New genetic markers for typing Burkholderia pseudomallei strains


Cite item

Abstract

Burkholderia pseudomallei is the causative agent of melioidosis, a serious infectious disease in humans and animals that may not manifest itself for a long time and quickly develop to pneumonia and septicemia with a decrease in immunity and the presence of predisposing factors. Melioidosis is endemic in countries with tropical and subtropical climates, where B. pseudomallei is a part of the soil and water microbiota of stagnant water bodies, as well as the plant rhizosphere. The registration of imported cases of melioidosis in countries of the temperate climate zone, along with the continued threat of using this pathogen as a bioterrorism agent, indicate the relevance of research aimed at developing modern methods for diagnosing and typing this pathogen. The trend of modern research in the intraspecific differentiation of strains of pathogens of infectious diseases is the use of two or more types of molecular markers. A promising direction for the genotyping of B. pseudomallei strains is the use of the combination of VNTR loci, which provides a high discriminating ability of the method of multilocus variable tandem repeat number analysis (MLVA), and slowly evolving single nucleotide polymorphisms (SNPs). The aim of this work was to identify new VNTR and SNP loci suitable for use as genetic markers in the molecular typing of the causative agent of melioidosis. 20 strains of B. pseudomallei from the collection of Volgograd Plague Control Research Institute and whole genome sequences of 85 strains of B. pseudomallei from the GenBank NCBI database were the objects of study. When typing strains of the causative agent of melioidosis from the GenBank NCBI database for 4 VNTR loci, 74 genotypes were identified, of which 64 were unique (Hunter-Gaston index 0,997). It was found that the high allelic polymorphism of VNTR loci limited the ability to determine the geographical and phylogenetic relationships of B. pseudomallei isolates using the MLVA-4 scheme, and the identified null alleles increased the risk of homoplasia. In this regard, the MLVA-4 scheme was supplemented with a VNTR marker in the BPSS1974 locus encoding a collagen-like protein and SNP markers in the genes of lipid A biosynthesis lauroyl acyltransferase, RNA polymerase sigma factor RpoH, and glutamine amidotransferase. For amplification of the selected loci, primers and probes were designed as part of the developed scheme, which were tested in the typing of B. pseudomallei collection strains. According to the results of a cluster analysis of 105 strains of the causative agent of melioidosis, an integrated approach turned out to be optimal, allowing differentiation of strains within SNP groups based on VNTR profiles. The developed methodological approach to the genetic typing of B. pseudomallei, based on a comprehensive analysis of 4 SNP- and 5 MLVA-markers in our modification, makes it possible to differentiate strains according to the geographical regions of their origin and establish the clonal origin of isolates when cases of melioidosis are detected.

Full Text

Новые генетические маркеры для типирования штаммов Burkholderia pseudomallei.

Введение

Burkholderia pseudomallei является этиологическим агентом мелиоидоза – особо опасного заболевания людей и животных с высокой летальностью. По оценочным данным в мире от мелиоидоза ежегодно погибает около 89 000 человек [15]. В настоящее время эндемичными по мелиоидозу признано около 50 стран, расположенных между 30‑ми параллелями всех континентов, и этот список продолжает пополняться. Возможный занос с эндемичных территорий возбудителей редких инфекционных заболеваний является актуальной проблемой общественного здравоохранения.

В связи с высокой вирулентностью, низкой инфицирующей дозой и отсутствием эффективных вакцин возбудитель мелиоидоза включен в список потенциальных агентов биотерроризма как в Российской Федерации, так и за рубежом, что определяет необходимость развития технологий молекулярного типирования для определения клонального происхождения изолятов [1, 12, 24].

Востребованным подходом для оценки генетического разнообразия штаммов B. pseudomallei является метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов – MLVA (Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis), основанный на использовании вариабельных по копийности микро- и минисателлитных повторов (Variable Number Tandem Repeats, VNTRs) [25]. Подбор вариабельных локусов и определение их количества в схеме типирования являются критичными для оценки результатов анализа. При этом увеличение количества анализируемых VNTR-локусов может приводить к выявлению уникальных аллелей, которые скорее будут оценивать не популяционно-генетическую изменчивость, а вариабельность самого маркера. Так, предложенная J.M. U'Ren с соавт. [23] 32-локусная схема MLVA‑типирования дифференцирует близкородственные штаммы, включая последовательные изоляты от одного больного, что может повлечь получение искаженных данных, например, при определении характера вспышки и ее наиболее вероятного источника. С другой стороны, сокращение схем MLVA-типирования снижает дискриминирующую способность метода, в результате чего возрастает вероятность получения схожих профилей у неродственных штаммов в результате гомоплазии.

Проблема гомоплазии актуальна и при проведении мультилокусного сиквенс‑типирования (Multilocus Sequence Typing, MLST), поскольку характерная для B. pseudomallei высокая частота рекомбинационных событий может приводить к единообразию сиквенс-типов (sequence type, ST) изолятов, несмотря на их генетическую и географическую гетерогенность [3].

Тенденцией современных исследований по внутривидовому типированию микроорганизмов является использование двух и более типов молекулярных маркеров, что повышает достоверность результатов исследования. В частности, перспективным представляется дополнение схемы MLVA анализом медленно эволюционирующих единичных нуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs).

Целью данной работы являлось выявление новых VNTR- и SNP-локусов, пригодных для использования в качестве генетических маркеров в молекулярном типировании B. pseudomallei.

Материалы и методы

Объектами исследования служили 20 штаммов возбудителя мелиоидоза из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (табл. 1) и полногеномные последовательности 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome).

Таблица 1. Штаммы B. pseudomallei, использованные в работе

Экстракцию нуклеиновых кислот из предварительно обеззараженных в соответствии с МУ 1.3. 2569-09 суспензий клеток (108 м.к/мл) штаммов B. pseudomallei проводили с использованием коммерческого набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), согласно инструкции производителя.

Для проведения мультилокусного VNTR-анализа штаммов B. pseudomallei по‑локусной схеме (S389k, S1788k, L933k и L2341k) использовали олигонуклеотидные праймеры и условия амплификации, предложенные в работе B.J. Currie с соавт. [6]. MLVA‑генотип исследуемых штаммов B. pseudomallei определяли как совокупность аллельных вариантов каждого локуса и представляли в виде числового паттерна количества повторов по локусам S389k‑S1788k‑L933k-L2341k. Амплификацию тандемных повторов в составе дополнительного локуса BPSS1974 проводили с помощью разработанных ранее праймеров Burk0090s (5'‑ATCGCAATCGGCATTTCCACCC-3') и Burk0090as (5'‑GTGGCGGAGACGACGGTGС-3') при следующих параметрах: 95 °С – 10 мин, 40 циклов (94 °С – 10 с, 66 °С – 20 с, 72 °С – 45 с), 72 °С ‑ 5 мин [2].

Для определения однонуклеотидных полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) разработаны праймеры и TaqMan-зонды, нуклеотидные последовательности которых указаны в табл. 2. Амплифкацию локусов с однонуклеотидными полиморфизмами проводили на термоциклере роторного типа «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия), с детекцией флюоресценции по каналам FAM/Green и JOE/Yellow после каждой стадии элонгации. SNP‑профиль штаммов B. pseudomallei представляли как последовательность нуклеотидов в каждом из четырех локусов – (SNP1‑SNP2‑SNP3-SNP4).

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, сконструированных для определения однонуклеотидных полиморфизмов

Примечание. Вариабельные нуклеотиды обозначены строчными буквами

Нуклеотидные последовательности полученных ампликонов определяли методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора «ABI 3130 Genetic Analyzer» («Applied Biosystems», США).

Поиск кандидатных маркерных локусов проводили in silico путем множественного выравнивания и сравнительного анализа фрагментов геномов штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI, с помощью модуля MUSCLE программы Unipro UGENE v40.0 [17]. Дизайн олигонуклеотидов осуществляли с использованием программного обеспечения Primer3Plus [22] и «OLIGO v6.71» (Molecular Biology Insights,. Inc., Cascade, США).

Кластерный анализ и построение дендрограмм проводили при помощи программ FAMD v1.31 [19] и Mega v11.0.11 [21] с использованием коэффициента генетической дистанции Жаккарда (GDJaccard) и алгоритма объединения ближайших соседей (Neighbor-Joining, NJ). Для оценки вариабельности генетических локусов рассчитывали индекс аллельного полиморфизма (h) [20]. Дискриминирующую способность методов молекулярного типирования определяли на основании расчета индекса Хантера-Гастона (HGDI) [13].

При проведении in silico мультилокусного сиквенс-типирования штаммов B. pseudomallei из GenBank NCBI использовали базу данных PubMLST (https://pubmlst.org/bpseudomallei). Группы изолятов, сиквенс-типы которых являлись одно- и двухлокусными вариантами (single- and double-locus variants, SLV/DLV), объединяли в клональные комплексы (clonal complexes, CC) c помощью алгоритма goeBURST (https://www.phyloviz.net/goeburst).

Результаты исследований

Типирование 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI по схеме MLVA‑4 распределило исследованные штаммы по 74 MLVA-типам, 10 из которых включали от двух до трех штаммов и 64 были представлены одним изолятом. По данным MLST среди этих же штаммов обнаружено 57 различных сиквенс-типов, причем 22 из них являлись SLV с образованием 6 клональных комплексов (рис. 1а).

Рисунок 1. Сравнительный анализ результатов типирования 85 штаммов B. pseudomallei с помощью схемы MLVA-4 (а) и сочетанного использования схемы MLVA-4, локуса BPSS1974#I и SNP1-4 (б)

Примечание. Штаммы одного клонального комплекса отмечены одинаковыми пиктограммами

При сопоставлении MLST- и MLVA-профилей определены четыре группы штаммов B. pseudomallei. В первые две группы были распределены штаммы с общими сиквенс-типами и имеющие в пределах каждого ST идентичные MLVA‑профили (группа ST/MLVA‑I) и близкие MLVA‑профили, отличающиеся по одному локусу не более чем на два повтора (группа ST/MLVA-II). Штаммы одного ST, но различающиеся по двум и более VNTR‑локусам, были отнесены в группу ST/MLVA-III. Четвертая группа являлась наиболее гетерогенной и включала штаммы, которые в соответствии с их сиквенс-типами объединены в клональные комплексы (ST/MLVA-IV).

В первую группу вошли штаммы с профилем ST975/(4-7-11-2)MSHR5864 и MSHR6755 (Австралия, 2011 и 2012 гг.); ST126/(3-8-12-9) – MSHR435 и MSHR491 (Австралия, 1996 и 1997 гг.); ST1001/(4‑5-3-9) – vgh16R и vgh16W (Тайвань, 2001 г.).

Во вторую группу были включены 11 штаммов, которым соответствовало 4 различных профиля ST/(S389k-S1788k-L933k-L2341k). При этом в трех случаях межштаммовые различия в пределах одного профиля обусловлены вариабельным числом повторов по локусу L933k: ST36/(3‑7‑8/7‑3)MSHR0305, MSHR520, MSHR3763 и MSHR4083 (Австралия, 1994, 1998 и 2010 гг.); ST553/(6‑4‑5/3‑8)MSHR5848 и MSHR5855 (Австралия, 2011 г.); ST667/(8‑6‑6/7‑8)A79A и B03 (Папуа‑Новая Гвинея, 2011 г). Штаммы с сиквенс-типом ST617 различались на 1 повтор по локусу S389k и были представлены профилем ST617/(5/6‑9‑2‑6) MSHR146, MSHR0511 и NAU20B-16 (Австралия, 1992, 1997 и 2007 гг.).

У штаммов группы ST/MLVA-III по результатам VNTR-типирования выявлена вариабельность числа повторов в каждом из четырех локусов. MLVA‑профили штаммов 1106a и 1106b (Таиланд, 1993 и 1996 гг.) отличались на три повтора по локусу L2341k и имели генотип ST70/(4-6-13-11/8), а от штамма BPC006 (Китай, 2008 г.) дополнительно по локусу S389k – ST70/(3‑6‑13‑5). Штаммы MSHR5858 (Австралия, 2011 г.) и 350105 (Китай, 1976 г.), принадлежавшие к сиквенс-типу ST562, отличались по трем VNTR-локусам (6/8‑8‑8/1110/11). Вариабельность MLVA-генотипов австралийских штаммов MSHR1435 и MSHR1655 (2002 и 2003 гг., соответственно), относящихся к сиквенс-типу ST131, обусловлена локусами S389k и S1788k – (4/08/9‑5‑6).

Группу ST/MLVA-IV составили 36 штаммов B. pseudomallei 22 сиквенс-типов, распределенных по 6 клональным комплексам. В наибольший по численности клональный комплекс (СС92) вошел 21 штамм B. pseudomallei сиквенс-типов ST92, ST95, ST12, ST10, ST518, ST1038, ST297, ST436, ST951 и ST698. В результате MLVA‑типирования по 4 вышеназванным VNTR-локусам выявлена принадлежность штаммов СС92 к четырем крупным MLVA‑кластерам (A, B, E и J), внутри которых штаммы дифференцировались на группы генотипов. При значении генетической дистанции 0,4 выявлено 11 таких групп – A1, A2, A3, A4, A5, B1, B3, E1, E2, J1 и J3 (рис. 1а).

Анализ результатов MLVA-типирования штаммов клонального комплекса CC92 показал, что сформированные группы в ряде случаев связаны с географическим происхождением штаммов. Так, в группу B1 вошли изолированные от домашних игуан в 2007 и 2013 гг. в Калифорнии штаммы B. pseudomallei 2002734728 и 2013746777 с идентичным VNTR-профилем (6‑6‑9‑2) и отличающиеся от них по локусам S389k и L933k штаммы 2010007509 (Аризона, 2009г.) и 2011756189 (Швейцария, 2010 г.). При этом штаммы 2010007509 и 2011756189 отличались только по локусу L933k (9‑6‑8/10‑2) и были выделены от больных людей, инфицированных при посещении Коста-Рики и Мартиники соответственно [10, 11]. Принадлежность штаммов B. pseudomallei 2002734728, 2013746777 и 2010007509 к общему сиквенс-типу (ST518) и тот факт, что большинство игуан для торговли США импортируют из Центральной Америки, дают основания предполагать общность происхождения штаммов данной группы.

В группу A1 по результатам MLVA-4 анализа объединены штаммы возбудителя мелиоидоза, выделенные в Венесуэле (B. pseudomallei 2002721171) и от больных людей в США, посещавших Гватемалу (B. pseudomallei 2013746878) и Мексику (B. pseudomallei 2008724734 и 3000015486). При этом штаммы из Венесуэлы и Гватемалы имели идентичный VNTR-профиль (5-5-11-2) и отличались по локусу S389k от штамма B. pseudomallei 3000015486 (4-5-11-2), а от штамма B. pseudomallei 2008724734 дополнительно по локусу L933k (4-5-15-2). Несмотря на близость VNTR-профилей, все штаммы из этой группы принадлежали к разным сиквенс-типам (ST12, ST1038, ST95, ST92).

Все штаммы группы E1 относились к сиквенс-типу ST297. В нее вошли клинический и два почвенных штамма, выделенные в Пуэрто-Рико, а также один штамм от пациента в США, посещавшего республику Тринидад и Тобаго. Почвенные штаммы B. pseudomallei 2013833055 и 2013833057 имели одинаковый VNTR-профиль (4-10-12-6), который отличался от профилей клинических штаммов по локусам L933k и L2341k: B. pseudomallei 2011756296 (4-10-9-6) и B. pseudomallei 2011756295 (4-10-12-3).

К группе A5 с VNTR-профилем (6/8-5-16/19-2) были отнесены штаммы B. pseudomallei VB976100 (ST436) и 3000015237 (ST951), выделенные соответственно от зеленой игуаны в Праге и от больного человека в США, посещавшего Мексику.

Остальные штаммы клонального комплекса СС92, отнесенные по результатам VNTR‑типирования к MLVA‑кластерам A, B и E, были представлены на дендрограмме отдельными ветвями (A2, A4) или формировали общие группы со штаммами других сиквенс-типов (A3, B3 и E2). Вместе с тем, два других штамма этого клонального комплекса – B. pseudomallei 2002721123 и K96243 – вошли в состав дистанцированного MLVA‑кластера J. При этом в группу J3 наряду со штаммом B. pseudomallei K96243 были объединены 7 штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенные в 2015 г. от больных людей в Шри-Ланке, в том числе 5 штаммов клонального комплекса (ST1364‑ST594‑ST1413). Для штаммов из других 4 клональных комплексов явной взаимосвязи VNTR‑профилей с географическим происхождением выявлено не было.

Вариабельность VNTR-профилей у исследованных штаммов B. pseudomallei в ряде случаев была обусловлена не только копийностью мотива в составе минисателлитного локуса, но и INDELL-мутациями в составе коровой единицы. Так, аллельные варианты локусов S389k, L933k и L2341k у выделенных в 2015 г. в Шри-Ланке клинических изолятов обусловлены делециями нуклеотидов. При этом штамм B. pseudomallei BPs112 в результате делеции трех нуклеотидов в коровой единице локуса L933k был отнесен к MLVA-кластеру H, в составе которого сформировал отдельную ветвь с B. pseudomallei 2013746811 (США, 2013 г.).

Анализ аллельного полиморфизма продемонстрировал высокую вариабельность локусов L933k и L2341k, для которых установлено наличие 20 (h = 0,906) и 16 аллелей (h = 0,877), соответственно. Локусы S389k (h = 0,799) и S1788k (h = 0,825) были представлены 10 вариантами каждый. Значение индекса Хантера-Гастона составило 0,997, что демонстрирует очень высокую разрешающую способность метода.

Полученные данные свидетельствуют о широком диапазоне аллельного разнообразия и высокой скорости мутирования VNTR-локусов, что ограничивает возможность схемы MLVA-4 для определения географических и филогенетических связей изолятов возбудителя мелиоидоза. В связи с этим был проведен поиск более консервативных локусов, включение которых в схему MLVA-4 позволит добиться большей точности в определении степени генетического родства изучаемых штаммов.

В качестве такого VNTR-маркера выбран минисателлитсодержащий регион в составе локуса BPSS1974 штамма B. pseudomallei K96243, аннотированного в базе данных GenBank NCBI как ген коллагеноподобного белка. Обнаруженный регион был обозначен как BPSS1974#I и представлял собой вырожденный 9‑нуклеотидный мотив (TCX1GGX2ACX3)n, где Х1/Х2/Х3 – вариабельные нуклеотидные позиции, n – число повторов. Мутации типа транзиций и трансверсий в положениях Х1, Х2 и Х3 мотива соответствовали третьим позициям кодонов, кодирующих пептид (Ser‑Gly-Thr)n и не приводили к замене аминокислот (dN/dS = 0), что свидетельствует о действии стабилизирующего отбора. У проанализированных 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI в соответствии с копийностью мотива в составе локуса BPSS1974#I выявлено 20 аллельных вариантов (h = 0,8).

В качестве кандидатных SNP-маркеров выбраны последовательности генов лауроилацилтрансферазы биосинтеза липида-А (Gene ID: 3093529 (BPSL0211)) – обозначены нами как SNP1 и SNP2; сигма-фактора RpoH РНК‑полимеразы (Gene ID: 3094670 (BPSL0504)) – обозначен как SNP3; глутаминамидотрансферазы (Gene ID: 3091795 (BPSL3430)) – обозначен как SNP4 (табл. 2). Типирование этой же выборки штаммов с использованием предлагаемого набора однонуклеотидных полиморфизмов выявило 13 SNP-паттернов.

Сравнение генетических профилей по локусам BPSS1974#I и SNP1-4 показало их идентичность у всех штаммов, принадлежащих одному сиквенс-типу и имеющих общий регион выделения. Штаммы из одного клонального комплекса обладали по предлагаемым локусам идентичными или близкими профилями. Так, на основании полученных паттернов штаммы B. pseudomallei 1710a и 1710b (Таиланд, 1996 г. и 1999 г.) и B. pseudomallei Pasteur 52237 (Вьетнам, 1964 г) клонального комплекса ST177-ST411, отличающиеся по схеме MLVA-4 по трем VNTR-локусам, отнесены к одному генотипу. Штаммы клонального комплекса ST1364-ST594-ST1413, изолированные от больных людей на Шри-Ланке, также обладали идентичными профилями по локусам BPSS1974#I и SNP1-4 за исключением B. pseudomallei BPs115, который отличался по локусу SNP3.

У штаммов клонального комплекса CC92 установлено шесть аллельных вариантов по локусу BPSS1974#I и два SNP профиля, различающиеся по локусу SNP1 – (G/A-G-A-T). При этом SNP-профиль (A-G-A-T) был обнаружен только у почвенных и клинических штаммов, выделенных в Пуэрто-Рико (B. pseudomallei 2013833055, 2013833057, 2011756296 и 2002721100), а также от посещавших соседние острова туристов (B. pseudomallei 2011756295 и 2011756189). Аллельный вариант локуса BPSS1974#I с числом повторов 52 выявлен среди штаммов CC92 только у B. pseudomallei 2013746878, 2002721171 и VB976100, что наряду с идентичным SNP-профилем (G-G-A-T) позволило выделить их в отдельную группу.

Интересно, что штаммы B. pseudomallei 1106a, 1106b (Таиланд) и BPC006 (Китай) группы ST/MLVA-III, принадлежащие к ST70, имели в локусе BPSS1974#I 61 повтор, но отличались по локусам SNP1 и SNP2 в зависимости от региона выделения: для штаммов из Таиланда установлен SNP-профиль (G‑G‑A-T), а из Китая – (A‑A‑A-T). Необходимо отметить, что SNP‑профиль (A‑A‑A-T) обнаружен всего у трех штаммов исследованной выборки, выделенных в соседних Китае у B. pseudomallei BPC006 (ST70) и 350105(ST562) и Пакистане – B. pseudomallei 9 (ST72), причем ST562 и ST72 представляли собой двухлокусные варианты друг друга, тогда как ST70 отличался по всем аллелям.

Дополненная локусами BPSS1974#I и SNP1-4 схема MLVA-4, обозначенная как MBS (MLVA-4, BPSS1974#I, SNP1-4), позволила более точно разделить штаммы B. pseudomallei в соответствии с регионом их происхождения (рис. 1б). Так, штаммы клонального комплекса CC92 были распределены по четырем отдельным кластерам с определенной географической приуроченностью. Наиболее крупные из них MBS1 и MBS5 объединяли штаммы из стран Центральной Америки, Мексики, Венесуэлы и островов Карибского бассейна, завезенные в США и Европу. Кластер MBS11 включал штаммы из Пуэрто-Рико и Республики Тринидад и Тобаго. В самостоятельную ветвь внутри кластера MBS8 выделены штаммы B. pseudomallei 2002721123 (Пуэрто-Рико, 1998 г.) и K96243 (Таиланд, 1999 г.).

Штаммы из MLVA-кластера F по схеме MBS разделились на три разные группы, коррелирующие с их географическим происхождением и сиквенс-типами. Так, в отдельную группу выделены тайские штаммы B. pseudomallei 406e и HBPUB10134a, сиквенс-типы которых являлись двухлокусными вариантами. Штаммы 1710a, 1710b и Pasteur 52237 клонального комплекса ST177-ST411, изолированные в Таиланде и Вьетнаме, кластеризовались вместе с малазийским штаммом B. pseudomallei 982. При этом обе группы вошли в состав кластера MBS15, в то время как третья группа штаммов из Австралии (B. pseudomallei NCTC_13178 и MSHR7929) и Папуа‑Новой Гвинеи (B. pseudomallei K42) сформировали отдельный кластер MBS10.

Применение схемы MBS позволило выделить штаммы из Австралии в три отдельных кластера – MBS6, MBS7 и MBS12, в каждом из которых штаммы имели идентичные SNP‑профили, но отличались по VNTR-локусам. Исключение составил лишь клинический штамм B. pseudomallei MSHR1153, отличающийся от доминирующего генотипа кластера MBS7 по локусу SNP2. У трех штаммов кластера MBS6 (B. pseudomallei MSHR3965, MSHR5864 и MSHR6755) в локусе BPSS1974#I идентифицировано одинаковое число повторов, что позволило выделить их в отдельную группу этого кластера.

Разработанная схема типирования была экспериментально апробирована на коллекционных штаммах Bpseudomallei различного географического происхождения (табл. 1).

На основании комплексного анализа VNTR- и SNP-локусов, входящих в состав предлагаемой схемы MBS, проведено типирование 105 штаммов возбудителя мелиоидоза, включая 20 коллекционных (рис. 2). При этом характер кластеризации 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI сохранялся, что свидетельствует о применимости разработанного методического подхода для филогенетического анализа при проведении эпидемиологического расследования случаев заболевания.

Рисунок 2. Дендрограмма, построенная с помощью алгоритма Neighbor-Joining, по результатам типирования 105 штаммов B. pseudomallei с использованием данных комплексного анализа на основе молекулярных маркеров 5 VNTR- и 4 SNP-локусов. Рамками отмечены штаммы из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Примечание. Штаммы одного клонального комплекса отмечены одинаковыми пиктограммами. Рамками обозначены штаммы из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Обсуждение

Молекулярное типирование возбудителя мелиоидоза осуществляется с применением ряда методов, заключающихся в анализе отдельных генетических локусов, их комплексов или определении полной последовательности геномов. Вместе с тем, использование отдельных подходов или их сочетания требует осторожности, поскольку установленная для B. pseudomallei высокая частота гомологичной рекомбинации между штаммами может не отражать эволюционную историю отдельных генов [5, 16].

Сочетание филогенетической информативности однонуклеотидных полиморфизмов и дискриминирующей способности метода MLVA позволило разработать схему из 4 SNP- и 5 VNTR-локусов, обозначенную как MBS. Предложенная схема в большинстве случаев обеспечивает группирование штаммов возбудителя мелиоидоза в зависимости от общности их географического происхождения. Показательно, что штаммы B. pseudomallei из стран Западного полушария сформировали три группы, конкретизирующие регион их происхождения: в одну группу вошли штаммы из Пуэрто-Рико и Республики Тринидад и Тобаго, а две другие были представлены завозными случаями преимущественно из Мексики, Центральной Америки и островов Карибского бассейна. Подобное распределение штаммов B. pseudomallei показано в работе J.E. Gee с соавт. [10] на основании анализа SNP‑полиморфизмов всего генома. Примечательно, что как на уровне полного генома, так и по 9 локусам предложенной схемы MBS, штамммы из Мексики обладают большим генетическим разнообразием в сравнении с пуэрториканскими.

В нашем исследовании штаммы B. pseudomallei 2002721171 (ST12) и 2013746878 (ST1038), выделенные соответственно в Венесуэле и от посещавшего Гватемалу пациента из США, кластеризовались вместе со штаммом VB976100 (ST436) неизвестного происхождения, изолированного в Праге из абсцесса зеленой игуаны [8]. Ранее сиквенс-тип ST436 был идентифицирован только у двух штаммов из Центральной Америки (Гватемалы и Перу). В соответствии со схемой MBS B. pseudomallei 2013746878 и 2002721171 имели идентичный генотип и отличались от B. pseudomallei VB976100 только по локусам S389k и L933k, что свидетельствовало в пользу центральноамериканского происхождения штамма VB976100.

Связь образованных групп с географическим происхождением штаммов дает основание рассматривать схему MBS в качестве полезного инструмента при расследовании случаев мелиоидоза у пациентов с неясной историей путешествий в эндемичные страны. Так, штаммы B. pseudomallei 2008724758, PB08298010 и 2013746811 выделены от больных, никогда не выезжавших за пределы континентальной части США [9, 18, 7], тем не менее, проведенное типирование показало происхождение этих штаммов за пределами Западного полушария [10].

Существенный интерес представляет перспективность использования схемы MBS для оценки генетического разнообразия B. pseudomallei на эндемичных территориях. Так, результаты проведенного нами генотипирования штаммов, выделенных во время вспышки мелиоидоза в восточной части Шри-Ланки в 2015 г., полностью соответствовали результатам полногеномного анализа H.S. Jayasinghearachchi с соавт. [14].

Одной из проблем при проведении генотипирования является скрытый полиморфизм, обусловленный отсутствием продукта амплификации. Так, в ходе исследования выявлено отсутствие VNTR-локуса S389k у B. pseudomallei MSHR1655 (ST131), изолированного от больного в Австралии, который по схеме MLVA-4 кластеризовался с австралийскими штаммами ST617, выделенными из объектов окружающей среды. Вместе с тем, при сравнении аллельных профилей по трем остальным локусам схемы MLVA-4 установлено, что VNTR-профиль MSHR1655 отличался на три повтора по локусу L933k от штаммов ST617, а от почвенного изолята MSHR1435 того же ST131, выделенного в Австралии годом ранее – на один повтор по локусу S1788k. Включение в схему MLVA-4 дополнительных молекулярных маркеров позволило выделить штаммы MSHR1655 и MSHR1435 в отдельную кластерную группу на основе идентичности их профилей по локусам BPSS1974#I и SNP1-4.

Таким образом, предложен комплексный подход для типирования B. pseudomallei, позволяющий на основании MLVA-профилей осуществлять дифференциацию штаммов B. pseudomallei внутри SNP-групп, который может рассматриваться как эффективный способ для установления филогеографических взаимосвязей штаммов. Разработанный методический подход к генетическому типированию B. pseudomallei, основанный на сочетанном анализе SNP- и MLVA-маркеров, позволяет дифференцировать штаммы в соответствии с географическими регионами их происхождения и устанавливать клональность случаев мелиоидоза.

×

About the authors

Margarita Leontievna Ledenyova

Volgograd Plague Control Research Institute

Author for correspondence.
Email: volresin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5923-4774

scientific researcher of the laboratory of gene diagnostics

Russian Federation, 400131, Russian Federation, Volgograd, Golubinskaya str., 7, Volgograd Plague Control Research Institute

Galina Alexandrovna Tkachenko

Volgograd Plague Control Research Institute

Email: tkachenko_g@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0199-3342

кандидат медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории генодиагностики

400131, Russian Federation, Volgograd, Golubinskaya str., 7, Volgograd Plague Control Research Institute

Irina Borisovna Zakharova

Volgograd Plague Control Research Institute

Email: zib279@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7808-7658

candidate of biological science, docent, leading researcher of the laboratory of pathogenic Burkholderia

Russian Federation, 400131, Russian Federation, Volgograd, Golubinskaya str., 7, Volgograd Plague Control Research Institute

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Ledenyova M.L., Tkachenko G.A., Zakharova I.B.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies