New genetic markers for Burkholderia pseudomallei strains typing

Cover Page

Cite item

Abstract

Burkholderia pseudomallei is the causative agent of melioidosis, a serious infectious disease in humans and animals that may be asymptomatic long-term and quickly develop to pneumonia and septicemia in immunocompromised state and due to predisposing factors. Melioidosis is endemic in countries with tropical and subtropical climates, where B. pseudomallei is a part of the soil and water microbiota of stagnant water bodies, as well as the plant rhizosphere. The recording of imported melioidosis cases in countries with temperate climate zone, along with the continued threat of using this pathogen as a bioterrorism agent, indicate the relevance of research aimed at developing modern methods for its diagnosing and typing. Current research in the intraspecific differentiation of pathogenic strains of infectious diseases tends to use two or more types of molecular markers. A promising direction for the B. pseudomallei strains genotyping is based on using a combination of VNTR loci, which provides a high discriminating ability of the method of multi-locus variable tandem repeat number analysis (MLVA), and slowly evolving single nucleotide polymorphisms (SNPs). The aim of this work was to identify new VNTR and SNP loci suitable for use as genetic markers in molecular typing of the melioidosis causative agent. 20 strains of B. pseudomallei from the collection of the Volgograd Plague Control Research Institute and whole genome sequences of 85 B. pseudomallei strains from the GenBank NCBI database were analyzed. While typing melioidosis causative agent strains from the GenBank NCBI database for 4 VNTR loci, 74 genotypes were identified, of which 64 were unique (Hunter–Gaston index 0.997). It was found that the high allelic polymorphism of VNTR loci limited a potential to determine the geographical and phylogenetic relationships of B. pseudomallei isolates by using the MLVA-4 scheme, and the identified null alleles increased the risk of homoplasia. In this regard, the MLVA-4 scheme was supplemented with a VNTR marker in the BPSS1974 locus encoding a collagen-like protein as well as with SNP markers in the genes of lipid A biosynthesis lauroyl acyltransferase, RNA polymerase sigma factor RpoH, and glutamine amidotransferase. For amplification of the select loci, primers and probes were designed as part of the developed scheme, which were tested in the typing of B. pseudomallei collection strains. According to the results of a cluster analysis for 105 strains of the melioidosis causative agent, an integrated approach turned out to be optimal, allowing differentiation of strains within SNP groups based on VNTR profiles. The methodological approach developed for B. pseudomallei genetic typing, based on a comprehensive analysis of 4 SNP- and 5 MLVA-markers in our modification, allowed to differentiate strains according to the geographical regions of their origin and establish the clonal origin of isolates upon revealing cases of melioidosis.

Full Text

Введение

Burkholderia pseudomallei является этиологическим агентом мелиоидоза — особо опасного заболевания людей и животных с высокой летальностью. По оценочным данным в мире от мелиоидоза ежегодно погибает около 89 000 человек [15]. В настоящее время эндемичными по мелиоидозу признано около 50 стран, расположенных между 30-ми параллелями всех континентов, и этот список продолжает пополняться. Возможный занос с эндемичных территорий возбудителей редких инфекционных заболеваний является актуальной проблемой общественного здравоохранения.

В связи с высокой вирулентностью, низкой инфицирующей дозой и отсутствием эффективных вакцин возбудитель мелиоидоза включен в список потенциальных агентов биотерроризма как в Российской Федерации, так и за рубежом, что определяет необходимость развития технологий молекулярного типирования для определения клонального происхождения изолятов [1, 12, 24].

Востребованным подходом для оценки генетического разнообразия штаммов B. pseudomallei является метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов — MLVA (Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis), основанный на использовании вариабельных по копийности микро- и минисателлитных повторов (Variable Number Tandem Repeats, VNTRs) [4, 25]. Подбор вариабельных локусов и определение их количества в схеме типирования являются критичными для оценки результатов анализа. При этом увеличение количества анализируемых VNTR-локусов может приводить к выявлению уникальных аллелей, которые скорее будут оценивать не популяционно-генетическую изменчивость, а вариабельность самого маркера. Так, предложенная J.M. U’Ren и соавт. [23] 32-локусная схема MLVA-типирования дифференцирует близкородственные штаммы, включая последовательные изоляты от одного больного, что может повлечь получение искаженных данных, например, при определении характера вспышки и ее наиболее вероятного источника. С другой стороны, сокращение схем MLVA-типирования снижает дискриминирующую способность метода, в результате чего возрастает вероятность получения схожих профилей у неродственных штаммов в результате гомоплазии.

Проблема гомоплазии актуальна и при проведении мультилокусного сиквенс-типирования (Multilocus Sequence Typing, MLST), поскольку характерная для B. pseudomallei высокая частота рекомбинационных событий может приводить к единообразию сиквенс-типов (sequence type, ST) изолятов, несмотря на их генетическую и географическую гетерогенность [3].

Тенденцией современных исследований по внутривидовому типированию микроорганизмов является использование двух и более типов молекулярных маркеров, что повышает достоверность результатов исследования. В частности, перспективным представляется дополнение схемы MLVA анализом медленно эволюционирующих единичных нуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs).

Целью данной работы являлось выявление новых VNTR- и SNP-локусов, пригодных для использования в качестве генетических маркеров в молекулярном типировании B. pseudomallei.

Материалы и методы

Объектами исследования служили 20 штаммов возбудителя мелиоидоза из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (табл. 1) и полногеномные последовательности 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome).

 

Таблица 1 Штаммы B. pseudomallei, использованные в работе

Table 1. B. pseudomallei strains used in the study

Штаммы B. pseudomallei

Strains of B. pseudomallei

Источник выделения

Selection source

Место и год выделения

Place and year of isolation

Tchad 97

больной человек, кровь

sick person, blood

Чад, Африка, 1978

Chad, Africa, 1978

Iran Terre 98

больной человек, кровь

sick person, blood

Иран, 1978

Iran, 1978

Dalat 100

больной человек, кровь

sick person, blood

Далат, Центральный Вьетнам, 1978

Dalat, Сentral Vietnam, 1978

PI 54 107

нет данных

no data

Дания, Копенгаген, 1983

Denmark, Copenhagen, 1983

Pearce 110

больной человек, кровь

sick person, blood

Австралия, 1983

Australia, 1983

Skanmandri 113

больной человек, мокрота

больной человек, sputum

Австралия, 1983

Australia, 1983

128

нет данных

no data

Австралия, 1986

Australia, 1986

131

клинический изолят

clinical isolate

Таиланд, 1985

Thailand, 1985

132

клинический изолят

clinical isolate

Таиланд, 1985

Thailand, 1985

134

клинический изолят

clinical isolate

Таиланд, 1985

Thailand, 1985

136

клинический изолят

clinical isolate

Таиланд, 1985

Thailand, 1985

51274

больной человек, гнойные абсцессы

sick person, purulent abscesses

Вьетнам, 1950

Vietnam, 1950

56738

больной человек, кровь

sick person, blood

Вьетнам, 1950

Vietnam, 1950

56770

больной человек, моча

sick person, urine

Вьетнам, 1950

Vietnam, 1950

56812

больной человек, кровь

sick person, blood

Вьетнам, 1950

Vietnam, 1950

57562

больной человек, гной сустава

sick person, joint pus

Вьетнам, 1950

Vietnam, 1950

59361

гной яичка свиньи

pig testicle pus

Южный Вьетнам, 1962

South Vietnam, 1962

59426

больной человек, кровь

sick person, blood

Вьетнам, 1950

Vietnam, 1950

61503

больной человек, гной подкожного абсцесса

sick person, subcutaneous abscess pus

Вьетнам, 1962

Vietnam, 1962

C-141 (CIP 6068)

больной человек, кровь

sick person, blood

Сайгон, Вьетнам, 1948

Saigon, Vietnam, 1948

 

Экстракцию нуклеиновых кислот из предварительно обеззараженных в соответствии с МУ 1.3. 2569-09 суспензий клеток (108 м.к/мл) штаммов B. pseudomallei проводили с использованием коммерческого набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), согласно инструкции производителя.

Для проведения мультилокусного VNTR-анализа штаммов B. pseudomallei по 4-локусной схеме (S389k, S1788k, L933k и L2341k) использовали олигонуклеотидные праймеры и условия амплификации, предложенные в работе B.J. Currie и соавт. [6]. MLVA-генотип исследуемых штаммов B. pseudomallei определяли как совокупность аллельных вариантов каждого локуса и представляли в виде числового паттерна количества повторов по локусам S389k-S1788k-L933k-L2341k. Амплификацию тандемных повторов в составе дополнительного локуса BPSS1974 проводили с помощью разработанных ранее праймеров Burk0090s (5′-ATCGCAATCGGCA TTTCCACCC-3′) и Burk0090as (5′-GTGGCGG AGACGACGGTGС-3′) при следующих параметрах: 95°С — 10 мин, 40 циклов (94°С — 10 с, 66°С — 20 с, 72°С — 45 с), 72°С — 5 мин [2].

Для определения однонуклеотидных полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) разработаны праймеры и TaqMan-зонды, нуклеотидные последовательности которых указаны в табл. 2. Амплифкацию локусов с однонуклеотидными полиморфизмами проводили на термоциклере роторного типа «Rotor-Gene Q» (Qiagen, Германия) с детекцией флюоресценции по каналам FAM/Green и JOE/Yellow после каждой стадии элонгации. SNP-профиль штаммов B. pseudomallei представляли как последовательность нуклеотидов в каждом из четырех локусов — (SNP1-SNP2-SNP3-SNP4).

 

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, сконструированных для определения однонуклеотидных полиморфизмов

Table 2. Nucleotide sequences of primers and probes designed to detect single nucleotide polymorphisms

Локус/Условное обозначение SNPs

Locus/Symbol of the SNPs

Наименование праймеров/зонда

Primers/Probe name

Нуклеотидная последовательность (5′→3′)

Nucleotide sequence (5′→3′)

BPSL0211/

SNP1

BpsSNP1s

BpsSNP1as

BpsSNP1prC

BpsSNP1prT

AATCGGGAAAGCAGAGTTG

CGTTTCTCAAATTCCTCGC

(FAM)-CTCGGCTGGCTGCTCTATCgGATCCCC-(BHQ)

(HEX)-CTCGGCTGGCTGCTCTATCaGATCCCC-(BHQ)

BPSL0211/

SNP2

BpsSNP2s

BpsSNP2as

BpsSNP2prC

BpsSNP2prT

CGAGGAATTTGAGAAACGC

GACGGAGGATTCGCATG

(FAM)-CGTCTCGGCACACgGCTTGC-(BHQ)

(HEX)-CGTCTCGGCACACaGCTTGC-(BHQ)

BPSL0504/

SNP3

BpsSNP3s

BpsSNP3as

BpsSNP3prC

BpsSNP3prT

CATCTTCTTCATCGCGCT

TATCTCGCCGATTCGCAC

(HEX)-AATCGCTCGACGCgCGCAGCCGC-(BHQ)

(FAM)-AATCGCTCGACGCaCGCAGCCGC-(BHQ)

BPSL3430/

SNP4

BpsSNP4s

BpsSNP4as

BpsSNP4prC

BpsSNP4prT

ATCAACTGCGAGCCGAGA

CAGTTTCGAGCAGGTGCT

(HEX)-CGTCGTCGGATACAGCcCGTCGTCGT-(BHQ)

(FAM)-CGTCGTCGGATACAGCtCGTCGTCGT-(BHQ)

Примечание. Вариабельные нуклеотиды обозначены строчными буквами.

Note. Variable nucleotides are indicated by lowercase letters.

 

Нуклеотидные последовательности полученных ампликонов определяли методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора «ABI 3130 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, США).

Поиск кандидатных маркерных локусов проводили in silico путем множественного выравнивания и сравнительного анализа фрагментов геномов штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI с помощью модуля MUSCLE программы Unipro UGENE v40.0 [17]. Дизайн олигонуклеотидов осуществляли с использованием программного обеспечения Primer3Plus [22] и «OLIGO v6.71» (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, США).

Кластерный анализ и построение дендрограмм проводили при помощи программ FAMD v1.31 [19] и Mega v11.0.11 [21] с использованием коэффициента генетической дистанции Жаккарда (GDJaccard) и алгоритма объединения ближайших соседей (Neighbor-Joining, NJ). Для оценки вариабельности генетических локусов рассчитывали индекс аллельного полиморфизма (h) [20]. Дискриминирующую способность методов молекулярного типирования определяли на основании расчета индекса Хантера–Гастона (HGDI) [13].

При проведении in silico мультилокусного сиквенс-типирования штаммов B. pseudomallei из GenBank NCBI использовали базу данных PubMLST (https://pubmlst.org/bpseudomallei). Группы изолятов, сиквенс-типы которых являлись одно- и двухлокусными вариантами (single- and double-locus variants, SLV/DLV), объединяли в клональные комплексы (clonal complexes, CC) c помощью алгоритма goeBURST (https://www.phyloviz.net/goeburst).

Результаты

Типирование 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI по схеме MLVA-4 распределило исследованные штаммы по 74 MLVA-типам, 10 из которых включали от двух до трех штаммов и 64 были представлены одним изолятом. По данным MLST среди этих же штаммов обнаружено 57 различных сиквенс-типов, причем 22 из них являлись SLV с образованием 6 клональных комплексов (рис. 1А).

 

Рисунок 1. Сравнительный анализ результатов типирования 85 штаммов B. pseudomallei с помощью схемы MLVA-4 (А) и сочетанного использования схемы MLVA-4, локуса BPSS1974#I и SNP1–4 (Б)

Figure 1. Comparative analysis of t 85 B. pseudomallei strains typing by using the MLVA-4 scheme (A) as well as combined use of the MLVA-4 scheme, the BPSS1974#I locus, and SNP1–4 (B)

Примечание. Штаммы одного клонального комплекса отмечены одинаковыми пиктограммами.

Note. Same clonal complex strains are denoted with similar pictograms.

 

При сопоставлении MLST- и MLVA-профилей определены четыре группы штаммов B. pseudomallei. В первые две группы были распределены штаммы с общими сиквенс-типами и имеющие в пределах каждого ST идентичные MLVA-профили (группа ST/MLVA-I) и близкие MLVA-профили, отличающиеся по одному локусу не более чем на два повтора (группа ST/MLVA-II). Штаммы одного ST, но различающиеся по двум и более VNTR-локусам, были отнесены в группу ST/MLVA-III. Четвертая группа являлась наиболее гетерогенной и включала штаммы, которые в соответствии с их сиквенс-типами объединены в клональные комплексы (ST/MLVA-IV).

В первую группу вошли штаммы с профилем ST975/(4-7-11-2) — MSHR5864 и MSHR6755 (Австралия, 2011 и 2012 гг.); ST126/(3-8-12-9) — MSHR435 и MSHR491 (Австралия, 1996 и 1997 гг.); ST1001/(4-5-3-9) — vgh16R и vgh16W (Тайвань, 2001 г.).

Во вторую группу были включены 11 штаммов, которым соответствовало 4 различных профиля ST/(S389k-S1788k-L933k-L2341k). При этом в трех случаях межштаммовые различия в пределах одного профиля обусловлены вариабельным числом повторов по локусу L933k: ST36/(3-7-8/7-3) — MSHR0305, MSHR520, MSHR3763 и MSHR4083 (Австралия, 1994, 1998 и 2010 гг.); ST553/(6-4-5/3-8) — MSHR5848 и MSHR5855 (Австралия, 2011 г.); ST667/(8-6-6/7-8) — A79A и B03 (Папуа — Новая Гвинея, 2011 г). Штаммы с сиквенс-типом ST617 различались на 1 повтор по локусу S389k и были представлены профилем ST617/(5/6-9-2-6) — MSHR146, MSHR0511 и NAU20B-16 (Австралия, 1992, 1997 и 2007 гг.).

У штаммов группы ST/MLVA-III по результатам VNTR-типирования выявлена вариабельность числа повторов в каждом из четырех локусов. MLVA-профили штаммов 1106a и 1106b (Таиланд, 1993 и 1996 гг.) отличались на три повтора по локусу L2341k и имели генотип ST70/(4-6-13-11/8), а от штамма BPC006 (Китай, 2008 г.) дополнительно по локусу S389k — ST70/(3-6-13-5). Штаммы MSHR5858 (Австралия, 2011 г.) и 350105 (Китай, 1976 г.), принадлежавшие к сиквенс-типу ST562, отличались по трем VNTR-локусам (6/8-8-8/11-10/11). Вариабельность MLVA-генотипов австралийских штаммов MSHR1435 и MSHR1655 (2002 и 2003 гг. соответственно), относящихся к сиквенс-типу ST131, обусловлена локусами S389k и S1788k — (4/0-8/9-5-6).

Группу ST/MLVA-IV составили 36 штаммов B. pseudomallei 22 сиквенс-типов, распределенных по 6 клональным комплексам. В наибольший по численности клональный комплекс (СС92) вошел 21 штамм B. pseudomallei сиквенс-типов ST92, ST95, ST12, ST10, ST518, ST1038, ST297, ST436, ST951 и ST698. В результате MLVA-типирования по 4 вышеназванным VNTR-локусам выявлена принадлежность штаммов СС92 к четырем крупным MLVA-кластерам (A, B, E и J), внутри которых штаммы дифференцировались на группы генотипов. При значении генетической дистанции 0,4 выявлено 11 таких групп — A1, A2, A3, A4, A5, B1, B3, E1, E2, J1 и J3 (рис. 1А).

Анализ результатов MLVA-типирования штаммов клонального комплекса CC92 показал, что сформированные группы в ряде случаев связаны с географическим происхождением штаммов. Так, в группу B1 вошли изолированные от домашних игуан в 2007 и 2013 гг. в Калифорнии штаммы B. pseudomallei 2002734728 и 2013746777 с идентичным VNTR-профилем (6-6-9-2) и отличающиеся от них по локусам S389k и L933k штаммы 2010007509 (Аризона, 2009 г.) и 2011756189 (Швейцария, 2010 г.). При этом штаммы 2010007509 и 2011756189 отличались только по локусу L933k (9-6-8/10-2) и были выделены от больных людей, инфицированных при посещении Коста-Рики и Мартиники соответственно [10, 11]. Принадлежность штаммов B. pseudomallei 2002734728, 2013746777 и 2010007509 к общему сиквенс-типу (ST518) и тот факт, что большинство игуан для торговли США импортируют из Центральной Америки, дают основания предполагать общность происхождения штаммов данной группы.

В группу A1 по результатам MLVA-4 анализа объединены штаммы возбудителя мелиоидоза, выделенные в Венесуэле (B. pseudomallei 2002721171) и от больных людей в США, посещавших Гватемалу (B. pseudomallei 2013746878) и Мексику (B. pseudomallei 2008724734 и 3000015486). При этом штаммы из Венесуэлы и Гватемалы имели идентичный VNTR-профиль (5-5-11-2) и отличались по локусу S389k от штамма B. pseudomallei 3000015486 (4-5-11-2), а от штамма B. pseudomallei 2008724734 дополнительно по локусу L933k (4-5-15-2). Несмотря на близость VNTR-профилей, все штаммы из этой группы принадлежали к разным сиквенс-типам (ST12, ST1038, ST95, ST92).

Все штаммы группы E1 относились к сиквенс-типу ST297. В нее вошли клинический и два почвенных штамма, выделенные в Пуэрто-Рико, а также один штамм от пациента в США, посещавшего Республику Тринидад и Тобаго. Почвенные штаммы B. pseudomallei 2013833055 и 2013833057 имели одинаковый VNTR-профиль (4-10-12-6), который отличался от профилей клинических штаммов по локусам L933k и L2341k: B. pseudomallei 2011756296 (4-10-9-6) и B. pseudomallei 2011756295 (4-10-12-3).

К группе A5 с VNTR-профилем (6/8-5-16/19-2) были отнесены штаммы B. pseudomallei VB976100 (ST436) и 3000015237 (ST951), выделенные соответственно от зеленой игуаны в Праге и от больного человека в США, посещавшего Мексику.

Остальные штаммы клонального комплекса СС92, отнесенные по результатам VNTR-типирования к MLVA-кластерам A, B и E, были представлены на дендрограмме отдельными ветвями (A2, A4) или формировали общие группы со штаммами других сиквенс-типов (A3, B3 и E2). Вместе с тем два других штамма этого клонального комплекса — B. pseudomallei 2002721123 и K96243 — вошли в состав дистанцированного MLVA-кластера J. При этом в группу J3 наряду со штаммом B. pseudomallei K96243 были объединены 7 штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенные в 2015 г. от больных людей в Шри-Ланке, в том числе 5 штаммов клонального комплекса (ST1364-ST594-ST1413). Для штаммов из других 4 клональных комплексов явной взаимосвязи VNTR-профилей с географическим происхождением выявлено не было.

Вариабельность VNTR-профилей у исследованных штаммов B. pseudomallei в ряде случаев была обусловлена не только копийностью мотива в составе минисателлитного локуса, но и INDELL-мутациями в составе коровой единицы. Так, аллельные варианты локусов S389k, L933k и L2341k у выделенных в 2015 г. в Шри-Ланке клинических изолятов обусловлены делециями нуклеотидов. При этом штамм B. pseudomallei BPs112 в результате делеции трех нуклеотидов в коровой единице локуса L933k был отнесен к MLVA-кластеру H, в составе которого сформировал отдельную ветвь с B. pseudomallei 2013746811 (США, 2013 г.).

Анализ аллельного полиморфизма продемонстрировал высокую вариабельность локусов L933k и L2341k, для которых установлено наличие 20 (h = 0,906) и 16 аллелей (h = 0,877) соответственно. Локусы S389k (h = 0,799) и S1788k (h = 0,825) были представлены 10 вариантами каждый. Значение индекса Хантера–Гастона составило 0, 997, что демонстрирует очень высокую разрешающую способность метода.

Полученные данные свидетельствуют о широком диапазоне аллельного разнообразия и высокой скорости мутирования VNTR-локусов, что ограничивает возможность схемы MLVA-4 для определения географических и филогенетических связей изолятов возбудителя мелиоидоза. В связи с этим был проведен поиск более консервативных локусов, включение которых в схему MLVA-4 позволит добиться большей точности в определении степени генетического родства изучаемых штаммов.

В качестве такого VNTR-маркера выбран минисателлит-содержащий регион в составе локуса BPSS1974 штамма B. pseudomallei K96243, аннотированного в базе данных GenBank NCBI как ген коллагеноподобного белка. Обнаруженный регион был обозначен как BPSS1974#I и представлял собой вырожденный 9-нуклеотидный мотив (TCX1GGX2ACX3)n, где Х123 — вариабельные нуклеотидные позиции, n — число повторов. Мутации типа транзиций и трансверсий в положениях Х1, Х2 и Х3 мотива соответствовали третьим позициям кодонов, кодирующих пептид (Ser-Gly-Thr)n и не приводили к замене аминокислот (dN/dS = 0), что свидетельствует о действии стабилизирующего отбора. У проанализированных 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI в соответствии с копийностью мотива в составе локуса BPSS1974#I выявлено 20 аллельных вариантов (h = 0,8).

В качестве кандидатных SNP-маркеров выбраны последовательности генов лауроилацилтрансферазы биосинтеза липида-А [Gene ID: 3093529 (BPSL0211)] — обозначены нами как SNP1 и SNP2; сигма-фактора RpoH РНК-полимеразы [Gene ID: 3094670 (BPSL0504)] — обозначен как SNP3; глутаминамидотрансферазы [Gene ID: 3091795 (BPSL3430)] — обозначен как SNP4 (табл. 2). Типирование этой же выборки штаммов с использованием предлагаемого набора однонуклеотидных полиморфизмов выявило 13 SNP-паттернов.

Сравнение генетических профилей по локусам BPSS1974#I и SNP1–4 показало их идентичность у всех штаммов, принадлежащих одному сиквенс-типу и имеющих общий регион выделения. Штаммы из одного клонального комплекса обладали по предлагаемым локусам идентичными или близкими профилями. Так, на основании полученных паттернов штаммы B. pseudomallei 1710a и 1710b (Таиланд, 1996 г. и 1999 г.) и B. pseudomallei Pasteur 52237 (Вьетнам, 1964 г) клонального комплекса ST177-ST411, отличающиеся по схеме MLVA-4 по трем VNTR-локусам, отнесены к одному генотипу. Штаммы клонального комплекса ST1364-ST594-ST1413, изолированные от больных людей на Шри-Ланке, также обладали идентичными профилями по локусам BPSS1974#I и SNP1–4 за исключением B. pseudomallei BPs115, который отличался по локусу SNP3.

У штаммов клонального комплекса CC92 установлено шесть аллельных вариантов по локусу BPSS1974#I и два SNP профиля, различающиеся по локусу SNP1 — (G/A-G-A-T). При этом SNP-профиль (A-G-A-T) был обнаружен только у почвенных и клинических штаммов, выделенных в Пуэрто-Рико (B. pseudomallei 2013833055, 2013833057, 2011756296 и 2002721100), а также от посещавших соседние острова туристов (B. pseudomallei 2011756295 и 2011756189). Аллельный вариант локуса BPSS1974#I с числом повторов 52 выявлен среди штаммов CC92 только у B. pseudomallei 2013746878, 2002721171 и VB976100, что наряду с идентичным SNP-профилем (G-G-A-T) позволило выделить их в отдельную группу.

Интересно, что штаммы B. pseudomallei 1106a, 1106b (Таиланд) и BPC006 (Китай) группы ST/MLVA-III, принадлежащие к ST70, имели в локусе BPSS1974#I 61 повтор, но отличались по локусам SNP1 и SNP2 в зависимости от региона выделения: для штаммов из Таиланда установлен SNP-профиль (G-G-A-T), а из Китая — (A-A-A-T). Необходимо отметить, что SNP-профиль (A-A-A-T) обнаружен всего у трех штаммов исследованной выборки, выделенных в соседних Китае у B. pseudomallei BPC006 (ST70) и 350105 (ST562) и Пакистане — B. pseudomallei 9 (ST72), причем ST562 и ST72 представляли собой двухлокусные варианты друг друга, тогда как ST70 отличался по всем аллелям.

Дополненная локусами BPSS1974#I и SNP1–4 схема MLVA-4, обозначенная как MBS (MLVA-4, BPSS1974#I, SNP1–4), позволила более точно разделить штаммы B. pseudomallei в соответствии с регионом их происхождения (рис. 1Б). Так, штаммы клонального комплекса CC92 были распределены по четырем отдельным кластерам с определенной географической приуроченностью. Наиболее крупные из них — MBS1 и MBS5 — объединяли штаммы из стран Центральной Америки, Мексики, Венесуэлы и островов Карибского бассейна, завезенные в США и Европу. Кластер MBS11 включал штаммы из Пуэрто-Рико и Республики Тринидад и Тобаго. В самостоятельную ветвь внутри кластера MBS8 выделены штаммы B. pseudomallei 2002721123 (Пуэрто-Рико, 1998 г.) и K96243 (Таиланд, 1999 г.).

Штаммы из MLVA-кластера F по схеме MBS разделились на три разные группы, коррелирующие с их географическим происхождением и сиквенс-типами. Так, в отдельную группу выделены тайские штаммы B. pseudomallei 406e и HBPUB10134a, сиквенс-типы которых являлись двухлокусными вариантами. Штаммы 1710a, 1710b и Pasteur 52237 клонального комплекса ST177-ST411, изолированные в Таиланде и Вьетнаме, кластеризовались вместе с малазийским штаммом B. pseudomallei 982. При этом обе группы вошли в состав кластера MBS15, в то время как третья группа штаммов из Австралии (B. pseudomallei NCTC_13178 и MSHR7929) и Папуа — Новой Гвинеи (B. pseudomallei K42) сформировали отдельный кластер MBS10.

Применение схемы MBS позволило выделить штаммы из Австралии в три отдельных кластера — MBS6, MBS7 и MBS12, в каждом из которых штаммы имели идентичные SNP-профили, но отличались по VNTR-локусам. Исключение составил лишь клинический штамм B. pseudomallei MSHR1153, отличающийся от доминирующего генотипа кластера MBS7 по локусу SNP2. У трех штаммов кластера MBS6 (B. pseudomallei MSHR3965, MSHR5864 и MSHR6755) в локусе BPSS1974#I идентифицировано одинаковое число повторов, что позволило выделить их в отдельную группу этого кластера.

Разработанная схема типирования была экспериментально апробирована на коллекционных штаммах B. pseudomallei различного географического происхождения (табл. 1).

На основании комплексного анализа VNTR- и SNP-локусов, входящих в состав предлагаемой схемы MBS, проведено типирование 105 штаммов возбудителя мелиоидоза, включая 20 коллекционных (рис. 2). При этом характер кластеризации 85 штаммов B. pseudomallei из базы данных GenBank NCBI сохранялся, что свидетельствует о применимости разработанного методического подхода для филогенетического анализа при проведении эпидемиологического расследования случаев заболевания.

 

Рисунок 2. Дендрограмма, построенная с помощью алгоритма Neighbor-Joining, по результатам типирования 105 штаммов B. pseudomallei с использованием данных комплексного анализа на основе молекулярных маркеров 5 VNTR- и 4 SNP-локусов

Figure 2. Dendrogram constructed by using the Neighbor-Joining algorithm based on the results of 105 B. pseudomallei strains typing with complex analysis data using molecular markers of 5 VNTR and 4 SNP loci

Примечание. Штаммы одного клонального комплекса отмечены одинаковыми пиктограммами. Рамками обозначены штаммы из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Note. Same clonal complex strains are denoted with similar pictograms. The strains from the collection of the Volgograd Plague Control Research Institute are depicted in boxes.

 

Обсуждение

Молекулярное типирование возбудителя мелиоидоза осуществляется с применением ряда методов, заключающихся в анализе отдельных генетических локусов, их комплексов или определении полной последовательности геномов. Вместе с тем использование отдельных подходов или их сочетания требует осторожности, поскольку установленная для B. pseudomallei высокая частота гомологичной рекомбинации между штаммами может не отражать эволюционную историю отдельных генов [5, 16].

Сочетание филогенетической информативности однонуклеотидных полиморфизмов и дискриминирующей способности метода MLVA позволило разработать схему из 4 SNP- и 5 VNTR-локусов, обозначенную как MBS. Предложенная схема в большинстве случаев обеспечивает группирование штаммов возбудителя мелиоидоза в зависимости от общности их географического происхождения. Показательно, что штаммы B. pseudomallei из стран Западного полушария сформировали три группы, конкретизирующие регион их происхождения: в одну группу вошли штаммы из Пуэрто-Рико и Республики Тринидад и Тобаго, а две другие были представлены завозными случаями преимущественно из Мексики, Центральной Америки и островов Карибского бассейна. Подобное распределение штаммов B. pseudomallei показано в работе J.E. Gee и соавт. [10] на основании анализа SNP-полиморфизмов всего генома. Примечательно, что как на уровне полного генома, так и по 9 локусам предложенной схемы MBS, штамммы из Мексики обладают большим генетическим разнообразием в сравнении с пуэрториканскими.

В нашем исследовании штаммы B. pseudomallei 2002721171 (ST12) и 2013746878 (ST1038), выделенные соответственно в Венесуэле и от посещавшего Гватемалу пациента из США, кластеризовались вместе со штаммом VB976100 (ST436) неизвестного происхождения, изолированного в Праге из абсцесса зеленой игуаны [8]. Ранее сиквенс-тип ST436 был идентифицирован только у двух штаммов из Центральной Америки (Гватемалы и Перу). В соответствии со схемой MBS B. pseudomallei 2013746878 и 2002721171 имели идентичный генотип и отличались от B. pseudomallei VB976100 только по локусам S389k и L933k, что свидетельствовало в пользу центральноамериканского происхождения штамма VB976100.

Связь образованных групп с географическим происхождением штаммов дает основание рассматривать схему MBS в качестве полезного инструмента при расследовании случаев мелиоидоза у пациентов с неясной историей путешествий в эндемичные страны. Так, штаммы B. pseudomallei 2008724758, PB08298010 и 2013746811 выделены от больных, никогда не выезжавших за пределы континентальной части США [7, 9, 18], тем не менее проведенное типирование показало происхождение этих штаммов за пределами Западного полушария [10].

Существенный интерес представляет перспективность использования схемы MBS для оценки генетического разнообразия B. pseudomallei на эндемичных территориях. Так, результаты проведенного нами генотипирования штаммов, выделенных во время вспышки мелиоидоза в восточной части Шри-Ланки в 2015 г., полностью соответствовали результатам полногеномного анализа H.S. Jayasinghearachchi и соавт. [14].

Одной из проблем при проведении генотипирования является скрытый полиморфизм, обусловленный отсутствием продукта амплификации. Так, в ходе исследования выявлено отсутствие VNTR-локуса S389k у B. pseudomallei MSHR1655 (ST131), изолированного от больного в Австралии, который по схеме MLVA-4 кластеризовался с австралийскими штаммами ST617, выделенными из объектов окружающей среды. Вместе с тем при сравнении аллельных профилей по трем остальным локусам схемы MLVA-4 установлено, что VNTR-профиль MSHR1655 отличался на три повтора по локусу L933k от штаммов ST617, а от почвенного изолята MSHR1435 того же ST131, выделенного в Австралии годом ранее — на один повтор по локусу S1788k. Включение в схему MLVA-4 дополнительных молекулярных маркеров позволило выделить штаммы MSHR1655 и MSHR1435 в отдельную кластерную группу на основе идентичности их профилей по локусам BPSS1974#I и SNP1–4.

Таким образом, предложен комплексный подход для типирования B. pseudomallei, позволяющий на основании MLVA-профилей осуществлять дифференциацию штаммов B. pseudomallei внутри SNP-групп, что может рассматриваться как эффективный способ для установления филогеографических взаимосвязей штаммов. Разработанный методический подход к генетическому типированию B. pseudomallei, основанный на сочетанном анализе SNP- и MLVA- маркеров, позволяет дифференцировать штаммы в соответствии с географическими регионами их происхождения и устанавливать клональность случаев мелиоидоза.

×

About the authors

Margarita L. Ledenyova

Volgograd Plague Control Research Institute

Email: volresin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5923-4774

Scientific Researcher of the Laboratory of Gene Diagnostics

Russian Federation, 400131, Volgograd, Golubinskaya str., 7

Galina A. Tkachenko

Volgograd Plague Control Research Institute

Email: tkachenko_g@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0199-3342

PhD (Medicine), Associate Professor, Leading Researcher of the Laboratory of Gene Diagnostics

Russian Federation, 400131, Volgograd, Golubinskaya str., 7

Irina B. Zakharova

Volgograd Plague Control Research Institute

Author for correspondence.
Email: zib279@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7808-7658

PhD (Biology), Associate Professor, Leading Researcher of the Laboratory of Pathogenic Burkholderia

Russian Federation, 400131, Volgograd, Golubinskaya str., 7

References

  1. Онищенко Г.Г., Топорков А.В., Липницкий А.В., Викторов Д.В. Проблемы противодействия биологическому терроризму на современном этапе // Инфекционные болезни: Новости. Мнения. Обучение. 2016. Т. 1, № 14. С. 24–31. [Onishchenko G.G., Toporkov A.V., Lipnitsky A.V., Viktorov D.V. Problems of counteraction to biological terrorism at the present stage. Infektsionnye bolezni: Novosti. Mneniya. Obuchenie = Infectious Diseases: News. Opinions. Training, 2016, vol. 1, no. 14, pp. 24–31. (In Russ.)]
  2. Патент № 2545702 Российская Федерация, МПК C12Q 1/68 (2006.01). Олигонуклеотидные праймеры Burk0090s/Burk0090as для оценки адаптационной изменчивости генома патогенных буркхольдерий: № 2013135429/10; заявлено 2013.07.26: опубликовано 10.04.2015. Бюл. № 10 / Савченко С.С., Ткаченко Г.А., Бондарева О.С., Шпак И.М., Леденева М.Л., Антонов В.А. Патентообладатель: Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 7 с. [Patent No. 2545702 Russian Federation, Int. Cl. C12Q 1/68 (2006.01). Oligonucleotide primers Burk0090s/Burk0090as for assessment of adaptive variability of genome of pathogenic burkholderia. No. 2013135429/10; application: 2013.07.26: date of publication 10.04.2015 / Savchenko S.S., Tkachenko G.A., Bondareva O.S., Shpak I.M., Ledeneva M.L., Antonov V.A. Proprietors: FSHE Volgograd Anti-Plague Institute of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare. 7 p.]
  3. Aziz A., Sarovich D.S., Harris T.M., Kaestli M., McRobb E., Mayo M., Currie B.J., Price E.P. Suspected cases of intracontinental Burkholderia pseudomallei sequence type homoplasy resolved using whole-genome sequencing. Microb. Genom., 2017, vol. 3, no. 11: e000139. doi: 10.1099/mgen.0.000139
  4. Baker A., Pearson T., Price E.P., Dale J., Keim P., Hornstra H., Greenhill A., Padilla G., Warner J. Molecular phylogeny of Burkholderia pseudomallei from a remote region of Papua New Guinea. PLoS One, 2011, vol. 6, no. 3: e18343 doi: 10.1371/journal.pone.0018343
  5. Challacombe J.F., Stubben C.J., Klimko C.P., Welkos S.L., Kern S.J., Bozue J.A., Worsham P.L., Cote C.K., Wolfe D.N. Interrogation of the Burkholderia pseudomallei genome to address differential virulence among isolates. PLoS One, 2014, vol. 9, no. 12: e115951. doi: 10.1371/journal.pone.0115951
  6. Currie B.J., Haslem A., Pearson T., Hornstra H., Leadem B., Mayo M., Gal D., Ward L., Godoy D., Spratt B.G., Keim P. Identification of melioidosis outbreak by multilocus variable number tandem repeat analysis. Emerg. Infect. Dis., 2009, vol. 15, no. 2, pp. 169–174. doi: 10.3201/eid1502.081036
  7. Doker T.J., Quinn C.L., Salehi E.D., Sherwood J.J., Benoit T.J., Glass Elrod M., Gee J.E., Shadomy S.V., Bower W.A., Hoffmaster A.R., Walke H.T., Blaney D.D., DiOrio M.S., Melioidosis Investigation Team. Fatal Burkholderia pseudomallei infection initially reported as a Bacillus species, Ohio, 2013. Am. J. Trop. Med. Hyg., 2014, vol. 91, no. 4, pp. 743–746. doi: 10.4269/ajtmh.14-0172
  8. Elschner M.C., Hnizdo J., Stamm I., El-Adawy H., Mertens K., Melzer F. Isolation of the highly pathogenic and zoonotic agent Burkholderia pseudomallei from a pet green Iguana in Prague, Czech Republic. BMC Vet. Res., 2014, vol. 10: 283. doi: 10.1186/s12917-014-0283-7
  9. Engelthaler D.M., Bowers J., Schupp J.A., Pearson T., Ginther J., Hornstra H.M., Dale J., Stewart T., Sunenshine R., Waddell V., Levy C., Gillece J., Price L.B., Contente T., Beckstrom-Sternberg S.M., Blaney D.D., Wagner D.M., Mayo M., Currie B.J., Keim P., Tuanyok A. Molecular investigations of a locally acquired case of melioidosis in Southern A.Z., USA. PLoS Negl. Trop. Dis., 2011, vol. 5, no. 10: e1347. doi: 10.1371/journal.pntd.0001347
  10. Gee J.E., Gulvik C.A., Elrod M.G., Batra D., Rowe L.A., Sheth M., Hoffmaster A.R. Phylogeography of Burkholderia pseudomallei isolates, Western Hemisphere. Emerg. Infect. Dis., 2017, vol. 23, no. 7, pp. 1133–1138. doi: 10.3201/eid2307.161978
  11. Gétaz L., Abbas M., Loutan L., Schrenzel J., Iten A., Simon F., Decosterd A., Studer R., Sudre P., Michel Y., Merlani P., Emonet S. Fatal acute melioidosis in a tourist returning from Martinique Island, November 2010. Euro Surveill., 2011, vol. 16, no. 1: 19758.
  12. Gilad J., Harary I., Dushnitsky T., Schwartz D., Amsalem Y. Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei as bioterrorism agents: national aspects of emergency preparedness. Isr. Med. Assoc. J., 2007, vol. 9, no. 7, pp. 499–503.
  13. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity. J. Clin. Microbiol., 1988, vol. 26, no. 11, pp. 2465–2466. doi: 10.1128/jcm.26.11.2465-2466.1988
  14. Jayasinghearachchi H.S., Francis V.R., Sathkumara H.D., Krishnananthasivam S., Masakorala J., Muthugama T., De Silva A.D., Corea E.M. Nonclonal Burkholderia pseudomallei population in melioidosis case cluster, Sri Lanka. Emerg. Infect. Dis., 2021, vol. 27, no. 11, pp. 2955–2957. doi: 10.3201/eid2711.210219
  15. Limmathurotsakul D., Golding N., Dance D.A., Messina J.P., Pigott D.M., Moyes C.L., Rolim D.B., Bertherat E., Day N.P., Peacock S.J., Hay S.I. Predicted global distribution of Burkholderia pseudomallei and burden of melioidosis. Nat. Microbiol., 2016, vol. 1: 15008. doi: 10.1038/nmicrobiol.2015.8
  16. Nandi T., Ong C., Singh A.P., Boddey J., Atkins T., Sarkar-Tyson M., Essex-Lopresti A.E., Chua H.H., Pearson T., Kreisberg J.F., Nilsson C., Ariyaratne P., Ronning C., Losada L., Ruan Y., Sung W.K., Woods D., Titball R.W., Beacham I., Peak I., Keim P., Nierman W.C., Tan P. A genomic survey of positive selection in Burkholderia pseudomallei provides insights into the evolution of accidental virulence. PLoS Pathog., 2010, vol. 6, no. 4: e1000845. doi: 10.1371/journal.ppat.1000845
  17. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics, 2012, vol. 28, no. 8, pp. 1166–1167. doi: 10.1093/bioinformatics/bts091
  18. Sarovich D.S., Garin B., De Smet B., Kaestli M., Mayo M., Vandamme P., Jacobs J., Lompo P., Tahita M.C., Tinto H., Djaomalaza I., Currie B.J., Price E.P. Phylogenomic analysis reveals an Asian origin for African Burkholderia pseudomallei and further supports melioidosis endemicity in Africa. mSphere, 2016, vol. 1, no. 2: e00089-15. doi: 10.1128/mSphere.00089-15
  19. Schluter P.M., Harris S.A. Analysis of multilocus fingerprinting data sets containing missing data. Molecular. Ecology. Notes, 2006, vol. 6, no. 2, pp. 569–572.
  20. Selander R.K., Caugant D.A., Ochman H., Musser J.M., Gilmour M.N., Whittam T.S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics. Appl. Environ. Microbiol., 1986, vol. 51, no. 5, pp. 873–884. doi: 10.1128/aem.51.5.873-884.1986
  21. Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Mol. Biol. Evol., 2021, vol. 38, no. 7, pp. 3022–3027. doi: 10.1093/molbev/msab120
  22. Untergasser A., Nijveen H., Rao X., Bisseling T., Geurts R., Leunissen J.A. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Res., 2007, vol. 35 (Web Server issue): W71–74. doi: 10.1093/nar/gkm306
  23. U’Ren J.M., Schupp J.M., Pearson T., Hornstra H., Friedman C.L., Smith K.L., Daugherty R.R., Rhoton S.D., Leadem B., Georgia S., Cardon M., Huynh L.Y., DeShazer D., Harvey S.P., Robison R., Gal D., Mayo M.J., Wagner D., Currie B.J., Keim P. Tandem repeat regions within the Burkholderia pseudomallei genome and their application for high resolution genotyping. BMC Microbiol., 2007, vol. 7: 23. doi: 10.1186/1471-2180-7-23
  24. Wiersinga W.J., Currie B.J., Peacock S.J. Melioidosis. N. Engl. J. Med., 2012, vol. 367, no. 11, pp. 1035–1044. doi: 10.1056/NEJMra1204699
  25. Zhu X., Chen H., Li S., Wang L.C., Wu D.R., Wang X.M., Chen R.S., Li Z.J., Liu Z.G. Molecular characteristics of Burkholderia pseudomallei collected from humans in Hainan, China. Front. Microbiol., 2020, vol. 11: 778. doi: 10.3389/fmicb.2020.00778

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. Figure 1. Comparative analysis of t 85 B. pseudomallei strains typing by using the MLVA-4 scheme (A) as well as combined use of the MLVA-4 scheme, the BPSS1974#I locus, and SNP1–4 (B)

Download (697KB)
2. Figure 2. Dendrogram constructed by using the Neighbor-Joining algorithm based on the results of 105 B. pseudomallei strains typing with complex analysis data using molecular markers of 5 VNTR and 4 SNP loci

Download (758KB)

Copyright (c) 2022 Ledenyova M.L., Tkachenko G.A., Zakharova I.B.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies