Ecological scenario of the plague microbe Yersinia pestis speciation underlying adequate molecular evolutionary model

Full Text

Введение

Возбудитель чумы — микроб Yersinia pestis — был открыт Александром Йерсеном в Гонконге в 1894 г. в начале 3-й пандемии. С этого момента началось глубокое всестороннее изучение возбудителя и вызываемой им болезни. Еще на начальных этапах исследований было высказано предположение о происхождении чумного микроба от псевдотуберкулезного: возбудители этих болезней имеют некоторые сходные морфологические признаки и биохимические свойства. На рубеже нового тысячелетия в инфектологии стали широко применять молекулярно-генетические (МГ) методы исследований, которые возвели диагностику возбудителя чумы до высокой степени совершенства. К настоящему времени определены структуры геномов популяций чумного микроба из большинства природных очагов мира [16]. Обнаружены и описаны фрагменты «археологической» ДНК, извлеченной из останков (зубы, кости) человеческих жертв былых пандемий [26, 27, 35]. Полученные МГ-данные позволили в общих чертах представить молекулярную эволюционную модель микроба Y. pestis и на ее основе предложить молекулярную версию истории возникновения, высказать предположения о хронологии, географии и исторической динамике мирового распространения возбудителя чумы, иными словами, реконструировать его филогению [16, 17, 24]. Однако все предложенные МГ-филогении видятся крайне противоречивыми, не поддерживаются фактами, представленными классическими естественнонаучными направлениями: экологией, эпизоотологией, биогеографией, палеонтологией и другими, и не соответствуют положениям современного эволюционного учения (синтетической теории эволюции). Возникла парадоксальная ситуация. С одной стороны, МГ-методология филогенетических реконструкций возбудителя чумы хорошо разработана, созданы и адаптированы алгоритмы и многочисленные компьютерные программы для анализа молекулярных признаков, имеется продвинутая технологическая база молекулярных исследований, молекулярные технологии стали мэйнстримными в филогенетике Y. pestis. С другой стороны, за прошедшие почти четверть века интенсивных МГ-исследований силами многих специализированных лабораторий в развитых странах мира так и не удалось создать доверительный сценарий происхождения и мировой экспансии этого патогена. На тривиальные вопросы, где, когда, каким образом и при каких обстоятельствах возникла чума и как распространялась в мире, МГ-подход удовлетворительного ответа дать не в состоянии. Насколько впечатляющими являются достижения МГ-подхода в диагностике возбудителя, выявлении его генетического и молекулярного разнообразия, настолько удручающими выглядят озвученные закономерности молекулярной эволюции. Выявленное внутривидовое МГ-разнообразие Y. pestis пока не удается ранжировать в доверительные эволюционные линии. Как правило, работы по филогенетике чумного микроба завершаются демонстрацией филогенетических дендрограмм, показывающих молекулярно-статистические взаимоотношения геновариантов (подвидов, географических популяций), и эти отношения не привязаны к природным и/или историческим событиям. К примеру, все молекулярные филогенетические дендрограммы фиксируют наличие политомии (узел N07, «Big Bang»), которая возникла в Азии, якобы накануне 2-й пандемии («Черная смерть», 1346 г.). Но причин возникновения этого совершенно не тривиального природного события — недавнего в эволюционном масштабе времени почти одновременного, взрывного возникновения основных генеалогических ветвей Y. pestis (branchs 1–4) — МГ-подход не называет и даже не предполагает (рис. 1, II обложка).

Рисунок 1. Типичная молекулярная филогенетическая дендрограмма Yersinia pestis, созданная на основе анализа молекулярных SNP-маркеров [16]

Figure 1. A typical molecular phylogenetic dendrogram of Yersinia pestis based on the molecular SNP marker analysis [16]

Примечание. MRCA (most recent common ancestor) — абстрактный наиболее современный статистически обоснованный предок вида Y. pestis. N07 — узел политомии (branches 1–4), возникший перед началом 2-й пандемии чумы («Черная смерть»). Овалом выделены «полевковые» геноварианты 0.PE (подвиды) возбудителя чумы, образовавшие зону наиболее древних природных очагов в Евразии.

Note. MRCA (most recent common ancestor) is a putative most recent statistically justified ancestor of the species Y. pestis. N07 is a polytomy node (branches 1–4) that arose before the onset of the second plague pandemic (the “Black Death”). The oval highlights the “vole” genovariantes 0.PE (subspecies) of the plague causative agent, which formed the zone of most ancient natural foci in Eurasia.

Явным несоответствием МГ-выводов классическим положениям эпизоотологии видится прокламируемая МГ-подходом двухволновая экспансия возбудителя чумы из района видо- формообразования в Азии [10]. Полагают, что сначала возникли «полевковые» (Microtinae) природные очаги в Азии — или на Кавказе [24], или на Цинхайском плато (Восточный Тибет) [16], которые очень быстро, в течение сотен или нескольких тысяч лет, широко распространились на гигантской по площади территории в Евразии — от Маньчжурии и восточного Тибета на востоке до Предкавказья и Ближнего Востока на западе и от Забайкалья и северного Прикаспия на севере до Гималаев на юге — образовав зону первичных природных «полевковых» очагов (рис. 1, II обложка). Полагают, что возбудитель в этих очагах был слабовирулентным или авирулентным для сусликов, сурков, песчанок и человека, не имел полноценного набора факторов вирулентности. Затем через тысячи лет существования некоторый слабовирулентный «полевковый» подвид (возможно Y. pestis ssp. ulegeica, 0.PE5, циркулирующий в популяциях монгольской пищухи на Алтае, цит. по [17]) при неизвестных обстоятельствах «мигрировал» из Монголии на Тянь-Шань в популяции алтайского сурка (Marmota baibacina), приобрел свойство высокой вирулентности и второй волной распространился в пределах «полевковых» очагов, также проник на Индостан и Ближний Восток. Так, согласно МГ-подходу, в два этапа возникли существующие ныне симпатричные, семисимпатричные (смежные) и аллопатричные природные очаги Евразии со слабо- и высокопатогенными возбудителями. Эта молекулярная схема двух волн азиатской экспансии природных очагов чумы не поддается эпизоотологической и биогеографической логике: в природе чума распространяется последовательно по принципу «масляного пятна» при внутри- и межпопуляционных и внутри- и межвидовых паразитарных контактах через укусы блох-переносчиков; один вид Y. pestis не может формировать один и тот же первичный природный ареал дважды, в противном случае такое уникальное явление должно иметь доверительное объяснение [10].

Другим казусным примером может служить обоснование монофилии вновь предложенного подвида Y. pestis central-asiatica только сходством молекулярных маркеров [20]. Этот подвид включает якобы близкородственные биовары hissarica (0.PE4h), talassica (0.PE4t), altaica (0.PE4a) и microtus (0.PE4m), циркулирующие в разделенных огромными расстояниями природных очагах чумы на Гиссаре, Таласе, в Горном Алтае и на Хэнтэе и во Внутренней Монголии (Китай). На основании сходства SNP-маркеров полагают, что перечисленные биовары образуют голофилетическую группу (то есть реальный подвид). При этом известно, что основными хозяевами инфекции в этих разрозненных, широко разбросанных на азиатских пространствах очагах являются млекопитающие, относящиеся к разным видам, родам, даже к разным отрядам (Rodentia и Lagomorpha). С экологических и биогеографических позиций утверждение близкого родства выше перечисленных биоваров и их монофилетическое (голофилетическое) происхождение только по сходству нуклеотидных SNP-маркеров представляются логическим нонсенсом.

Корректность результатов любого филогенетического анализа зависит от выбора адекватной эволюционной модели, наиболее точно описывающей исследуемые объекты. Судя по очевидным в МГ-филогенетических схемах противоречиям, применяемые для реконструкции филогенеза микроба чумы эволюционные модели не срабатывают. Напрашивается вопрос: почему? Ответ, по нашему представлению, следует искать в эволюционной уникальности чумного микроба. Этот патоген занимает уникальное систематическое положение. По молекулярно-генетическим признакам он относится к семейству возбудителей кишечных инфекций Enterobacteriaceae и к роду Yersinia. В то же время по экологическим (этиологическим, клиническим) свойствам он является возбудителем системной («кровяной») инфекции. То есть этот патоген занимает отличную от кишечных бактерий экологическую нишу и адаптивную зону. Микроб чумы — единственный среди кишечных возбудителей семейства Enterobacteriaceae, насчитывающего более 250 видов [22], который передается трансмиссивным (не пищевым!) способом. Уникальность положения чумного микроба в семействе кишечных микроорганизмов предписывает разработку для него ad hoc молекулярной эволюционной модели. Такая модель может быть создана на основе экологических знаний о жизненных циклах микроба чумы и его предковой формы — псевдотуберкулезного микроба.

Внедрение МГ-методологий в исследования возбудителей чумы и псевдотуберкулеза в последние два десятка лет привело к двум краеугольным открытиям, позволившим пересмотреть положения классической теории природной очаговости чумы и приблизившим решение проблемы происхождения и мировой экспансии этой инфекции. В предлагаемом обзоре описаны некоторые параметры экологической модели (сценария) видообразования и мировой экспансии возбудителя чумы и приведено сравнение ее параметров с параметрами молекулярной модели. Сравнительный анализ двух моделей позволит наметить пути создания адекватной молекулярной модели.

Прямой предок возбудителя чумы

Генетическими исследованиями О-антигена чумного и псевдотуберкулезного микробов было установлено, что прямым предком возбудителя чумы является возбудитель псевдотуберкулеза 1-го серотипа Y. pseudotuberculosis 0:1b, вызывающий дальневосточную скарлатиноподобную лихорадку (ДСЛ) — кишечную инфекцию, широко распространенную в холодных районах Северной и Центральной Азии и Дальнего Востока [8, 18, 19, 29]. Таким образом, был надежно определен корень филогенетического дерева Y. pestis, что c учетом экологической фактологии сделало избыточным в филогенетической методологии сложный молекулярно-статистический поиск абстрактной анцестральной формы чумного микроба MRCA. Это открытие инициировало дедуктивную переоценку известных экологических фактов, на которых выстраивались гипотезы о филогенезе возбудителя в классической версии теории природной очаговости чумы. Возник вопрос: каким образом и при каких уникальных обстоятельствах произошел эволюционный переход возбудителя ДСЛ из пищеварительного тракта в принципиально иную среду обитания — кровь теплокровных хозяев-грызунов?

Ответ на этот вопрос был получен экологическими исследованиями природных очагов в Центральной Азии [11, 34]. Было показано, что вид Y. pestis сформировался из клона (популяции) возбудителя ДСЛ в популяциях монгольского сурка-тарбагана (Marmota sibirica) и паразитирующей на нем блохи Oropsylla silantiewi. Видообразовательный процесс проходил в популяциях монгольского сурка, находящегося в состоянии зимней спячки. В течение спячки сурки в зимовочном гнезде регулярно просыпаются. С октября по апрель состояние глубокого сна (торпора) до 15–20 раз сменяется состоянием бодрствования (эутермии). Во время торпора температура тела зимоспящих грызунов (сурков, сусликов, бурундуков) составляет 2–10°С, и иммунные процессы подавлены. Во время эутермии температура тела возвращается к норме, около 37°С, и активность иммунных ответов нормализуется [14, 25]. Выход из торпорного состояния у сурков проходит достаточно быстро, в течение 3–6 часов. То есть в течение этих нескольких часов возбудители инфекций, оказавшиеся в крови сурков, подвергаются колоссальному температурно-иммунному стрессу. Но как кишечный возбудитель ДСЛ оказался в крови спящих монгольских сурков в зимний период, когда сурки не питаются? Однозначный ответ на этот вопрос дают экологические наблюдения [11, 34].

Сурки зимуют семьями, включающими до 20 и более зверьков. Перед залеганием в спячку входы зимовочной норы, кроме одного, засыпают снаружи растительной ветошью, мелкоземом, щебнем и камнями. Последний лаз закрывают «пробкой» изнутри. Монгольский сурок обитает в Центральной Азии — аридном районе, где выпадает мало осадков и почва сухая. «Пробка», изготовленная из сухих сыпучих материалов непрочная, может быть легко раскопана хищниками — степным хорьком и корсаком. В связи с этим у монгольского сурка выработано специфичное защитное поведение — использование для изготовления пробки собственной метаболической воды. Накануне ухода в спячку сурки в отнорках-уборных накапливают строительный материал и экскременты, которые используются в качестве цементирующего состава сухой сыпучей строительной смеси. В процессе устройства пробки камни, обвалянные в экскрементах, сурки из отнорков-уборных перемещают в зубах. Таким необычным способом с фекалиями возбудитель ДСЛ в массе попадает в ротовую полость готовящихся к спячке сурков. При этом сурки перед спячкой не питаются, возбудитель ДСЛ не проникает в тонкий кишечник и популяция сурков не инфицируется ДСЛ. Описанное видоспецифическое норостроительное поведение монгольского сурка сложилось в течение второй половины кайнозоя как поведенческая адаптация к обитанию в аридных условиях Центральной Азии. Но как кишечный возбудитель ДСЛ из ротовой полости сурков эволюционным путем проник в лимфо-миелоидный комплекс животных, преодолев барьер между пищеварительной и кровеносной (лимфо-миелоидной) системами теплокровного хозяина, и преобразовался в нового патогена?

Эволюционная молодость возбудителя чумы

Согласно классической версии теории природной очаговости чумы ее возбудитель сформировался в процессе коэволюции сочленов эпизоотической триады «грызун–блоха–возбудитель» в отдаленные геологические эпохи, олигоцене–плиоцене, от 30 до 5 млн лет назад [5, 7]. Полагали, что видообразование могло пройти либо в популяциях песчанок (Gerbillinae) в Старом Свете, вероятно в Евразии, либо в Новом Свете в популяциях сурков (Marmotini). Межконтинентальное распространение возбудителя могло проходить при миграциях и расселении норовых грызунов по межконтинентальным сухопутным мостам, периодически возникавшим в геологическое время. Но современные исследования, проведенные на основе молекулярной методологии, надежно показали, что микроб чумы является эволюционно молодым патогеном. Время его появления на Земле как вида Y. pestis оценивается в диапазоне от 1500 до 20 000 лет назад [12, 13] или не ранее 30 000 лет назад [21].

Согласно экологическому подходу, индуктором видообразования стал известный физико-климатический фактор — наступление в финале плейстоцена 22–15 тыс. лет назад максимального (сартанского) похолодания в Северной и Центральной Азии и на Дальнем Востоке [11, 34]. В Центральной Азии грунт стал промерзать на глубину более 3 м [23]. Глубокое промерзание грунта вызвало изменение поведения личинок сурковой блохи: в силу положительного термотаксиса в холодные месяцы года блошиные личинки стали перемещаться из промерзающей гнездовой выстилки зимовочных нор монгольского сурка, располагающиеся на глубине 2–2,5 м, на более теплые тела спящих животных (5...37°С). Этот феномен сохранился до настоящего времени и может быть изучен актуалистическими методами. Личинки со стохастической закономерностью проникают в ротовую полость спящих животных, создают на слизистой скарификации и питаются кровью [9]. Раны на слизистой стали входными воротами для инфекции ДСЛ, то есть заражение популяции монгольского сурка в зимний период проходило уникальным травматическим (не традиционным пищевым!) способом (помним, что в зимне-весенние месяцы в ротовой полости спящих сурков вместе с личинками блох присутствуют экскременты и, соответственно, возбудитель ДСЛ). Уникальный способ заражения привел к формированию уникального возбудителя новой инфекции.

Cогласно МГ и экологическим выводам, видообразование Y. pestis прошло в короткий промежуток времени [16]. Экологические факты дают основания полагать, что в быстром «квантовом» видообразовании чумного микроба решающую роль сыграли два пока еще слабо изученных явления — кислородный «взрыв» макрофагов в организме гибернирующих гетеротермных (гетероиммунных) сурков, создавший быстро изменяющиеся («in an eye blink» [36]) стрессовые условия для предкового возбудителя ДСЛ, и стресс-индуцированный мутагенез в эволюционирующей микробной популяции, на порядки ускоряющий изменчивость и скорость эволюции [30, 32].

Тритопное происхождение возбудителя чумы

Для того, чтобы понять, как проходило преобразование клона возбудителя ДСЛ в популяцию чумного микроба, необходимо иметь представление о территориальной структуре среды обитания чумного и псевдотуберкулезного микробов, прежде всего о структуре ареала монгольского сурка, с которым экологический подход связывает истоки чумы.

Как было показано [11, 34], триггером видообразования Y. pestis послужило максимальное сартанское похолодание в Центральной Азии, охватившее (почти) одновременно весь ареал монгольского сурка. Ареал этого вида включает три относительно изолированные географические популяции, представленные отдельными подвидами. Подвид M. sibirica sibirica обитает в восточной части ареала, на Хэнтэе, в Забайкалье, Маньчжурии и в китайской провинции Внутренняя Монголия. M. sibirica caliginosus заселяет Хангайское горное плато в центральных районах Монголии. В западной Монголии и в Тыве на Хархира-Турген-Монгун-Тайгинском горном поднятии обитает пока не описанный подвид M. sibirica ssp. [2, 15]. Сурочьи очаги чумы имеются во всех трех географических популяциях, и в каждом очаге циркулирует свой определенный геновариант (подвид) возбудителя: 2.ANT3, 3.ANT2 и 4.ANT1 соответственно [1, 3, 4, 6, 20, 28]. Так как максимальное похолодание охватило все географические популяции монгольского сурка (почти) одновременно [23], можно полагать, что видообразование чумного микроба из клонов возбудителя ДСЛ прошло (почти) одновременно во всех трех популяциях сурка. Дальнейшая территориальная экспансия трех геновариантов (подвидов) возбудителя сурочьей чумы проходила самостоятельными параллельными маршрутами [33] (рис. 2). В таком случае три исходных геноварианта (подвида) чумного микроба 2.ANT3, 3.ANT2 и 4.ANT1 образовали три самостоятельных голофилетических группы, имеющие разные эволюционные судьбы. Этот факт принципиально важен при создании эволюционной модели Y. pestis: сходные признаки геновариантов из разных филогенетических линий (голофилетических групп) могут быть гомоплазиями, которые следует исключать из филогенетического анализа.

Рисунок 2. Тритопное происхождение трех геновариантов (подвидов) чумного микроба Yersinia pestis 2.ANT3, 3.ANT2 и 4.ANT1 в трех географических популяциях монгольского сурка Marmota sibirica sibirica (I), M. sibirica caliginosus (II) и M. sibirica ssp. (III) и три самостоятельных маршрута их территориальной экспансии

Figure 2. The tritopic origin of the three geneovariantes (subspecies) for the plague microbe Yersinia pestis 2.ANT3, 3.ANT2 and 4.ANT1 in the three geographic populations of the Mongolian marmot Marmota sibirica sibirica (I), M. sibirica caliginosus (II) and M. sibirica ssp. (III) and three independent routes of relevant territorial expansion

Примечание. Пунктирная линия очерчивает южную границу зоны глубокого промерзания грунта.

Note. Dottedline outlines the southern boundary of the zone of soil deep freezing.

Параметры эволюционных моделей

Приведенное выше частичное описание жизненных циклов и экологических особенностей предкового псевдотуберкулезного и производного чумного микробов позволяет сравнить некоторые параметры экологической и молекулярной моделей эволюции, которые используются в реконструкции филогенеза возбудителя чумы (табл.).

Таблица. Некоторые параметры молекулярной и экологической эволюционных моделей Yersinia pestis

Table. Some parameters of molecular and ecological Yersinia pestis evolutionary models

Сравнение параметров моделей позволяет заключить, что экологический сценарий происхождения и мировой экспансии возбудителя чумы является более доверительным, более очевидным, так как согласуется с широким кругом природных событий, произошедших в позднем плейстоцене и голоцене и описанных в научных публикациях [9, 10, 11, 30, 31, 32, 33, 34]. В таком случае, экологический сценарий может быть принят за вербальную модель, на которую следует ориентироваться при разработке молекулярной модели и для оценки достоверности выводов и заключений, которые следуют из МГ-филогенетичекого анализа [31].

Заключение

Экологический сценарий в настоящее время является «нитью Ариадны» в проблеме происхождения и мировой экспансии чумы и стимулом для создания адекватной модели молекулярной эволюции чумного микроба и методологии филогенетической реконструкции в целом. Установить отношения родства или филогенетические взаимоотношения между таксонами и группами живых организмов можно только в том случае, если известен прямой общий предок изучаемых объектов. В МГ-подходе при изучении возбудителя чумы общим предком всего разнообразия внутривидовых форм Y. pestis называют абстрактную, только статистически обоснованную предковую форму MRCA, а совокупность внутривидовых форм (геновариантов, подвидов, биоваров) без каких-либо обоснований интуитивно рассматривают как монофилетическую (голофилетическую) группу близкородственных микроорганизмов. Экологические факты указывают на ошибочность выстраивания МГ-филогенетической схемы по монофилетическому (голофилетическому) принципу. Совокупность внутривидовых форм Y. pestis образована не одной, а тремя голофилетическими группами. Родство геновариантов, входящих в разные голофилетические группы, опосредуется псевдотуберкулезными предками. Это следует учитывать при создании филогенетической эволюционной модели Y. pestis. Молекулярная модель должна предусматривать тритопное видообразование Y. pestis, наличие многочисленных параллелизмов внутривидовой изменчивости, связанной с тритопным видообразованием, и квантовый принцип видообразования в высокоизменчивой гетеротермной (гетероиммунной) гостально-векторной среде сурок–блоха (Marmota sibirica — Oropsylla silantiewi) с участием стресс-индуцированного мутагенеза.

Экологический сценарий происхождения и мировой экспансии возбудителя чумы раскрывает панораму природных событий, на фоне которых разворачивалась «молекулярная» история чумы и с которой молекулярный сценарий не должен иметь каких-либо противоречий. Аналитическая оценка молекулярных сценариев по отношению к экологическому поможет выявить закономерности молекулярной эволюции и внесет важный вклад в развитие теории молекулярной эволюции чумного патогена. После того как будут выявлены молекулярные закономерности эволюции, конгруэнтные многочисленным фактам и факторам других естественнонаучных направлений, можно будет заявить о рождении полноценной теории молекулярной эволюции Y. pestis, обладающей прогностическими свойствами.

About the authors

V. V. Suntsov

Author for correspondence.
Email: vvsuntsov@rambler.ru

PhD, MD (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Population Ecology

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure 1. A typical molecular phylogenetic dendrogram of Yersinia pestis based on the molecular SNP marker analysis [16]

Download (185KB)

Indexing metadata

3. Figure 2. The tritopic origin of the three geneovariantes (subspecies) for the plague microbe Yersinia pestis 2.ANT3, 3.ANT2 and 4.ANT1 in the three geographic populations of the Mongolian marmot Marmota sibirica sibirica (I), M. sibirica caliginosus (II) and M. sibirica ssp. (III) and three independent routes of relevant territorial expansion

Download (164KB)

Indexing metadata