺, для стабилизации отрицательно заряженных участков олигосахаридных цепей липополисахаридной стенки. При этом ЭДТА способна удалять катионы из внешнего листка липополисахаридов, обнажая фосфолипиды цитоплазматической мембраны, что увеличивает ее нестабильность [7]. В случае грамположительной флоры механизм действия ЭДТА основан на следующем: в физиологических условиях у микроорганизмов присутствует семейство цистеиновых транспептидаз — сортаз, ответственных за перенос пептидных остовов на поверхность мембраны, для построения пилей, которые обеспечивают адгезию бактериальной клетки к клеткам организма-хозяина. Кроме этого, сортазы способны сортировать пептиды по бактериальной стенке и «пришивать» их к ней. При этом отмечено, что данные молекулярные структуры не являются жизненно необходимыми для роста и размножения бактериальных клеток, однако они формируют значительный вирулентный потенциал данной группы микроорганизмов [3]. Важно отметить, что грампозитивные микроорганизмы различаются количеством сортаз, количеством пилиновых остовов, необходимых для построения пилей, классом сортаз, а также типами пептидов, транспортируемых к клеточной стенке и акцепторными участками на поверхности бактериальной стенки [13]. Описано, что аллостерическим активатором сортазы типа А, характерной для золотистого стафилококка, являются ионы Ca²⁺, которые способствуют увеличению активности синтеза пилей и облегчают распознавание сортазами специфических субстратов. Таким образом, логичным представляется эффект ЭДТА в описанном протоколе пробоподготовки, который нивелирует активирующее действие катионов и уменьшает адгезию грамположительной флоры к клеткам крови, что в итоге способствует увеличению микробной массы в конечном материале для масс-спектрометрии, а это, в свою очередь, повышает долю «успешных» идентификаций патогенных микроорганизмов [9]. Различные соли ЭДТА используются в клинической практике с целью уменьшения образования биопленок в стоматологии, хирургии, а также как потенциирующее средство с рядом антимикробных химиопрепаратов [12, 14].

Результаты наших исследований показали, что статистически достоверной разницы в частоте успешной идентификации микроорганизмов при использовании собственно этилендиаминтетрауксусной кислоты и ЭДТА-К2 не обнаружено, однако с точки зрения трудоемкости и стандартизации методики предпочтение отдается использованию дикалиевой соли ЭДТА, которая доступна как компонент в виде готовых вакуумных пробирок.

Таким образом, проблемы недостаточно успешной идентификации грампозитивной флоры из положительных гемокультур можно решить при использовании известных, доказанных явлений, но в несколько новом «прочтении». Это может способствовать более качественной, своевременной и адекватной диагностике таких серьезных и жизнеугрожающих состояний как инфекции кровотока.