Maintaining immunological memory to the SARS-CoV-2 virus during a pandemic

  • Authors: Toptygina A.1,2, Afridonova Z.3, Zakirov R.4, Semikina E.4,5
  • Affiliations:
    1. G.N.Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
    2. Chair of Immunology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University
    3. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia.
    4. Federal State Autonomous Institution "National Medical Research Center of Children's Health" of the Ministry of Health of the Russian Federation
    5. I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov Univer-sity), Moscow, Russia
  • Section: ORIGINAL ARTICLES
  • URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/2009
  • DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-MIM-2009

Cite item

Full Text

Abstract

The question of the duration and effectiveness of post-infection immunity to SARS-CoV-2 and its comparison with post-vaccination remains at the center of study by many researchers. The aim of the work was to study the duration of maintaining post-infection and post-vaccination immunity to the SARS-CoV-2 virus, as well as the formation of hybrid (vaccination after infection) and breakthrough (repeated disease or disease after vaccination) immunity in the context of an ongoing pandemic. 107 adults who had mild or moderate COVID-19 3-18 months after the disease and 30 people vaccinated twice with the Sputnik V vaccine were examined 1-6 times. Antibodies to the SARS-CoV-2 virus were determined by ELISA on the “SARS-CoV-2-IgG quantitative-ELISA-BEST” test systems. The avidity of antibodies was determined by additional incubation with and without denaturing solution. Mononuclear cells were isolated from blood by gradient centrifugation, incubated with and without coronavirus S-protein for 20 hours, stained with fluorescently labeled antibodies, and the percentage of CD8highCD107a+ was counted on a FACSCanto II cytometer. It was shown that in the group of reconvalescent and vaccinated, the level of antibodies specific to the virus decreased more pronounced in individuals with an initially high humoral response, but after 9 months the decrease slowed down and reached a plateau. The avidity of antibodies rose to 50% and persisted for 18 months. Cellular immunity in recovered patients did not change for 1.5 years, while in vaccinated patients it gradually decreased after 6 months, but remained at a detectable level. After revaccination of the vaccinated, a significant increase in the level of antibodies, avidity to 67.6% and cellular immunity to the initial level was noted. Hybrid immunity turned out to be significantly higher than post-infection and post-vaccination immunity. The level of antibodies increased to 1218.2 BAU/ml, avidity to 69.85%, and cellular immunity to 9.94%. Breakthrough immunity was significantly higher than after the first disease. The level of antibodies rose to 1601 BAU/ml, avidity - up to 81.6%, cellular immunity - up to 13.71%. Using the example of dynamic observation of four COVID-19 reconvalescents, it has been shown that in the context of the ongoing pandemic and active mutation of the coronavirus, natural boosting occurs both asymptomatically and as a result of a mild re-infection, which prevents the disappearance of humoral and cellular immunity specific to SARS-CoV -2.

Full Text

Поддержание иммунологической памяти на вирус SARS-CoV-2 в условиях пандемии.

Вспышка неизвестного ранее заболевания, вызванная новым коронавирусом, названным SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2), в Ухане в декабре 2019, обернулась пандемией COronaVIrus Disease 2019 (COVID-19). Поскольку это была новая коронавирусная инфекция, в начале пандемии отсутствовали тест-системы как для определения самого вируса, так и антител против него. Экстренная разработка и использование «сырых» тест-систем приводили к парадоксальным заявлениям о том, что IgG-антитела появляются раньше, чем IgM, или что антитела исчезают спустя 1-2 месяца после начала заболевания. По мере повышения качества тест-систем эти «открытия» потеряли актуальность, однако возник вопрос о сопоставлении результатов многих десятков, если не сотен тест систем, выраженных в разных единицах [2, 18]. Эта проблема была решена с введением единиц измерения антител на основе единого стандарта: BAU/мл (Biding Antibody Units; First WHO International Standard for anti-SARS-CoV immunoglobulin (human), NIBSC code: 20/136). Однако даже хорошо налаженная система тестирования не позволяет ответить на вопрос, сколько человек перенесло COVID-19. По данным ВОЗ эта цифра составляет более 550 млн. человек. Тем не менее, независимые исследования приводят к выводу, что уже в начале 2022 г около половины населения Земли перенесла это заболевание [21]. Вопрос о продолжительности и эффективности натурального иммунитета (полученного в результате инфекции) остается в центре изучения многими исследователями [19, 27, 33]. Первоначально сообщалось о поддержании иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 в течение 6-и мес. [37], 9-и  и более месяцев [6, 15, 25]. Появление в 2021 г сразу нескольких вакцин против вируса SARS-CoV-2 вызвало всплеск исследований поствакцинального иммунитета [3, 4, 17, 21]. Появившиеся сообщения о быстром истощении поствакцинального иммунитета в считанные месяцы потребовало введения бустерных доз вакцины [14, 20, 31]. При этом сам вирус SARS-CoV-2 постоянно мутировал, вызывая резкие подъемы заболеваемости в мире за счет α-,β-,γ-,δ- и ο-вариантов. Было показано, что омикрон способен прорывать имевшийся иммунитет к коронавирусу [10].

В связи с вышеизложенным, целью работы было исследование продолжительности поддержания постинфекционного и поствакцинального иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, а также формирование гибридного (вакцинация после перенесенного заболевания) и прорывного (повторное заболевание или заболевание после вакцинации) иммунитета в условиях продолжающейся пандемии.

Материалы и методы

В исследование были включены 107 взрослых (возраст 18-73 года), перенесших COVID-19 в легкой или среднетяжелой форме спустя 3-18 месяцев после заболевания и 30 человек, привитых двукратно вакциной «Спутник V». Эти люди были обследованы от 1 до 6 раз на наличие антител к вирусу SARS-CoV-2 и клеточный иммунитет к нему. Исследования проводили с декабря 2020г по апрель 2022г. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФБУН МНИИЭМ им Г.Н.Габричевского (протокол № 58), обследованные подписывали информированное согласие. Биологический материал получали из локтевой вены в две вакуумные пробирки в объеме 4 мл каждая: с гепарином – для исследования клеточного иммунитета и с активатором свертывания и гелем для выделения сыворотки крови для оценки гуморального иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2.

Сыворотку крови, полученную центрифугированием разливали в пробирки Эппендорф и хранили при -70ºС до исследования. Антитела, специфичные к вирусу SARS-CoV-2 определяли иммуноферментным методом на тест-системах «SARS-CoV-2-IgG количественный-ИФА-БЕСТ» (АО Вектор-Бест, Новосибирск РФ). Авидность антител определяли в этом же наборе в модификации. Каждую исследуемую сыворотку вносили в лунки 2-х соседних стрипов. После инкубации и отмывки лунок, согласно протоколу производителя, в лунки первого стрипа добавляли 200 мкл физиологического раствора, в лунки второго стрипа добавляли 200 мкл денатурирующего раствора мочевины и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, затем отмывали 3-х кратно. Растворы и время инкубации были взяты из набора для определения авидности антител к кори «Avidity:Anti-Measles Viruses ELISA/IgG» (Euroimmun, Германия). Затем выполняли все процедуры, согласно протоколу к набору «SARS-CoV-2-IgG количественный-ИФА-БЕСТ».

Выделение мононуклеаров периферической крови проводили в стерильных условиях на градиенте плотности (ρ = 1,077; ООО «ПанЭко», РФ) и отмывали от тромбоцитов. Суспензию клеток в среде RPMI-1640 с добавлением 2мМ L-глютамина, гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «ПанЭко», РФ) вносили в количестве 3х105 в лунки 96-луночной стерильной панели, добавляли раствор моненсина в конечной концентрации 10 мкМ и моноклональные антитела к антигену CD107a-PE-Cy5 в конечном разведении 1:100 (контрольная проба), конечный объем в лунке составил 200 мкл. В опытной пробе делали все то же самое, но использовали лунки 96-луночной панели от набора для определения антител к S-белку вируса методом ИФА «SARS-CoV-2-IgG количественный-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Новосибирск РФ), где на дно лунок сорбирован тример S-белка коронавируса, согласно инструкции производителя. Перед началом эксперимента лунки от ИФА-набора были простирилизованы с помощью ультрафиолетового облучения 30 минут. Подготовленные пробы инкубировали 20 часов при 37°C во влажной атмосфере и 5% CO2, затем переносили в пробирки для цитофлуорометрии, отмывали раствором CellWash (300g 5 мин) и окрашивали антителами к антигену CD8-FITC 20 минут в темноте при 4°C. После повторной отмывки в тех же условиях, проводили иммунофенотипирование с помощью проточного цитометра BD FACS Canto II (технологии и программное обеспечение Becton Dickinson, США). Выделяли гейт лимфоцитов высоко экспрессирующих антиген CD8 (CD8high), а в нем определяли процент клеток CD8highCD107a+, представляющих собой цитотоксические Т-лимфоциты, распознавшие S-белок коронавируса и ответившие на такое распознавание атакой с помощью цитотоксических гранул. Границей между отсутствием и наличием специфического клеточного иммунитета считали уровень 1%.

Результаты исследования были подвергнуты статистической обработке. Было проведено исследование на нормальность распределения методом Колмагорова-Смирнова. Количество антител выражали в BAU/мл. Уровень антител представлен в виде медианы (1 - 3 квартиль). Для вычисления авидности антител значение в первой лунке (инкубация с физиологическим раствором) принимали за 100%, и вычисляли процент для значения во второй лунке (инкубация с денатурирующим раствором). Результаты расчета авидности и оценки клеточного иммунитета представлены в виде средней арифметической и ее ошибки (M±SE).  Корреляции оценивали методом Пирсона. Различия при p < 0,05 считали значимыми.

Результаты

При поперечном исследовании когорты переболевших COVID-19 были получены следующие результаты: через 3 мес. от начала заболевания медиана уровня антител в сыворотке крови была 978 (336-1592) BAU/мл, через 6 мес. – 883 (335-1323) BAU/мл, через 9 мес. – 672 (276-1009) BAU/мл и через 12 мес. – 560 (189-867) BAU/мл. Из приведенных результатов видно, что уровень антител со временем постепенно снижался, но даже через год оставался достаточно высоким. Следует отметить, что на момент исследования защитным уровнем считали 150 BAU/мл, а потом 300 BAU/мл, т.е. средний уровень антител можно было расценить как защитный даже через год после заболевания.

В продольное исследование когорты переболевших COVID-19 были включены 38 человек, которые были обследованы 3-6 раз через 3-18 мес. от начала заболевания. По уровню антител в сыворотке крови удалось выделить группу с высоким уровнем антител к вирусу SARS-CoV-2 (23 человека-60,5%) и низким уровнем таких антител (15 человек-39,5%). Полученные результаты представлены на рисунке 1А. Из рисунка видно, что в группе с высоким уровнем IgG-антител к вирусу SARS-CoV-2 средний уровень составил 1586 (1154-1896) BAU/мл. В сроке от 3-х до 9-и месяцев после начала заболевания снижение антител было более выражено, а затем этот процесс замедлился. В группе с низким уровнем антител (390 (269-434) BAU/мл) наблюдалась аналогичная тенденция, а на сроке 1 год от заболевания уровень антител вышел на плато. Различия между группами были значимыми (p < 0,05). На рисунке 1Б представлена авидность антител к вирусу SARS-CoV-2 на тех же сроках исследования. Из рисунка видно, что авидность нарастала с течением времени с 29,7% в 3 мес. до 50% в 12 мес. и оставалась на этом уровне в следующие полгода. Авидность антител не коррелировала с уровнем антител против вируса SARS-CoV-2.

Оценка клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 (таблица 1) позволила также выделить группу с высоким уровнем 10,19±0,93% (20 человек-52,6%) и низким уровнем 3,9±0,37% (18 человек – 47,4%) ответа. Разделение на группы провели на уровне 6%, различия между группами были статистически значимыми (p < 0,05). Интересно, что на протяжении 1,5 лет наблюдения уровни клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 не менялись, тогда как уровни антител у тех же людей за это время значимо снизились.

При обследовании 30 человек, не болевших прежде COVID-19  дважды привитых вакциной «Спутник V», также удалось выделить группу с высоким (1563 (840-1825)) BAU/мл – 16 человек (53,3%) и низким (432 (293-456)) BAU/мл уровнем антител к вирусу SARS-CoV-2 – 14 человек (46,7%), различия по уровню антител были статистически значимыми (p < 0,05). У привитых наблюдалась тенденция, аналогичная переболевшим COVID-19. В группе с высоким уровнем антител снижение этого уровня происходило более выражено, чем в группе с исходно низким уровнем антител, а после 9 месяцев в обеих группах уровень антител выходил на плато (рисунок 2А). На рисунке 2Б представлена авидность антител у привитых. Из рисунка видно, что авидность антител нарастала с 32,5% через 3 мес. после прививки до 47,3% через 1 год после прививки. В группе привитых авидность также не коррелировала с уровнем антител к вирусу SARS-CoV-2.

Через 12 мес. после первичной вакцинации 23 человека из этой группы были ревакцинированы «Спутник Лайт». Через 3 мес. после этого уровень антител в группе с исходно высоким уровнем возрос с 771 BAU/мл до 1368 BAU/мл, а в группе с исходно низким уровнем – с 156 BAU/мл до 476 BAU/мл. При этом авидность, независимо от уровня антител, повысилась с 47,3%  до 67,6% (см. рисунок 2). Различия, как по уровням антител, так и по авидности до и после ревакцинации, оказались значимыми (p < 0,05).

Анализируя клеточный иммунитет к S-белку вируса SARS-CoV-2 у привитых вакциной «Спутник V» (таблица 2), выделили группу с высоким уровнем 11,19±1,03% – 17 человек (56,7%) и низким уровнем 4,41±0,42% ответа на S-белок вируса SARS-CoV-2 – 13 человек (43,3%), различия между группами были значимыми (p < 0,05). Уровень клеточного иммунитета в группе привитых постепенно снижался в течение года после вакцинации и на сроках в 9 и 12 мес. значимо отличался от исходного уровня (p < 0,05), однако держался на детектируемом уровне и не исчезал даже в группе с исходно низким уровнем ответа. Через 3 мес. после ревакцинации «Спутник Лайт» уровень клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 значимо возрос в обеих группах (p < 0,05), по сравнению с уровнем до ревакцинации, в группе с высоким уровнем с 7,67±0,80% до 10,98±0,97%, а с низким уровнем с 3,24±0,33% до 5,19±0,41%, и значимо не отличался от  уровня через 3 мес. после первой вакцинации.

Из группы переболевших COVID-19, находившихся под наблюдением, 27 человек были дважды привиты вакциной «Спутник V» через 6-12 мес. после заболевания. Формирующийся в таких случаях иммунитет принято называть гибридным, поскольку первичный иммунный ответ формировался на дикий штамм вируса, а вторичный ответ – на вакцинный штамм. На рисунке 3А сопоставлены уровни антител в группе 30-и привитых (707,7 BAU/мл), и 27-и переболевших COVID-19 (972,6 BAU/мл), а также у этих же 27-и человек через 3 мес. после вакцинации «Спутник V» (1218,2 BAU/мл). Также показано изменение уровня авидности. У привитых и переболевших эти уровни не превышали 50%, тогда как в группе с гибридным иммунитетом авидность возросла до 69,85%. Различия в уровне антител и авидности до и после вакцинации оказались значимыми (p < 0,05).

На рисунке 3Б представлены соответствующие результаты по оценке клеточного иммунитета. Из рисунка видно, что поствакцинальный и постинфекционный клеточный иммунитет в этих группах практически не различались (7,77±0,68% и 8,20±0,73%), тогда как гибридный иммунитет оказался значимо выше – 9,94±0,75% (p < 0,05).

Из группы переболевших COVID-19 в 2020-2021 гг 32 человека повторно переболели COVID-19 (штамм омикрон) в январе – феврале 2022 г. У них также был исследован гуморальный иммунитет к вирусу SARS-CoV-2 (рисунок 4А). Такой вид иммунитета принято называть прорывным, поскольку новый штамм вируса прорвал иммунную защиту, сформированную после первого заболевания.  Из рисунка видно, что в этой группе переболевших сохранялся достаточно высокий уровень антител к вирусу SARS-CoV-2 (719 BAU/мл). Однако штамм омикрон сильно отличается от предыдущих штаммов, поэтому способен преодолеть иммунную защиту. После повторного заболевания COVID-19, которое протекало в легкой форме, уровень антител значимо возрос до 1601 BAU/мл (p < 0,05). Авидность антител также значимо возросла с 50% до 81,6% (p < 0,05).

При сопоставлении постинфекционного и прорывного клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 (рисунок 4Б) видно, что прорывной клеточный иммунитет (13,71±1,07%) в той же группе обследованных значимо превышает (p < 0,05) клеточный иммунитет, возникший после первого заболевания (8,38±0,83%).

Следует отметить, что все описанные в данной статье исследования гуморального и клеточного иммунитета к новому коронавирусу проводили на фоне продолжавшейся пандемии COVID-19. Вирус SARS-CoV-2 не только свободно циркулировал в популяции, но и активно мутировал, что приводило к естественному бустированию и повторным заболеваниям, поэтому нельзя с точностью сказать, как долго поддерживался бы иммунитет к вирусу SARS-CoV-2 при отсутствии циркуляции возбудителя. В качестве примера, подтверждающего эту мысль, приведем результаты динамического наблюдения за четырьмя  переболевшими COVID-19 в сентябре 2020 г. Пациенты 1 и 2 перенесли инфекцию средней тяжести, а пациенты 3 и 4 – в легкой форме. Через 3 мес. после начала заболевания (декабрь 2020 г.), пациенты 1, 2 и 3 сформировали IgG-антитела к S-белку вируса SARS-CoV-2 высокого уровня, а пациент 4 – низкого (214 BAU/мл), но защитного уровня, поскольку на тот момент защитным уровнем считали 150 BAU/мл (рисунок 5А). Еще через 3 мес., в марте 2021 г., у всех наблюдаемых лиц видно снижение уровня антител разной степени выраженности. В мае 2021 человек №1 имел контакт с заболевшим без каких-либо клинических проявлений и в июне 2021 г. мы видим на графике повышение уровня антител – бессимптомное бустирование. Человек №3 также в мае совместно проживал и ухаживал за заболевшим COVID-19 родственником и в июньском тесте видно резко выраженное бустирование, также протекавшее бессимптомно. Пациент № 2 контактов не имел, и уровень его антител продолжал снижаться, а пациент №4 имел контакт с инфицированными и у него тоже выявлен подъем антител со 120 до 164 BAU/мл. Далее у всех четырех человек в отсутствии контактов с вирусом опять наблюдалось снижение уровня антител. У человека №3 с декабря 2021 г уровень антител вышел на плато, пациент № 4 в ноябре 2021 г. перенес повторное заболевание в легкой форме, вызванное δ-штаммом коронавируса и ответил резким подъемом антител до 668 BAU/мл. У контактировавших с ним №1 отмечено бессимптомное бустирование, а у №2 уровень антител практически не изменился. В начале февраля 2022 г. пациент №1 перенес в легкой форме повторное заболевание, вызванное штаммом омикрон, и ответил подъемом уровня антител до 2826 BAU/мл. Контактировавший с ним №2 также переболел в легкой форме, уровень его антител возрос с 555 до 668 BAU/мл. Пациент №4 также контактировал с заболевшими и продемонстрировал бессимптомный бустер-эффект до 720 BAU/мл. Клеточный иммунитет этих четырех человек вел себя несколько иначе (рисунок 5Б). Прежде всего, обращает на себя внимание, что у пациента №3 клеточный иммунитет к S-белку вируса SARS-CoV-2 вообще не сформировался. У пациента №1 уровень клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 прогрессивно нарастал с 10,05% в декабре 2020 г. До 18,26% в декабре 2021 г., по видимому из-за повторных встреч с вирусом и снизился до 9,19% после заболевания, вызванного штаммом омикрон. У пациентов №2 и 4 отмечен резкий подъем уровня клеточного иммунитета после контакта с δ-штаммом коронавируса. Интересно, что у №2 уровень клеточного иммунитета продолжил подниматься и после перенесенного заболевания, вызванного штаммом омикрон достиг уровня 28,54%, а у №4, наоборот, после контакта с этим штаммом клеточный иммунитет снизился с 26,29% до 12,86%.

Обсуждение

В нашем исследовании было показано, что у переболевших COVID-19 уровень IgG-антител к S-белку вируса SARS-CoV-2 постепенно снижается, при этом у тех, кто сформировал высокий уровень антител такое снижение идет интенсивнее, чем в группе с низким уровнем гуморального ответа. Тем не менее, на сроке после 9 мес. от перенесенного заболевания такое снижение замедляется и уровень антител выходит на плато, а не исчезает совсем, как думали ранее. Аналогичные результаты были получены и другими группами исследователей [1, 25, 35], что подтверждает не случайность такого хода событий. Интересно, что авидность антител возрастала до 50% и оставалась на этом уровне без дополнительной антигенной стимуляции. Важно, что уровень клеточного иммунитета у переболевших COVID-19 практически не менялся в течение 1,5 лет после перенесенного заболевания. Это свидетельствует о том, что поддержание гуморального и клеточного звена иммунологической памяти происходит независимо друг от друга.

В группе вакцинированных «Спутник V» динамика гуморального иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 была сопоставима с таковой у переболевших, а клеточный ответ значимо снижался на сроках более 6 мес. от вакцинации, хотя и не исчезал совсем. В западной литературе на примере вакцин, произведенных фирмами «Pfizer» и «Moderna» показано, что после вакцинации формируются только короткоживущие плазмоциты, поэтому после высокого подъема уровня антител после прививки этими вакцинами, возникает достаточно быстрый спад уровня антител [28, 36]. Однако эти вакцины основаны на мРНК-технологии, тогда как «Спутник V» - это векторная вакцина, она в большей степени имитирует вирусную атаку. Исследования, посвященные продолжительности поствакцинального иммунитета у привитых «Спутник V» выявляли высокий уровень IgG-антител  к S-белку вируса SARS-CoV-2 спустя 6 и более месяцев после прививки [1, 4]. Ревакцинация через 12 мес. после первичной вакцинации индуцировала значимый подъем уровня антител и их авидности до 67,6%, что отмечали и другие исследователи [1]. Уровень клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 значимо возрос после ревакцинации и вернулся к изначальному уровню.

При изучении формирования гибридного иммунитета (вакцинация ранее переболевших людей) выявлен значимый подъем уровня антител, их авидности и клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2. Аналогичные результаты были получены и другими авторами [1, 9, 15]. Более того, на примере вакцин на основе мРНК было показано, что снижение уровня антител при гибридном иммунитете идет существенно медленнее, чем у привитых, что обусловлено, по-видимому, наличием также и долгоживущих плазмоцитов после перенесенного заболевания [15, 26]. Уровень клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 при гибридном иммунитете также оказался значимо выше, чем при поствакцинальном и постинфекционном. Похожие результаты были показаны при оценке гибридного иммунитета на основе мРНК-вакцин [29, 30], хотя способ оценки клеточного иммунитета был несколько иной.

Формирование прорывного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 связано с активными мутациями коронавируса от Уханьского штамма, с которого все началось, через B.1.1.7 (альфа), B.1.351 (бета), P.1 (гамма), B.1.617.2 (дельта) вплоть до омикрона B.1.1.529, и далее, поскольку у омикрона уже насчитывается 5 вариантов (ВА.1, ВА.2, ВА.3, ВА.4 и ВА.5), а также появился ВА.2,75, несущий мутации штаммов омикрона и дельты. Изменение структуры S-белка вируса SARS-CoV-2 в результате этих мутаций привело к прорыву сформированного иммунитета у переболевших или вакцинированных и повторным заболеваниям COVID-19 [13]. Несмотря на то, что предшествующие вакцинация или инфекция формирует высокий уровень антител к S-белку вируса SARS-CoV-2, штамму омикрон удается избегать их нейтрализующего действия [7, 8, 12, 32]. Выявленное нами резкое повышение уровня антител к S-белку вируса SARS-CoV-2 при прорывном иммунитете хорошо корреспондирует с этими работами. Повышение авидности антител свидетельствует о дополнительных перестройках в антигенраспознающих участках антител, что говорит о формировании дополнительных плазмоцитов в зародышевых центрах при прорывном иммунитете, помимо тех, которые сформировались при первом заболевании.

Уровень клеточного иммунитета к коронавирусу определяет тяжесть заболевания [22]. Т-клетки распознают короткие антигенные пептиды, поэтому клеточный иммунитет в меньшей степени ограничен мутациями вируса, чем гуморальный. CD4+ и CD8+ лимфоциты привитых и ранее переболевших перекрестно распознают S-белок штамма омикрон в 70-90% случаев [11, 16], однако далеко не у всех пациентов [23]. Наши результаты, выявившие резкий подъем уровня клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 при прорывном иммунитете подтверждают эти наблюдения. Такой подъем происходит, по-видимому, за счет перехода субдоминантных и даже минорных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов, сформировавшихся на первое инфицирование в разряд доминантных при повторной инфекции [5].

Приведенные результаты динамического наблюдения в течение 1,5 лет за четырьмя пациентами, перенесшими COVID-19 в сентябре 2020 г. свидетельствуют, что как гуморальный, так и клеточный иммунитет к S-белку вируса SARS-CoV-2 формируется на индивидуальном уровне, от полного отсутствия до очень высокого, и независимо друг от друга, что связано, по-видимому, с индивидуальными особенностями формирования иммунитета. Этот уровень на фоне продолжающейся пандемии может снижаться или повышаться, за счет бессимптомного бустирования или повторного заболевания, но продолжающаяся циркуляция дикого вируса и его различных штаммов не позволяет иммунитету к коронавирусу снизиться до нуля. Поэтому точные данные о продолжительности поддержания гуморального и клеточного иммунитета к S-белку вируса SARS-CoV-2 можно будет получить только в результате длительного наблюдения после завершения пандемии. Так в литературе есть данные, что антитела и клеточный иммунитет к вирусу SARS-CoV-1 определялись в крови переболевших более 6 лет в условиях отсутствия циркуляции вируса [24,   34].

Таким образом, проведенные исследования показали, что как гуморальный, так и клеточный иммунитет к S-белку вируса SARS-CoV-2 сохраняется у переболевших и привитых более года. Уровень иммунитета может снижаться в первые полгода, однако затем выходит на плато и сохраняется, по крайней мере, 1,5 года у переболевших и 1 год у привитых. Уровень гуморального и клеточного иммунитета различается у разных людей, независимо от того, были ли они привиты или переболели. В условиях продолжающейся пандемии и активной циркуляции дикого вируса происходит естественное бустирование, что препятствует снижению как гуморального, так и клеточного иммунитета. Дополнительную стимуляцию оказывает процесс активных мутаций вируса и смены штаммов, что приводит к повторному инфицированию, протекающему в легкой или бессимптомной форме, но также приводящему к бустированию. Уровень гибридного и особенно прорывного иммунитета, как гуморального, так и клеточного звена, оказался достоверно выше, чем уровень поствакцинального или постинфекционного (на первичную инфекцию) иммунитета, что дает основание надеяться, что если не возникнет какого-то уж очень отличного от других штамма коронавируса, пандемия будет завершена и коронавирусная инфекция сойдет на уровень сезонных простуд.

 

×

About the authors

A. Toptygina

G.N.Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia;
Chair of Immunology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University

Email: toptyginaanna@rambler.ru

PhD, MD (Medicine), Chief Research Associate, Head of Laboratory of Cytokines;

Professor Chair of Immunology

Russian Federation, 10 Admiral Makarov Street, Moscow, 125212, Russia

Z. Afridonova

G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia.

Email: zuafrid@gmail.com

PhD Student, Laboratory of Cytokines

Russian Federation, 10 Admiral Makarov Street, Moscow, 125212, Russia

R. Zakirov

Federal State Autonomous Institution "National Medical Research Center of Children's Health" of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: biochemik@bk.ru

Clinical Laboratory Specialist,   Centralized Diagnostic Laboratory

Russian Federation, Lomonosovsky prospect 2, bld. 1, 119991, Moscow, Russia

E. Semikina

Federal State Autonomous Institution "National Medical Research Center of Children's Health" of the Ministry of Health of the Russian Federation;

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov Univer-sity), Moscow, Russia

Author for correspondence.
Email: semikinaelena@yandex.ru

PhD, MD (Medicine), Chief Research Associate, Head of Laboratory Department;

professor of the Department of Pediatrics and Pediatric Rheumatology Pediatric faculty

Russian Federation, Lomonosovsky prospect, 2, bld.1, 119991, Moscow, Russia

References

  1. № ссылки Авторы, название публикации и источника, где она опубликована, выходные данные ФИО, название публикации и источника на английском языке Интернет-адрес цитируемой статьи
  2. Андреев И.В., Нечай К.О., Андреев А.И., Зубарёва А.П., Есаулова Д.Р., Аленова А.М., Николаева И.А., Чернявская О.П., Ломоносов К.С., Шульженко А.Е., Курбачева О.М., Латышева Е.А., Шартанова Е.В., Назарова Е.В., Романова Л.В., Черченко Н.Г., Смирнов В.В., Аверков О.В., Мартынов А.И., Вечорко В.И., Гудима Г.О., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р., Хаитов Р.М.. Поствакцинальный и постинфекционный гуморальный иммунный ответ на инфекцию SARS-CoV-2. // Иммунология. – 2022. – Т.43, №3. – С. 18-32 Andreev I.V., Nechay K.O., Andreev A.I., Zubareva A.P., Esaulova D.R., Alenova A.M., Nikolaeva I.A., Chernyavskaya O.P., Lomonosov K .S., Shulzhenko A.E., Kurbacheva O.M., Latysheva E.A., Shartanova E.V., Nazarova E.V., Romanova L.V., Cherchenko N.G., Smirnov V.V. ., Averkov O.V., Martynov A.I., Vechorko V.I., Gudima G.O., Kudlay D.A., Khaitov M.R., Khaitov R.M. Post-vaccination and post-infection humoral immune response to the SARS-CoV-2 infection.// Immunology=Immunologiya, 2022, vol.43, no. 3, pp.18-32 (In Russ.). doi: 10.33029/0206-4952-2022-43-1-18-32
  3. Белякова В.В., Майорова О.А., Иванова Н.В., Степанова И.Е., Смердова М.А., Обрядина А.П., Топтыгина А.П. Оценка серологических тестов на антитела к различным антигенам вируса SARS-CoV-2. Сопоставление шести тест-систем. // Медицинская иммунология. – 2021. - Т. 23, №6. – С. 1395-1404 V.V. Belyakova, O.A. Maiorova, N.V. Ivanova, I.E. Stepanova, M.A. Smerdova, A.P. Obryadina, A.P. Toptygina Assessment of serological tests for antibodies to different antigens of the SARS-CoV-2 virus: comparison of six immunoassays // Medical Immunology (Russia)=Meditsinskaya Immunologiya, 2021, vol. 23, no. 6, pp. 1395-1404(In Russ.). doi: 10.15789/1563-0625-AOS-2228
  4. Драпкина О.М., Бернс С.А., Горшков А.Ю., Шишкова В.Н., Рыжакова Л.Н., Литинская О.А., Иванова А.А., Веретенникова А.В., Башняк В.С., Татаревич Е.Ю. Отдаленная динамика уровня специфических IgG-антител к S-белку коронавируса SARS-CoV-2 у вакцинированных лиц.
  5. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2021. – Т. 20, № 8. – С. 23-28 Drapkina O.M., Berns S.A., Gorshkov A.Yu., Shishkova V.N., Ryzhakova L.N., Litinskaya O.A., Ivanova A.A., Veretennikova A.V., Bashnyak V. .S., Tatarevich E.Yu. Long-term dynamics of the levels of anti-SARS-CoV-2 S-protein IgG antibodies in vaccinated individuals. // Cardiovascular therapy and prevention = Kardiovaskulyarnaya terapiya i profilaktika, 2021, vol. 20, no. 8, pp. 23-28 (In Russ.). doi: 10.15829/1728-8800-2021-3124
  6. Петрова О.В., Твердохлебова Д.К. Наличие и количество антител после вакцинации «Гам-ковид-вак». // Клиническая лабораторная диагностика. – 2022. – Т.67, №3. – С.147-150 Petrova O.V., Tverdokhlebova D.K. Presence and quantity of antibodies after vaccination “Gam-COVID-Vac”. Clinical laboratory diagnostics=Klinicheskaya laboratornaya diagnostika, 2022, vol. 67, no. 3, pp. 147-50
  7. (In Russ.) doi: 10.51620/0869-2084-2022-67-3-147-150
  8. Топтыгина А.П. Гетерологичные иммунные ответы в норме и при патологии. // Инфекция и иммунитет. – 2020. – Т. 10. - №2. – С.269-276 Toptygina A.P. Heterologous immune responses in health and disease. Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2020, vol. 10, no. 2, pp. 269–276 (In Russ.). doi: 10.15789/2220-7619-HIR-1292
  9. Топтыгина А.П., Семикина Е.Л., Закиров Р.Ш., Афридонова З.Э. Сопоставление гуморального и клеточного иммунитета у переболевших COVID-19. // Инфекция и иммунитет. – 2022. – Т.12, №. 3– С.495-504 Toptygina A.P., Semikina E.L., Zakirov R.Sh., Afridonova Z.E. Comparison of the humoral and cellular immunity in COVID-19 convalescents // Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet, 2022, vol. 12, no. 3, pp. 495–504(In Russ.). https://doi.org/10.15789/2220-7619-COT-1809
  11. Altarawneh H.N., Chemaitelly H., Hasan M.R., Ayoub H.H., Qassim S., AlMukdad S., Coyle P, Yassine HM, Al-Khatib HA, Benslimane FM, Al-Kanaani Z, Al-Kuwari E, Jeremijenko A, Kaleeckal AH, Latif AN, Shaik RM, Abdul-Rahim HF, Nasrallah GK, Al-Kuwari MG, Butt AA, Al-Romaihi HE, Al-Thani MH, Al-Khal A, Bertollini R, Tang P, Abu-Raddad LJ. Protection against the Omicron Variant from Previous SARS-CoV-2 Infection. N Engl J Med, 2022, vol.386 (13), pp.1288-1290. https://doi.org/10.1056/NEJMc2200133
  12. Cameroni, E. Bowen JE, Rosen LE, Saliba C, Zepeda SK, Culap K, Pinto D, VanBlargan LA, De Marco A, di Iulio J, Zatta F, Kaiser H, Noack J, Farhat N, Czudnochowski N, Havenar-Daughton C, Sprouse KR, Dillen JR, Powell AE, Chen A, Maher C, Yin L, Sun D, Soriaga L, Bassi J, Silacci-Fregni C, Gustafsson C, Franko NM, Logue J, Iqbal NT, Mazzitelli I, Geffner J, Grifantini R, Chu H, Gori A, Riva A, Giannini O, Ceschi A, Ferrari P, Cippà PE, Franzetti-Pellanda A, Garzoni C, Halfmann PJ, Kawaoka Y, Hebner C, Purcell LA, Piccoli L, Pizzuto MS, Walls AC, Diamond MS, Telenti A, Virgin HW, Lanzavecchia A, Snell G, Veesler D, Corti D. Broadly neutralizing antibodies overcome SARS-CoV-2 Omicron antigenic shift. Nature, 2022, vol.602, pp.664–670. doi: 10.1038/s41586-021-04386-2
  13. Crotty, S. Hybrid immunity. Science, 2021, vol.372, pp. 1392–1393. doi: 10.1126/science.abj2258
  14. Danza, P., Koo, T.H., Haddix, M., Fisher R, Traub E, OYong K, Balter S., 2022. SARS-CoV-2 infection and hospitalization among adults aged ≥18 Years, by vaccination status, before and during SARS-CoV-2 B.1.1.529 (omicron) variant predominance — los angeles county, California, november 7, 2021–january 8, 2022. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep.2022, vol. 71, pp.177–181. doi: 10.15585/mmwr.mm7105e1.
  15. Gao, Y., Cai C, Grifoni A, Müller TR, Niessl J, Olofsson A, Humbert M, Hansson L, Österborg A, Bergman P, Chen P, Olsson A, Sandberg JK, Weiskopf D, Price DA, Ljunggren HG, Karlsson AC, Sette A, Aleman S, Buggert M. Ancestral SARS-CoV-2-specific T cells cross-recognize the Omicron variant. Nat. Med., 2022, vol.28, pp. 472–476. doi: 10.1038/s41591-022-01700-x.
  16. Garcia-Beltran, W. F., St Denis KJ, Hoelzemer A, Lam EC, Nitido AD, Sheehan ML, Berrios C, Ofoman O, Chang CC, Hauser BM, Feldman J, Roederer AL, Gregory DJ, Poznansky MC, Schmidt AG, Iafrate AJ, Naranbhai V, Balazs AB. mRNA-based COVID-19 vaccine boosters induce
  17. neutralizing immunity against SARS-CoV-2 Omicron variant. Cell, 2022, vol.185, pp. 457–466. doi: 10.1016/j.cell.2021.12.033.
  18. Gazit, S., Shlezinger, R., Perez, G., Lotan, R., Peretz, A., Ben-Tov, A., Herzel E., Alapi H., Cohen, D., Muhsen, K., Chodick, G. Patalon, T. SARS-CoV-2 natural acquired immunity vs. vaccine-induced immunity, reinfections versus breakthrough infections: a retrospective cohort study. Clin. Infect. Dis., 2022, Apr 5;ciac262. doi: 10.1093/cid/ciac262.
  19. Goldberg, Y., Mandel, M., Bar-On, Y.M., Bodenheimer, O., Freedman, L., Haas, E.J., Milo, R., Alroy-Preis, S., Ash, N., Huppert, A.. Waning immunity after the BNT162b2 vaccine in Israel. N. Engl. J. Med., 2021, vol.385 (24), e85. doi: 10.1056/NEJMoa2114228.
  20. Goldberg, Y., Mandel, M., Bar-On, Y.M., Bodenheimer, O., Freedman, L., Ash, N., Alroy-Preis, S., Huppert, A., Milo, R. Protection and waning of natural and hybrid immunity to SARS-CoV-2. N Engl J Med., 2022, vol. 386(23), pp. 2201-2212 doi: 10.1056/NEJMoa2118946.
  21. Keeton, R., Tincho MB, Ngomti A, Baguma R, Benede N, Suzuki A, Khan K, Cele S, Bernstein M, Karim F, Madzorera SV, Moyo-Gwete T, Mennen M, Skelem S, Adriaanse M, Mutithu D, Aremu O, Stek C, du Bruyn E, Van Der Mescht MA, de Beer Z, de Villiers TR, Bodenstein A, van den Berg G, Mendes A, Strydom A, Venter M, Giandhari J, Naidoo Y, Pillay S, Tegally H, Grifoni A, Weiskopf D, Sette A, Wilkinson RJ, de Oliveira T, Bekker LG, Gray G, Ueckermann V, Rossouw T, Boswell MT, Bhiman JN, Moore PL, Sigal A, Ntusi NAB, Burgers WA, Riou C. T cell responses to SARS-CoV-2 spike cross-recognize Omicron. Nature, 2022, vol. 603, pp. 488–492. doi: 10.1038/s41586-022-04460-3.
  22. Khandker, S.S., Godman, B., Jawad, M.I., Meghla, B.A., Tisha, T.A., Khondoker, M.U., Haq, M.A., Charan, J., Talukder, A.A., Azmuda, N., Sharmin S., Jamiruddin M. R., Haque M., Adnan N. A systematic review on COVID-19 vaccine strategies, their effectiveness, and issues. Vaccines (Basel), 2021, vol. 9 (12), pp.1387 doi: 10.3390/vaccines9121387.
  23. Kohmer N., Westhaus S., Rüha C., Ciesek S., Rabenau H.F. Brief clinical evaluation of six high-throughput SARS-CoV-2 IgG antibody assays. J. Clin. Virol. 2020, Vol. 129, pp. 104480 doi: 10.1016/j.jcv.2020.104480
  24. Kojima, N., Shrestha, N.K., Klausner, J.D., A systematic review of the protective effect of prior SARS-CoV-2 infection on repeat infection. Eval. Health Prof., 2021, vol. 44(4), pp.327–332. doi: 10.1177/01632787211047932.
  25. Levin, E.G., Lustig, Y., Cohen, C., Fluss, R., Indenbaum, V., Amit, S., Doolman, R., Asraf, K., Mendelson, E., Ziv, A., Rubin C, Freedman L, Kreiss Y, Regev-Yochay G. Waning immune humoral response to BNT162b2 covid-19 vaccine over 6 months. N. Engl. J. Med., 2021, vol. 385, e84. doi: 10.1056/NEJMoa2114583.
  26. McIntyre, P.B., Aggarwal, R., Jani, I., Jawad, J., Kochhar, S., MacDonald, N., Madhi, S.A., Mohsni, E., Mulholland, K., Neuzil, K.M., Nohynek H., Olayinka F., Pitisuttithum P., Pollard A. J., Cravioto A. COVID-19 vaccine strategies must focus on severe disease and global equity. Lancet, 2022, vol.399, pp.406–410. doi: 10.1016/S0140-6736(21)02835-X.
  27. Moss, P. The T cell immune response against SARS-CoV-2. Nat. Immunol., 2022, vol. 23, pp.186–193. doi: 10.1038/s41590-021-01122-w.
  28. Naranbhai, V., Nathan A, Kaseke C, Berrios C, Khatri A, Choi S, Getz MA, Tano-Menka R, Ofoman O, Gayton A, Senjobe F, Zhao Z, St Denis KJ, Lam EC, Carrington M, Garcia-Beltran WF, Balazs AB, Walker BD, Iafrate AJ, Gaiha GD. T cell reactivity to the SARS-CoV-2 Omicron variant is preserved in most but not all individuals. Cell, 2022, vol.185, pp.1041–1051. doi: 10.1016/j.cell.2022.01.029.
  29. Ng, O.-W., Chia, A., Tan, A.T., Jadi, R.S., Leong, H.N., Bertoletti, A., Tan, Y.-J. Memory T cell responses targeting the SARS coronavirus persist up to 11 years post-infection. Vaccine, 2016, vol. 34, pp. 2008–2014. doi: 10.1016/j.vaccine.2016.02.063.
  30. Nordström P., Ballin M., Nordström A. Risk of SARS-CoV-2 reinfection and COVID-19 hospitalisation in individuals with natural and hybrid immunity: a retrospective, total population cohort study in Sweden. Lancet Infect Dis, 2022, vol. 22(6), pp.781–790 doi: 10.1016/S1473-3099(22)00143-8.
  31. Pape, K.A., Dileepan, T., Kabage, A.J., Kozysa, D., Batres, R., Evert, C., Matson, M., Lopez, S., Krueger, P.D., Graiziger, C., Vaughn BP, Shmidt E, Rhein J, Schacker TW, Khoruts A, Jenkins MK. High-affinity
  32. memory B cells induced by SARS-CoV-2 infection produce more plasmablasts and atypical memory B cells than those primed by mRNA vaccines. Cell Rep., 2021, vol. 37, pp. 109823. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109823.
  33. Petras, M. Highly effective naturally acquired protection against COVID-19 persists for at least 1 Year: a meta-analysis. J. Am. Med. Dir. Assoc., 2021, vol.22(11), pp.2263–2265. doi: 10.1016/j.jamda.2021.08.042.
  34. Quast I, Tarlinton D. B cell memory: understanding COVID-19. Immunity, 2021, vol. 54, pp.205–210. doi: 10.1016/j.immuni.2021.01.014.
  35. Reynolds, C.J., Pade, C., Gibbons, J.M., Butler, D.K., Otter, A.D., Menacho, K., Fontana, M., Smit, A., Sackville-West, J.E., Cutino-Moguel, T., Maini MK, Chain B, Noursadeghi M; UK COVIDsortium Immune Correlates Network, Brooks T, Semper A, Manisty C, Treibel TA, Moon JC; UK COVIDsortium Investigators, Valdes AM, McKnight Á, Altmann DM, Boyton R.
  36. Prior SARS-CoV-2 infection rescues B and T cell responses to variants after first vaccine dose. Science, 2021, vol. 372, pp. 1418–1423. doi: 10.1126/science.abh1282.
  37. Rodda L. B., Morawski P. A., Pruner K. B., Fahning M. L., Howard C. A., Franko N., Logue J., Eggenberger J., Stokes C., Golez I., Hale M., Gale M., Jr., Chu H. Y., Campbell D. J., Pepper M. Imprinted SARS-CoV-2-specific memory lymphocytes define hybrid immunity Cell, 2022, vol.185, pp.1588–1601 doi: 10.1016/j.cell.2022.03.018
  38. Rosenberg, E.S., Dorabawila, V., Easton, D., Bauer, U.E., Kumar, J., Hoen, R., Hoefer, D., Wu, M., Lutterloh, E., Conroy, M.B., Greene D, Zucker HA. Covid-19 vaccine effectiveness in New York state. N. Engl. J. Med., 2022, vol.386, pp.116–127. doi: 10.1056/NEJMoa2116063.
  39. Rossler, A., Riepler L, Bante D, von Laer D, Kimpel J. SARS-CoV-2 Omicron variant neutralization in serum from vaccinated and convalescent persons. N. Engl. J. Med., 2022, vol. 386, pp. 698–700. doi: 10.1056/NEJMc2119236.
  40. Shenai, M.B., Rahme, R., Noorchashm, H. Equivalency of protection from natural immunity in COVID-19 recovered versus fully vaccinated persons: a systematic review and pooled analysis. Cureus, 2021, vol.13, e19102. doi: 10.7759/cureus.19102.
  41. Tang, F., Quan, Y., Xin, Z.T., Wrammert, J., Ma, M.J., Lv, H., Wang, T.B., Yang, H., Richardus, J.H., Liu, W., Cao, W.C. Lack of peripheral memory B cell responses in recovered patients with severe acute respiratory syndrome: a six-year follow-up study. J. Immunol., 2011, vol. 186, pp. 7264–7268 doi: 10.4049/jimmunol.0903490.
  42. Turner JS, Kim W, Kalaidina E, Goss CW, Rauseo AM, Schmitz AJ, Hansen L, Haile A, Klebert MK, Pusic I, O'Halloran JA, Presti RM, Ellebedy AH. SARS-CoV-2 Infection Induces Long-Lived Bone Marrow Plasma Cells in Humans. Nature, 2021, vol. 595(7867), pp.421–425. doi: 10.1038/s41586-021-03647-4
  43. Turner JS, O'Halloran JA, Kalaidina E, Kim W, Schmitz AJ, Zhou JQ, Lei T, Thapa M, Chen RE, Case JB, Amanat F, Rauseo AM, Haile A, Xie X, Klebert MK, Suessen T, Middleton WD, Shi PY, Krammer F, Teefey SA, Diamond MS, Presti RM, Ellebedy AH. SARS-CoV-2 mRNA vaccines induce persistent human germinal centre responses. Nature, 2021, vol.596(7870), pp.109-113. doi: 10.1038/s41586-021-03738-2.
  44. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, McMahon M, Meade P, Mendu DR, Muellers K, Stadlbauer D, Stone K, Strohmeier S, Simon V, Aberg J, Reich DL, Krammer F, Cordon-Cardo C. Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection persist for months. Science, 2020, vol. 370, pp. 1227–1230. doi: 10.1126/science.abd7728

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Toptygina A.P., Afridonova Z.E., Zakirov R.S., Semikina E.L.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies