Obtaining and using erythrocyte antigenic meliidosis diagnostic agent in the analysis of serum samples from meliidosis-endemic provinces Ha Giang, Lang Son and Quang Ninh of the Socialist Republic of Vietnam

Full Text

Введение

Эндемичные инфекции занимают особое место в структуре общей заболеваемости, так как их распространение тесно связано с персистенцией возбудителей в определенных зонах и поддержанием там природных очагов, представляющих для населения планеты постоянную эпидемическую опасность.

Мелиоидоз (болезнь Уитмора, пневмоэнтерит и др.) — особо опасная инфекция, границы эндемичности которой, согласно последним данным, охватывают зону между 30-ми параллелями северной и южной широт всех континентов [1]. Традиционно мелиоидоз считают заболеванием, наиболее характерным для стран Южной и Юго-Восточной Азии, в частности, Вьетнама, что, по-видимому, обусловлено особенностями географического положения этой местности, главная из которых — рекордно длинная (более 3,5 тыс. км) узкая береговая линия, что оказывает мощнейшее влияние на климат страны, подверженной действию муссонов, цунами, наводнений и других природных катаклизмов, сопровождающихся обилием осадков и грязевых потоков. С учетом широт, в границах которых расположен Вьетнам, высокая влажность и среднегодовой температурный диапазон от +26 до +33°C представляют собой основные факторы, формирующие климатические условия этого региона. Не случайно другие названия мелиоидоза — «Вьетнамская лихорадка» и «Вьетнамская часовая бомба замедленного действия». Известно, что у участников войны во Вьетнаме мелиоидоз мог проявиться даже спустя десятилетия после возвращения из эндемичного региона [10].

Как правило (до 85% случаев) при мелиоидозе наблюдают острое начало, нередко с септикопиемией [18], которая без своевременного этиотропного лечения часто заканчивается фатально. Пик заболеваемости отмечают в период дождей [14], преимущественно среди фермеров и сельских жителей, возделывающих рис [6, 12], что подтверждает основную роль контактного пути передачи инфекции [11]. Однако иные пути возможного инфицирования — алиментарный, ингаляционный, половой — не исключают случаев заболевания и среди других категорий населения.

Возбудителем мелиоидоза является Burkholderia pseudomallei — микроорганизм II группы патогенности, характеризующийся чрезвычайно высоким уровнем генетически детерминированной резистентности к антибиотикам и обладающий способностью в течение длительного времени персистировать в макроорганизме, избегая уничтожения системой иммунитета [1].

В природных условиях B. pseudomallei формирует естественные ниши в глубоких слоях влажных почв, насыщенных грунтовыми водами, где, наряду с другими родственными почвенными буркхольдериями, такими как B. cepacia и B. thailandensis, входит в состав биоценоза тропического и субтропического пояса [15, 17].

Следует отметить, что ранее считавшийся сапрофитическим вид B. thailandensis так же, как и B. pseudomallei, способен вызывать тяжелую инфекцию с септическими проявлениями, особенно у больных с нарушением иммунного статуса [13].

Возможные многообразные контакты людей, проживающих в эндемичном регионе, с широко представленными в окружающей среде буркхольдериями приводят к формированию у населения естественной иммунной прослойки, то есть популяционного иммунитета, обусловленного накоплением в сыворотках специфических иммуноглобулинов. В ряде случаев это может происходить без манифестации инфекции. И действительно, работами зарубежных авторов показана потенциальная возможность обнаружения мелиоидозных антител в сыворотках крови здоровых лиц [7]. Однако при этом авторы рекомендуют учитывать случаи возможных положительных реакций сывороточных антител, обусловленных перекрестной реактогенностью B. pseudomallei и B. thailandensis [10].

В целом, уровень сывороточных иммуноглобулинов может служить относительным показателем как распространенности возбудителя в эндемичной зоне, так и его контагиозности.

Для выявления антител в сыворотках применяют различные методы иммуноанализа, одним из которых, включенным в принятые в Российской Федерации схемы экспресс-диагностики мелиоидоза (МУ 4.2.2787-10), является реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). РНГА представляет собой один из наиболее доступных и простых методов иммуноанализа, позволяющих в течение нескольких часов без использования специального оборудования получить точные, воспроизводимые и хорошо визуализируемые данные.

В зависимости от используемого препарата с помощью РНГА осуществляют выявление в исследуемых образцах либо антигенов, либо антител. В последнем случае РНГА позволяет провести оценку состояния естественного популяционного иммунитета у населения, проживающего в эндемичном регионе, в частности, в провинциях Ха Занг, Лангшон и Куангнинь Социалистической Республики Вьетнам.

В рамках работы, проводимой Совместным Российско-Вьетнамским Тропическим научным-исследовательским и технологическим центром, нами поставлена цель разработать эритроцитарный антигенный мелиоидозный диагностикум и определить возможность его использования для выявления мелиоидозных антител с помощью РНГА при изучении образцов сывороток населения отдельных провинций Вьетнама как зоны эндемичного распространения B. pseudomallei.

Материалы и методы

В качестве биологической основы диагностикума для РНГА использовали эритроциты, полученные из дефибринированной крови барана и суспендированные в 0,15 М растворе NaCl до концентрации по объему 8%. Эритроциты были формалинизированы (3% формалин в соотношении 1:1, 37°С, 20 ч при постоянном перемешивании), танизированы (танин 1:40 000, соотношение 1:1, 37°С, 15 мин), после чего отмыты путем центрифугирования (1500 об/мин, 3-кратно по 15 мин) и подвергнуты прогреванию (45°С, 30 мин).

Антигенный комплекс, предназначенный для сенсибилизации эритроцитов, получали из ацетовысушенных и дезинтегрированных («Artek sonic dismembrator model 150», 100 Вт, 20 кГЦ — 1 мин, 5×, на льду) клеток штамма В. pseudomallei 107, представленного в лаборатории Коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. После центрифугирования взвеси клеток (6000 об/мин — 25 мин) к надосадку добавляли 1:1 насыщенный раствор сульфата аммония (NH₄)₂SO₄ и оставляли для высаливания (18 ч, 4°С). Осадок отделяли центрифугированием (6000 об/мин — 25 мин), ресуспендировали в 0,15 М растворе NaCl, очищали от солей путем диализа, концентрировали, изучали методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (Laemmli U.K., 1970), после чего использовали в работе. Содержание белка в препарате определяли спектрофотометрически (NanoPhotometer P 300, Implen, Германия) по отношению к стандартному 1% раствору БСА при длине волны 280 нм. Подбор дозы сенситина проводили в диапазоне концентраций 250–1500 мкг/мл.

Сенсибилизацию эритроцитов полученным антигенным комплексом осуществляли в соответствии с его оптимальной сенсибилизирующей дозой [5].

Готовый препарат разливали в ампулы по 1 мл, замораживали до –70°С, затем подвергали лиофилизации в протективной среде (1% НКС, 15% реополиглюкина, 7,5% сахарозы в дистиллированной воде) по 10-ступенчатой программе, в ходе которой в течение 24 ч и более снижение вакуума от 0,3 до 0,1 (ГПа) сопровождалось плавным подъемом температуры полок десублиматора от –70°С до комнатной температуры [4]. После окончания процесса высушивания ампулы запаивали и вскрывали непосредственно перед началом исследования, добавляя к лиофилизату 1 мл 0,15 М хлорида натрия, содержащего с целью стабилизации препарата формалин в конечной концентрации 1%.

Изучение аналитических характеристик диагностикума до и после его высушивания проводили на моделях гомо- и гетерологичных гипериммунных сывороток, сывороток экспериментально зараженных животных, а также образцов сывороток человека из произвольной выборки лиц, проживающих на эндемичных территориях трех провинций Вьетнама (Ха Занг, Лангшон, Куангнинь) и вне их.

Все образцы сывороток для исследования в РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом были любезно предоставлены сотрудниками Совместного Российско-Вьетнамского Тропического научно-исследовательского и технологического центра под кодовыми наименованиями согласно Хельсинкской декларации [2, 3]. Сыворотки были разделены на аликвоты и зарезервированы в хранилище при температуре –70°С.

Выполнение РНГА осуществляли в микроварианте. Сыворотки инактивировали при 56°С, разводили 1:10 в 0,15 М NaCl и титровали двойным шагом в объеме 50 мкл в 1% нормальной кроличьей сыворотке (НКС), содержащей 1% формалина, в полистироловой 96-луночной пластине с V-образным дном, после чего в каждую лунку вносили по 25 мкл 2,5% диагностикума, и пластину оставляли при комнатной температуре под крышкой. Отрицательными контролями служили лунки с добавлением интактной 1% НКС. Учет реакции осуществляли по 4-крестовой системе: предварительно через 2 ч и окончательно — спустя 24 ч после постановки.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. Границы доверительного интервала (95% CI) рассчитывали по методу Уилсона (Wilson).

Результаты

Антигенный комплекс возбудителя мелиоидоза, осажденный с помощью насыщенного до 40% раствора сульфата аммония и ресуспендированный до концентрации 10 мг белка/мл, был использован для сенсибилизации обработанных танином и формалином эритроцитов. В состав сенситина входили 4 мажорных протеина — 28, 29, 40, 51,2 kDa.

Оптимальная сенсибилизирующая доза, при которой нагрузка сенситина обеспечивала получение образцов диагностикума с чувствительностью не ниже 1:1280 с контрольной гипериммунной козьей сывороткой, составила 250 мкг/мл, что послужило основанием для использования в ходе конструирования опытной серии препарата концентрации сенситина 500 мкг/мл (двойной сенсибилизирующей дозы).

Аналитические характеристики полученного диагностикума были изучены на наборах гомо- и гетерологичных гипериммунных сывороток, а также сывороток зараженных различными штаммами возбудителей особо опасных инфекций экспериментальных животных (табл. 1).

 

Таблица 1. Аналитические характеристики эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума по результатам РНГА с сыворотками экспериментальных животных

Table 1. Analytical characteristics of Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent based on IHA results with experimental animal sera

Вид сыворотки Type of serum	Титры в РНГА IHA titers
Сыворотки кроликов, зараженных В. pseudomallei 107 Serum of rabbits infected with B. pseudomallei 107	1:1280–1:2560
Сыворотки белых мышей, зараженных B. pseudomallei 56830 Sera of white mice infected with B. pseudomallei 56830	1:160– 1:1280
Сыворотки кроликов, иммунизированных различными инактивированными штаммами возбудителей мелиоидоза (B. pseudomallei 56830, 57576, 59361«S» 111-6-1 и др.) Sera of rabbits immunized with various inactivated strains of melioidosis pathogens (B. pseudomallei 56830, 57576, 59361 “S” 111-6-1, etc.)	1:3200–1:25 600
Сыворотка козья гипериммунная мелиоидозная (против B. pseudomallei 100) Goat hyperimmune serum melioidosis (against B. pseudomallei 100)	1:51 200–1:204 800
Сыворотка кролика, иммунизированного авирулентным штаммом B. pseudomallei VPA Sera from rabbits immunized with avirulent strain B. pseudomallei VPA	1:320–1:640
Иммунная сыворотка кролика против B. thailandensis Rabbit immune serum against B. thailandensis	1:400
Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia 423 Rabbit immune serum against B. cepacia 423	–
Иммунная сыворотка кролика против В. cepacia 8235 Rabbit immune serum against B. cepacia 8235	–
Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia 3181 Rabbit immune serum against B. cepacia 3181	1:40
Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia 8236 Rabbit immune serum against B. cepacia 8236	–
Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia (ЭЦАг) Rabbit immune serum against B. cepacia (ECAg)	1:20
Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa H-8 Rabbit immune serum against P. aeruginosa H-8	–
Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa H1 Rabbit immune serum against P. aeruginosa H1	–
Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa H-6 Rabbit immune serum against P. aeruginosa H-6	–
Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa РАО 1 Rabbit immune serum against P. aeruginosa PAO 1	–
Иммунная сыворотка кролика против P. fluorescens 540 Rabbit immune serum against P. fluorescens 540	–
Иммунная сыворотка кролика против P. pseudoalcaligenses Rabbit immune serum against P. pseudoalcaligenses	–
Иммунная сыворотка кролика против F. tularensis 32 Rabbit immune serum against F. tularensis 32	–
Иммунная сыворотка кролика против F. tularensis Rabbit immune serum against F. tularensis	–
Иммунная сыворотка кролика против Y. pestis Rabbit immune serum against Y. pestis	–

 

Как следует из данных таблицы, нами был получен препарат эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума, продемонстрировавший на моделях иммунных и переболевших мелиоидозом животных такие показатели чувствительности и специфичности, которые в полной мере в эксперименте обеспечивали выявление специфических антител к B. pseudomallei.

Для определения фоновых показателей возможных перекрестно реагирующих антител у населения Российской Федерации были изучены в РНГА образцы 36 интактных сывороток человека (жителей г. Волгограда) при их титровании двукратным шагом с начального разведения 1:5.

Итоги РНГА, отражающие взаимодействие антигенов возбудителя мелиоидоза с антителами, присутствовавшими в образцах интактных сывороток человека, представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Результаты РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом при исследовании сывороток лиц, проживающих вне эндемичного региона

Table 2. IHA results with Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent assessing sera from persons living outside the endemic region

Общее число проб Total number of samples	Из них положительные в РНГА в титрах Of these, IHA positive titers
	1:5		1:10		1:20
	n	% (95% CI)	n	% (95% CI)	n	% (95% CI)
36	14	38,9 (24,8–55,1)	9	25 (13,8–41,1)	0	–

 

Как следует из представленных данных, на модели образцов сывороток, полученных из неэндемичного региона, положительные результаты РНГА в титре проб 1:5 обнаружены в 14 (38,9%), 1:10 — в 9 (25%) наблюдениях. В 13 случаях из 36 (36,1%) антител, перекрестно реагирующих с возбудителем мелиоидоза, не было зарегистрировано ни в одном из изученных разведений, то есть все 36 образцов сывороток, принадлежащих жителям неэндемичной зоны, в титрах от 1:20 и выше оказались отрицательными.

В рамках работы, проводимой совместно с Российско-Вьетнамским Тропическим научно-исследовательским и технологическим центром, нами проведено тестирование в РНГА 550 образцов сывороток крови лиц, проживающих во вьетнамских провинциях Ха Занг, Лангшон, Куангнинь (290, 195 и 65 проб соответственно) в возрасте от 18 до 81 года (Me = 41, IQR 30–50), у которых отсутствовали клинические признаки мелиоидозной инфекции.

Изучение некоторых демографических показателей (пол, возраст) было выполнено с использованием проб сывороток, полученных из провинции Ха Занг. Выборка в равной мере охватывала взрослое население (как мужчин, так и женщин) в возрасте от 18 до 81 года (рис. 1).

 

Рисунок 1. Распределение жителей провинции Ха Занг Социалистической Республики Вьетнам, сыворотки которых были изучены в РНГА, по полу и возрасту

Figure 1. IHA-based sex- and age-dependent distribution of residents in the province of Ha Giang of the Socialist Republic of Vietnam

 

Таким образом, результаты РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом при изучении рандомных образцов сывороток жителей Вьетнама из провинций Ха Занг, Лангшон и Куангнинь, потенциально содержащих антитела к возбудителю мелиоидоза, подтвердили возможность использования РНГА для выявления мелиоидозных антител в сыворотках человека (табл. 3).

 

Таблица 3. Результаты РНГА при определении титров мелиоидозных антител в образцах сывороток лиц, проживающих в провинциях Ха Занг, Лангшон, Куангнинь Социалистической Республики Вьетнам

Table 3. IHA results determining titer of serum melioidоsis antibodies in persons living in the provinces of Ha Giang, Lang Son, Quang Ninh of the Socialist Republic of Vietnam

Провинция Provinces	Общее число проб Total number of samples	Из них положительные в РНГА в титрах Of these, IHA positive titers
		1:10		1:20		1:40		1:80
		n	% (95% CI)	n	% (95% CI)	n	% (95% CI)	n	% (95% CI)
Ха Занг Ha Giang	290	210	72,4 (67–77,2)	27	9,3 (6,5–13,2)	4	1,4 (0,54–3,5)	49	16,9 (13–21,6)
Лангшон Lang Son	195	137	70,3 (63,5–76,2)	15	7,7 (4,7–12,3)	22	11,3 (7,6–16,5)	21	10,8 (7,2–15,9)
Куангнинь Quang Ninh	65	46	70,8 (58,8–80,4)	1	1,5 (0,3–8,2)	8	12,3 (6,4–22,5)	10	15,4 (8,6–26,1)
Всего Total	550	393	71,5 (67,5–75,1)	43	7,8 (5,8–10,4)	34	6,1 (4,5–8,5)	80	14,6 (11,9–17,7)

 

Согласно полученным результатам, мелиоидозные антитела в изученных образцах сывороток обнаружены в титре проб 1:10 в 71,5% наблюдений, хотя при дальнейшем разведении сывороток количество положительных находок в РНГА резко снижалось и составляло для титров 1:20–1:40–1:80 соответственно 7,8, 6,1 и 14,6% (в целом около 30%).

Результаты реакции иллюстрированы гистограммой (рис. 2).

 

Рисунок 2. Титры РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом при анализе сывороток клинически здоровых лиц, проживающих на территориях отдельных провинций Социалистической Республики Вьетнам

Figure 2. Serum IHA titers by using Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent in clinically healthy individuals living in the territories of certain provinces of the Socialist Republic of Vietnam

 

Таким образом, положительные находки РНГА в титрах сывороток от 1:20 до 1:80 были зарегистрированы в образцах, принадлежащих жителям каждой из трех изученных провинций Вьетнама, и во всех наблюдениях отсутствовали в пробах, полученных от лиц, проживающих вне эндемичного региона.

Обсуждение

Формалинизированные танизированные эритроциты способны эффективно адсорбировать на своей поверхности белковые антигенные комплексы и как биологический носитель остаются востребованными компонентами диагностических тест-систем.

Опытные серии препарата, представляющие собой носитель, ковалентно связанный с антигенами возбудителя мелиоидоза, были получены при белковой нагрузке сенситина 500 мкг/мл.

Аналитические характеристики диагностикума были изучены на моделях более чем 20 образцов сывороток экспериментальных животных (коз, кроликов, белых мышей), подвергавшихся как иммунизации, так и заражению. При этом оказалось, что титры сывороток переболевших мелиоидозом в острой форме лабораторных белых мышей и кроликов составляют в РНГА (в зависимости от вида объекта) от 1:160 до 1:1280.

Уровень мелиоидозных антител в гипериммунных сыворотках, полученных в ходе многоцикловой иммунизации взвесями инактивированных клеток возбудителя здоровых животных (кроликов, коз), может достигать 1:25 000 и даже — при использовании одного из наиболее вирулентных штаммов B. pseudomallei 100 — 1:204 800.

Представляет интерес тот факт, что авирулентный штамм B. pseudomallei VPA, в геноме которого закрепилась необратимая делеция, вызывает у кроликов антителообразование такого же уровня (по результатам РНГА), что и близкородственный возбудитель III группы патогенности B. thailandensis — 1:300–1:400. Как нам кажется, таким образом прослеживается четкая патогенетически значимая связь вирулентных свойств возбудителя мелиоидоза с его иммуногенностью.

Следует отметить, что в низких титрах (1:20–1:40) в отдельных случаях положительные результаты РНГА были продемонстрированы на моделях гипериммунных сывороток против близкородственных возбудителю мелиоидоза буркхольдерий B. cepacia-комплекса. При этом сыворотки, направленные против патогенных псевдомонад (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. pseudoalcaligenses), которые, как известно, также имеют перекрестно реагирующие с возбудителем мелиоидоза антигенные детерминанты, как и сывороточные иммуноглобулины против F. tularensis или Y. pestis, в реакции с антигенным мелиоидозным диагностикумом в исследуемых разведениях (1:10 и выше) не взаимодействовали, что в целом подтверждает специфические свойства полученного препарата.

В ходе изучения аналитических характеристик эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума чувствительность РНГА при исследовании гипериммунных сывороток лабораторных животных составила 1:320–1:640 и выше (в отдельных случаях до 1:204 800).

В 12 из 15 наблюдений активные центры антител сывороток, которые были получены путем иммунизации лабораторных животных гетерологичными или близкородственными возбудителями, не взаимодействовали с антигенными детерминантами возбудителя мелиоидоза, то есть специфичность диагностикума составила 80%.

Таким образом, РНГА, не требующая применения специализированного оборудования, позволила в эксперименте в течение 2–4 ч получить четкие, специфичные и легко визуализируемые результаты, что явилось весомым основанием для использования РНГА в работе по изучению уровня мелиоидозных антител в сыворотках человека.

С этой целью нами отобраны образцы биопроб жителей как эндемичных (провинции Ха Занг, Лангшон и Куангнинь Социалистической Республики Вьетнам), так и неэндемичной (РФ) местностей.

Контингент лиц, проживающих на территориях провинций Ха Занг, Лангшон и Куангнинь, оказался представлен преимущественно фермерами (49,8%), а также другими категориями населения (врачи, учителя, рабочие, студенты и др., 51,2%) — 274 и 276 человек соответственно.

Следует отметить, что провинции Ха Занг и Лангшон расположены в северных районах Вьетнама в гористой местности с высоким среднегодовым уровнем осадков и температурой до +22,78°С. Около 90 и 80% населения провинций Ха Занг и Лангшон соответственно составляют сельские жители.

Провинция Куангнинь находится в прибрежной зоне северного Вьетнама примерно в тех же климатических условиях, но является промышленным регионом, связанным, в основном, с добычей каменного угля. Около 50% жителей провинции Куангнинь относят к городскому населению, многие из которых, тем не менее, по роду деятельности имеют близкий контакт с землей.

Такие условия способствуют формированию и поддержанию эндемичного очага мелиоидоза, являющегося источником значительного эпидемиологического риска для проживающих в данном регионе лиц, который, тем не менее, может быть снижен формированием у населения иммунной прослойки (коллективного иммунитета). При этом, согласно литературным данным, вероятной причиной формирования иммунитета у обследуемых лиц, кроме регистрируемого заболевания, может быть циркуляция штамма возбудителя мелиоидоза со сниженной вирулентностью или контакт с близкородственным видом, что в целом обеспечивает продукцию специфических антител и серопревалентность популяции [9]. Также существует мнение о возможности формирования популяционного иммунитета к B. pseudomallei под влиянием авирулентных почвенных штаммов B. thailandensis, которые имеют схожую с возбудителем мелиоидоза антигенную структуру и могут, в конечном итоге, приводить к выработке кросс-реактивных антител [8, 19, 20].

И действительно, при исследовании образцов сывороток, полученных от жителей провинций Ха Занг (290), Лангшон (195) и Куангнинь (65), оказалось, что в титре до 1:10 иммуноглобулины более 70% проб вступали в реакцию с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом. По-видимому, эти взаимодействия обусловлены неспецифическим связыванием разнобразных пулов IgG, присутствующих в сыворотках человека. При этом, начиная с титров от 1:20 и выше, средний уровень положительных результатов РНГА снижался до 7,8% (43), 6,1% (34) и 14,6% (80) соответственно (рис. 3). Среди интактных сывороток положительных результатов РНГА в разведениях от 1:20 и выше не было зарегистрировано ни в одном из наблюдений, что, с нашей точки зрения, является основанием для рекомендации проведения РНГА-исследований, связанных с иммунодиагностикой мелиоидоза, в титрах от 1:20 и выше. Полученные в отдельных случаях результаты титров 1:5–1:10 не могут иметь диагностического значения, так как, несомненно, обусловлены неспецифическими взаимодействиями перекрестно реагирующих сывороточных антител.

 

Рисунок 3. Результаты РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом при изучении специфической активности сывороток лиц, проживающих на территории эндемичного региона Вьетнама и вне его

Figure 3. Serum IHA results by using Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent in individuals living in the territory of the endemic region of Vietnam and outside

 

По-видимому, нисходящая линия такой условной параболы (рис. 3) отражает, наряду с увеличением титра сывороточных иммуноглобулинов, уменьшение числа неспецифически положительных результатов РНГА, при том что более высокие разведения сывороток, соответствующие восходящей ветви, позволяют выявить в пробах присутствие специфически взаимодействующих с антигенами возбудителя мелиоидоза антител, выработанных иммунными лимфоцитами, возможно вследствие постоянно поддерживаемого контакта макроорганизма с возбудителем или даже перенесенной мелиоидозной инфекции.

Полученные нами данные находят подтверждение в материалах зарубежных авторов. Так, в соответствии с выводами P. Chaichana, присутствие специфических мелиоидозных иммуноглобулинов в сыворотках по результатам РНГА следует регистрировать, начиная с разведения от 1:80 и выше [7].

Cheng называет титры РНГА 1:40–1:80 «низкоположительными» и пограничными, а 1:160 и выше — «высокоположительными», однозначно позволяющими подтвердить диагноз мелиоидоза с помощью некультуральных методов исследования [9].

При изучении некоторых демографических показателей (пол, возраст), выполненном на образцах сывороток, полученных от жителей провинции Ха Занг, показано, что независимо от возраста в титрах от 1:20 оказались серопозитивными 25 из 91 (27,4%) сывороток мужчин и 55 из 199 (27,6%) сывороток женщин, из чего следует, что положительные результаты проб не имеют корреляции ни с полом, ни с возрастом обследуемых [16].

Представленные результаты согласуются с выводами P. Chaichana, которая наиболее важным аспектом серопозитивности популяции считала область проживания людей (село или город) и род их деятельности, но не пол или возраст [7].

Таким образом, на основе выделенных антигенных комплексов B. pseudomallei проведено конструирование эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума, который был подвергнут лиофилизации по многоступенчатой программе [4], позволившей обеспечить в полной мере сохранение его аналитических характеристик как в условиях жаркого тропического климата, так и перепадов давления при авиаперелетах.

С помощью полученного нами эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума в РНГА проведено изучение 550 сывороток крови лиц, проживающих в провинция Ха Занг, Лангшон и Куангнинь Социалистической Республики Вьетнам, а также 36 интактных сывороток лиц из неэндемичного региона.

По результатам выполненных исследований подтверждено формирование у 30% лиц, проживающих в эндемичной зоне, естественного иммунитета к мелиоидозу в виде присутствия в сыворотках мелиоидозных антител в титрах от 1:20 и выше. При этом не исключено, что титры от 1:80 и выше при иммунодиагностике мелиоидоза могут иметь критическое значение.

About the authors

D. L. Tereshko

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Author for correspondence.
Email: Dltereshko@gmail.com

Researcher, Laboratory of Immunodiagnostic Preparations

Russian Federation, Volgograd

I. V. Novitskaya

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: irvnov@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Leading Researcher, Head of the Department of Immunology and Experimental Production of Medical Immunobiological Preparations

Russian Federation, Volgograd

I. B. Zakharova

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: zib279@gmail.com

PhD (Biology), Associate Professor, Head of the Department of Microbiology

Russian Federation, Volgograd

D. Trien

Joint Russian-Vietnamese Tropical Research and Technology Center

Email: tropcenterhanoi@mail.ru

co-director

Viet Nam, Hanoi

A. N. Kuznetsov

Joint Russian-Vietnamese Tropical Research and Technology Center

Email: forestkuz@mail.ru

PhD, MD (Biology), Сo-director

Viet Nam, Hanoi

M. Ya. Kulakov

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: mihailkulakov2115@gmail.com

PhD (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Immunodiagnostic Preparations

Russian Federation, Volgograd

A. A. Budchenko

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: budchenko1976@yandex.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Proteomic Analysis Laboratory

Russian Federation, Volgograd

V. G. Pushkar

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: gunner50@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Immunodiagnostic Preparations

Russian Federation, Volgograd

D. V. Viktorov

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: dvictorov09@gmail.com

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Deputy Director

Russian Federation, Volgograd

A. V. Toporkov

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare

Email: topotkov-andreyy@rambler.ru

PhD, MD (Medicine), Director

Russian Federation, Volgograd

References

Supplementary files