Molecular genetic characteristics of Vibrio cholerae nono1/nono139 strain, the causative agent of a new case of acute intestinal infection in Rostov-on-Don

Full Text

Введение

Как известно, холерные вибрионы неО1/неО139 серогрупп (НАГ-вибрионы) являются естественными обитателями поверхностных водоемов и в большинстве своем не содержат генетических детерминант ключевых факторов патогенности Vibrio cholerae — холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей (TCP). Они не склонны к эпидемическому распространению, но в определенных условиях могут выступать в роли этиологических агентов спорадических случаев и даже локальных вспышек острых кишечных инфекций (ОКИ), реже — внекишечных форм заболеваний [7]. В Ростовской области Российской Федерации (РФ) более 50 лет (с конца 1960-х гг.) существует довольно гетерогенная популяция НАГ-вибрионов, представители которой периодически, с перерывами от 1 до 4 лет, вызывают у людей ОКИ [1, 2], хотя из водоемов выделяются постоянно. Последний больной был выявлен в области в 2018 г., после чего (в период пандемии COVID-19) клинические штаммы НАГ-вибрионов на территории России не регистрировались. Однако в июне 2022 г. в Ростове снова был выявлен больной ребенок, от которого были выделены две субкультуры НАГ-вибриона. Поскольку представители этой группы крайне гетерогенны по количественному и качественному составу детерминант факторов патогенности [7], представлял интерес вопрос о том, какие именно из них могли явиться причиной реализации возбудителем патогенетического потенциала.

Цель настоящего исследования состояла в биоинформационном анализе полногеномных сиквенсов выделенного в 2022 г. клинического штамма V. cholerae nonO1/nonO139, генетических детерминант факторов патогенности и продуктов их трансляции.

Материалы и методы

Объектами исследования служили 2 штамма V. cholerae nonO1/nonO139, выделенные от одного и того же больного ребенка с интервалом в 3 дня.

Штаммы идентифицировали бактериологическим методом и в ПЦР в режиме реального времени в соответствии с МУК 4.2.3745-22 [6] с использованием набора «АмплиСенс^® Vibrio cholerae-FL» (Регистр. удостоверение № ФСР 2011/11139). Чувствительность к антибиотикам определяли согласно этим же методическим указаниям [6].

Полногеномное секвенирование на платформе MiSeq Illumina и SNP-анализ проводили как описано ранее [4]. Для идентификации в полных геномах (WGSs) отдельных генов и их кластеров использовали программу BioEdit 7.2.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit), генетических детерминант лекарственной устойчивости — базу CARD (https://card.mcmaster.ca) и последовательности других найденных в NCBI генов, встречающихся у холерных вибрионов. Трансляцию генов, анализ их нуклеотидных последовательностей и аминокислотных (аа) последовательностей их продуктов осуществляли с использованием пакета программ Vector NTI Advance 11 (Invitrogen). Прототипами служили WGSs референс-штамма V. cholerae N16061 (AE003852, AE003853) и V. cholerae O37 AM-19226 (AATY0200000000). Для определения наличия и локализации активных доменов в белках выполняли BLASTP-анализ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Результаты и обсуждение

Выделение, идентификация и фенотипические свойства возбудителя

Больная N., 10 лет, жительница Ростова-на-Дону, была осмотрена на дому врачом скорой помощи, прибывшим 16.06.2022 г. по вызову в связи с жалобами ребенка на желудочно-кишечное расстройство, боль в животе и слабость, и поставлен предварительный диагноз «неуточненный гастроэнтерит и колит инфекционного происхождения». Помимо оральной регидратационной терапии был назначен препарат антибиотика амоксициллина. Из отобранного материала (feces) в Городской лаборатории клинической микробиологии на третий день был выделен штамм № 46, идентифицированный как нетоксигенный V. cholerae nonO1/nonO139. Он был передан в референс-центр по мониторингу за холерой (ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора), где его видовая и серогрупповая принадлежность была подтверждена. Параллельно были переданы трехкратно повторно отобранные пробы клинического материала от этой же больной, а также от контактного лица (матери девочки, 38 лет). В результате бактериологического исследования клинического материала от больной был выделен нетоксигенный штамм V. cholerae nonO1/nonO139 № 19, а в материале от матери НАГ-вибрионов обнаружено не было. На шестой день от начала заболевания в институт вновь поступили трехкратно отобранные пробы от больной, результат бактериологического исследования на наличие холерных вибрионов на этот раз оказался отрицательным. За ребенком проводилось ежедневное наблюдение в течение 7 дней, до полной нормализации состояния.

Выделенные культуры были идентичными по морфологическим и биохимическим признакам, характерным для вида V. cholerae, не агглютинировались сыворотками О1, Огава, Инаба, О139, RO. По результатам ПЦР они имели генотип ctxA^–, tcpА^–, hly⁺, wbeО1^–, wbf О139^–, что подтвердило их принадлежность к НАГ- вибрионам. Обе культуры проявляли чувствительность к левомицетину, цефтриаксону, стрептомицину, гентамицину, налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину, ампициллину, амикацину и промежуточную устойчивость к тетрациклину, доксициклину, фуразолидону и ко-тримоксазолу.

Анализ генов и их продуктов

Результаты кластерного анализа по 3682 SNP (однонуклеотидные полиморфизмы) показали, что оба штамма, 46 и 19, были практически идентичными друг другу, различаясь всего по двум SNP. Это указывает на то, что заболевание было вызвано одним, а не двумя разными клонами.

Особый интерес представляло определение наличия и состояние генетических детерминант факторов патогенности, которые могли быть причастными к возникновению заболевания. С помощью программы BioEdit было подтверждено отсутствие генов холерного токсина ctxAB и всех остальных генов профага CTX, кодирующих дополнительные факторы — адгезин Cep, токсины Ace и Zot, что также указывало и на отсутствие профага preCTX, содержащего те же гены, кроме ctxAB. Остров патогенности VPI, в состав которого входит tcp-кластер, ответственный за продукцию TCP, также полностью отсутствовал. Не было обнаружено генов термостабильного токсина (stn), гемолизинов TDH и TRH, cholix-токсина (chxA), а также островов пандемичности VSP-I и VSP-II. Вместе с тем в WGSs были идентифицированы детерминанты целого ряда факторов патогенности.

В первую очередь это кластер генов контакт-зависимой системы секреции 3 типа (T3SS), способствующей колонизации кишечника, а на моделях лабораторных животных вызывающей тяжелую фатальную диарею [13]. Считается, что T3SS⁺ штаммы более вирулентны, чем T3SS^– [15]. У штамма-возбудителя все гены структурных компонентов, эффекторов и регуляторов T3SS были интактными, хотя многие из них отличались от таковых «референс-штамма» AM-19226. Впрочем, этот штамм, у которого данная система секреции была обнаружена впервые, может считаться типовым лишь условно, поскольку кластер T3SS холерных вибрионов в значительной степени вариабелен по числу и структуре входящих в его состав генов, что можно наблюдать при анализе этого кластера в WGSs штаммов разных серогрупп, представленных в NCBI. Интересно, что сразу после последнего гена T3SS-кластера vopZ находились 2 неизвестные открытые рамки считывания (orf) длиной 1191 и 819 п.н., а за ними следовала группа из 11 генов, представляющая собой область nan-nag острова патогенности VPI-2, тогда как проксимальная и дистальная части этого острова полностью отсутствовали. Область nan-nag ответственна за утилизацию сиаловых кислот как источника углерода и обеспечение таким образом конкурентных преимуществ не только во внешней среде, но и в кишечнике [9]. Ранее аналогичная структура была выявлена Chen и соавт. [10] у штамма О31 серогруппы NRT36S. На рис. 1 показана схема фрагмента генома исследуемого штамма, включающая кластер T3SS (консервативный центральный коровый участок и 2 вариабельных, фланкирующих его с обеих сторон), и область nan-nag. Находящиеся между этими участками два гена не были найдены в имевшихся в нашем распоряжении WGSs T3SS-негативных штаммов НАГ-вибрионов, как и V. cholerae О1. Программа BLASTP идентифицировала их продукты как белки, содержащие Ig-подобный домен (Ig-like domain-containing protein), но этот и другие потенциальные домены находились в большем белке, а в меньшем отсутствовали. Как оказалось, у других T3SS⁺ штаммов О1 и неО1/неО139 серогрупп в этом месте находится один ген с такими же доменами, имеющий высокую степень гомологии с двумя описанными, но у исследуемого штамма в результате вставки Т-815 и сдвига рамки образовался преждевременный стоп-кодон, а ниже образовалась вторая, более короткая orf, но все домены остались в первой. Несмотря на присутствие потенциальных доменов, функции этого белка неизвестны, как и «история» попадания его гена в указанную позицию. То же можно сказать и о двух orf, следующих за nanH и не имеющих отношения к продолжению VPI-2 — первая (330 п.н.) кодирует белок с неизвестной функцией, вторая (807 п.н.) — белок, содержащий 2 домена — WYL и YafY, предположительно причастный к регуляции защитных систем микроорганизма и транскрипции.

 

Рисунок 1. Схема участка генома штамма 46, включающего полный кластер T3SS и область nan-nag VPI-2

Figure 1. Scheme of the strain 46 genome fragment including the full T3SS cluster and the nan-nag region of VPI-2

Примечание. Перечислены только гены с известными функциями.

Note. Only genes with known functions are listed.

 

Ген интегразы находился в начале кластера T3SS и отличался как от таковых других T3SS⁺ штаммов (WGSs которых были получены нами ранее либо найдены в NCBI), так и от прототипного гена интегразы VPI-2 (рис. 2), хотя обе эти интегразы имеют одинаковую длину 1236 п.н. и у типовых штаммов идентичны на 98%.

 

Рисунок 2. Дендрограмма, построенная по результатам AlignX-анализа генов интеграз, входящих в состав кластеров T3SS и VPI-2 разных штаммов V. cholerae

Figure 2. Dendrogram constructed based on the AlignX analysis data for integrase genes included in T3SS and VPI-2 clusters of various V. cholerae strains

 

По всей видимости, приведенная на рис. 1 структура могла образоваться в результате обмена проксимального участка VPI-2 на кластер T3SS и утраты дистальной части VPI-2. Как и у других T3SS⁺ холерных вибрионов, кластер интегрирован в хромосому рядом с геном тРНК (еще один критерий мобильного генетического элемента), как и полный VPI-2 T3SS^– штаммов. Более того, перед геном тРНК в обоих случаях находится один и тот же ген транспортного белка семейства AcrB/D/F, что свидетельствует в пользу нашего предположения о генетическом обмене.

Что касается другой контакт-зависимой системы секреции — T6SS, то несмотря на присутствие основного кластера с генами структурных компонентов (vipAB, hsiF, vasABCDEF, clpV, vasHIJKLM) и эффектора vgrG3, продукт которого сохранил пептидогликан-связывающий домен PBD, способность к ее экспрессии исследуемым штаммом-возбудителем сомнительна. Во-первых, находящийся в этом кластере ген vasK усечен, следовательно, его продукт, крайне важный для секреции эффекторов [5], вряд ли является полноценным белком. Во-вторых, в геноме отсутствовали гены и самих эффекторов vgrG1, vasX, tseL, tseH, входящие в состав дополнительных кластеров AUX1, 2, 3 и 4; последние сохранили лишь гены структурных компонентов T6SS hcp и vgrG2.

Мощными факторами патогенности нетоксигенных штаммов принято считать высомолекулярный самопроцессирующийся токсин-актиномодулятор MARTX и порообразующий растворимый гемолизин/цитолозин HlyA [7]. Кластер RTX содержал все необходимые для продукции MARTX гены (rtxACBDE, chp), а продукт трансляции гена собственно токсина rtxA имел такую же длину, что и прототип (4545 аа) и содержал все типичные активные домены (ACD, RID, ab/H, CPD) несмотря на то, что сам ген отличался от прототипа 419 мутациями (заменами от 1 до 4 нуклеотидов), большинство которых, правда, оказались молчащими. Ген гемолизина содержал 39 SNP, ни одна из которых также не привела к появлению преждевременного стоп-кодона. Фенотипически обе культуры были гемолитичными по отношению к бараньим эритроцитам.

Ген цитотонического токсина cef (CHO cell elongating factor) имел ту же длину, что и прототип, но отличался от него множеством SNPs. Тем не менее его продукт сохранил все характерные активные домены — Куница, лейциновую молнию, а/bH и LIP, а также субстрат-связывающий сайт GHSLG.

Гены металлопротеаз — гемагглютинин/протеазы HA/P (hapA), коллагеназы VchC, входящей в состав hly-локуса протеазы PrtV, а также сериновых протеаз VesA VesB, VesC, IvaP, RssP были интактными, хотя содержали большое число молчащих и миссенс-мутаций по сравнению с прототипами. Их продукты обеспечивают конкурентоспособность за белковые источники питания в разных экологических нишах, однако многие из них одновременно могут быть факторами патогенности. В этом плане наиболее хорошо охарактеризовано актиномодулирующее действие HA/P [3] и диареегенное — VesC [12].

Существенные отличия первичной структуры всех вышеперечисленных белков как от прототипа, так и от других штаммов НАГ-вибрионов, вероятно, оказывают влияние на их активность, усиливая ее либо ослабляя. Однако наличие большого числа интактных детерминант позволяет думать, что экспрессии хотя бы некоторых из них может быть достаточно для реализации патогенетического потенциала.

Способность вызвать ОКИ зависит не только от токсических субстанций, но от адгезивных свойств возбудителей, обеспечивающих колонизацию кишечника. Как отмечено выше, детерминанты ключевого фактора адгезии — пилей TCP и дополнительного — пилина Cep — в геноме отсутствовали. Однако в данном случае функцию фактора колонизации могли взять на себя MSHA-подобные пили. У токсигенных штаммов маннозочуствительные пили за счет механизмов регуляции экспрессируются только во внешней среде, играя роль фактора персистенции, но при попадании в организм человека их продукция репрессируется. Однако исследуемые штаммы, как и многие НАГ-вибрионы, содержали с составе msh-кластера измененные гены мажорной и минорной субъединиц этих пилей, ранее обозначенные нами как mshA-like и mshC-like. Нуклеотидные последовательности этих генов и, соответственно, аа-последовательности их продуктов у разных штаммов существенно различаются, консервативность сохраняют лишь проксимальные участки. MshA-like могут иметь разную длину, в нашем случае она составляла 148 аа, MshC-like чаще всего состоят из 170 аа. Такие пили являются «маннозонечувствительными», поэтому их продукция в кишечнике не подвержена репрессии. Как было установлено при изучении других клинических НАГ-вибрионов, обладающие ими штаммы сохраняют адгезивную активность по меньшей мере in vitro [11]. Адгезии также могли способствовать жгутики [14], так как оба ответственных за их образование кластера (flaCA-flgLM и flaEGDB) были на 99% идентичны прототипу.

Генов антибиотикорезистентности практически не обнаружено, что совпадало с чувствительностью к нескольким препаратам по фенотипу. В то же время программой CARD выявлен ген β-лактамазы varG, ответственной за устойчивость к пенициллинам, карбапенемам и цефалоспоринам. Возможно, это отчасти повлияло на замедленную элиминацию возбудителя, поскольку ребенка лечили амоксициллином — полусинтетическим антибиотиком группы пенициллинов, аналогом ампициллина. К ампициллину возбудитель был чувствителен и не содержал генов других β-лактамаз (blaP1/carb2, carb7, carb9, blaVCC), но мы не исключаем небольшой активности VarG по отношению к амоксициллину, хотя это предположение требует экспериментальной проверки. Что касается пониженной чувствительности к тетрациклину, ко-тримоксазолу и фуразолидону, то она могла быть результатом действия эффлюкс-помп, поскольку генов tetA, tetR, dfrA/sul2 в геноме не выявлено, а причастность гена nfsA, гомолог которого (с 21 SNP) присутствовал, к резистентности к фуразолидону для холерных вибрионов не доказана. Штаммы НАГ-вибрионов с нулевой антибиотикорезистентностью выделялись от людей в Ростовской области и раньше, хотя в нынешнем столетии их число уменьшилось, также отмечалось повышение МПК тетрациклина [8]. Во всяком случае, выделенный в 2022 г. возбудитель не мог служить донором генов устойчивости для передачи другим штаммам популяции.

Заключение

Полученные результаты позволяют заключить, что исследуемый штамм НАГ-вибриона содержит достаточный набор детерминант факторов патогенности, экспрессия которых могла внести свой вклад в развитие заболевания. Штаммы с аналогичными наборами встречались и раньше как на территории Ростовской области, так и в других регионах РФ [2]. В то же время все они различались по генотипам, и это касалось не только качественного и количественного состава генов и их кластеров, но и существования множества аллелей одних и тех же генов. Это связано с чрезвычайной пластичностью генома, превосходящей таковую нетоксигенных штаммов О1 серогруппы. В настоящее время, в отличие от прошлого столетия, НАГ-инфекции возникают у людей довольно редко и носят спорадический характер. Чаще они поражают детей, иммунная система которых еще полностью не сформирована, а также взрослых с ослабляющими иммунитет хроническими заболеваниями. НАГ-вибрионы постоянно присутствуют в окружающей среде и, возможно, персистируют в организме бессимптомных носителей. Их популяции в совокупности содержат еще более широкий спектр детерминант, что создает условия для процессов генетического обмена и формирования новых, возможно более вирулентных клонов, поэтому данная группа микроорганизмов заслуживает внимания при мониторинге холерных вибрионов на территории РФ, в том числе в плане дальнейшего изучения на уровне генома.

About the authors

Elena V. Monakhova

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: monakhova_ev@antiplague.ru
ORCID iD: 0000-0002-9216-7777
SPIN-code: 3091-5680
Scopus Author ID: 6603368032

PhD, MD (Biology), Senior Researcher, Head Researcher, Department of Microbiology of Cholera and Other Acute Intestinal Infections

Россия, 344002, Rostov-on-Don, M. Gorkogo str., 117/40

V. D. Kruglikov

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: kruglikov_vd@antiplague.ru

PhD, MD (Medicine), Head of the Department of Microbiology of Cholera and Other Acute Intestinal Infections

Россия, 344002, Rostov-on-Don, M. Gorkogo str., 117/40

A. S. Vodop'yanov

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: vodopyanov_as@antiplague.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biology of Natural Focal and Zoonotic Infections

Россия, 344002, Rostov-on-Don, M. Gorkogo str., 117/40

N. A. Selyanskaya

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: selyanskaya_na@antiplague.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher, Department of Microbiology of Cholera and Other Acute Intestinal Infections

Россия, 344002, Rostov-on-Don, M. Gorkogo str., 117/40

M. I. Ezhova

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: mari-ezho@yandex.ru

Researcher, Department of Microbiology of Cholera and Other Acute Intestinal Infections

Россия, 344002, Rostov-on-Don, M. Gorkogo str., 117/40

A. K. Noskov

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Author for correspondence.
Email: noskov-epid@mail.ru

PhD (Medicine), Director

Россия, 344002, Rostov-on-Don, M. Gorkogo str., 117/40

References

Supplementary files