OBTAINING AND USE OF ERYTHROCYTE ANTIGENIC MELIIDOSIS DIAGNOSTIC AGENT IN THE ANALYSIS OF SERUM SAMPLES FROM MELIIDOSIS-ENDEMIC PROVINCES HA GIANG, LANG SON AND QUANG NINH OF THE SOCIALIST REPUBLIC OF VIETNAM


Cite item

Abstract

Melioidosis is a particularly dangerous infection with endemic distribution caused by the gram-negative microorganism of pathogenicity group II Burkholderia pseudomallei. In endemic countries, melioidosis occupies one of the leading places in terms of mortality after HIV, tuberculosis and, in recent years, COVID19. The natural ecological niches of the pathogen are located in tropical and subtropical climate zones, primarily in Southeast Asia and Australia, where its existence as a species is maintained in moist soil and water in a certain temperature range of the environment. However, at present, more and more often cases of melioidosis are registered outside endemic territories, which emphasizes the relevance of improving the means and methods of laboratory diagnosis of this disease both for states located in the zone of natural foci, and for countries in the event of importation of this little-known infection into their territory for local healthcare. In such countries, including the Russian Federation, the population does not have natural immunity to the pathogen, and therefore this infection acquires even greater clinical and epidemic significance. In the Volgograd Plague Control Research Institute, an erythrocyte antigenic melioidosis diagnostic agent for IHA was designed, which makes it possible to detect the presence of melioidosis antibodies in blood sera. The diagnostic agent was obtained on the basis of a biological carrier - ram erythrocytes sensitized with isolated protein antigenic complexes of B. pseudomallei. The high analytical characteristics of the diagnostic agent were confirmed on sera models of immunized and recovering experimental animals. Using the obtained set of reagents, the level of antibodies to the causative agent of melioidosis was studied in blood serum samples from residents of 3 provinces of Vietnam (Ha Giang, Lang Son and Quang Ninh), and also - as a control group - residents of the Volgograd region. In samples obtained from a non-endemic region, in no more than 25% of cases were titers of IHA not exceeding a dilution of 1:10, which is apparently due to cross-reactivity of serum immunoglobulins. Positive samples in serum samples of clinically healthy residents of Ha Giang, Lang Son and Quang Ninh provinces in a titer of 1:10 were registered in 71.5%, in dilutions of 1:20-1:80 - in 28.5% of cases. From our point of view, a serum antibody titer of 1:80, according to the results of IHA, has a diagnostic significance, reflecting the intensity of the anti-melioidosis immunity of the population.

Full Text

Введение

Эндемичные инфекции занимают особое место в структуре общей заболеваемости, так как их распространение тесно связано с персистенцией возбудителей в определенных зонах и поддержанием там природных очагов, сохраняющих для населения планеты постоянную эпидемическую опасность.

Мелиоидоз (болезнь Уитмора, пневмоэнтерит и др.) – особо опасная инфекция, границы эндемичности которой, согласно последним данным, охватывают зону между 30-ми параллелями северной и южной широт всех континентов [1]. Традиционно мелиоидоз считают заболеванием, наиболее характерным для стран Южной и Юго-Восточной Азии, в частности, Вьетнама, что, по-видимому, обусловлено особенностями географического положения этой местности, главная из которых – это рекордно длинная (более 3,5 тыс. км) узкая береговая линия, что оказывает мощнейшее влияние на климат страны, подверженной действию муссонов, цунами, наводнений и других природных катаклизмов, сопровождающихся обилием осадков и грязевых потоков. С учетом широт, в рамках которых расположен Вьетнам, высокая влажность и среднегодовой температурный диапазон от +26 до +33°C представляют собой основные факторы, формирующие климатические условия этого региона. Не случайно другие названия мелиоидоза - «Вьетнамская лихорадка», а также «Вьетнамская часовая бомба замедленного действия». Известно, что у участников войны во Вьетнаме мелиоидоз мог проявиться даже спустя десятилетия после возвращения из эндемичного региона [10].

Как правило (до 85% случаев), при мелиоидозе наблюдают острое начало, нередко с септикопиемией [18], которая без своевременного этиотропного лечения часто заканчивается фатально. Пик заболеваемости отмечают в период дождей [14] преимущественно среди фермеров и сельских жителей, возделывающих рис [6, 12], что подтверждает основную роль контактного пути передачи инфекции [11]. Однако иные пути возможного инфицирования: алиментарный, ингаляционный, вплоть до полового – не исключают случаев заболевания и среди других категорий населения.

Возбудителем мелиоидоза является Burkholderia pseudomallei – микроорганизм II группы патогенности, характеризующийся чрезвычайно высоким уровнем генетически детерминированной резистентности к антибиотикам и обладающий способностью в течение длительного времени персистировать в макроорганизме, избегая уничтожения системой иммунитета [1].

В природных условиях B. pseudomallei формирует естественные ниши в глубоких слоях влажных почв, насыщенных грунтовыми водами, где, наряду с другими родственными почвенными буркхольдериями – такими, как          B. cepacia и B. thailandensis, - входит в состав биоценоза тропического и субтропического пояса [15, 17].

Следует отметить, что ранее считавщийся сапрофитическим вид                     B. thailandensis так же, как и B. pseudomallei, способен вызывать тяжелую инфекцию с септическими проявлениями, особенно у больных с нарушением иммунного статуса [13].

Возможные многообразные контакты людей, проживающих в эндемичном регионе, с широко представленными в окружающей среде буркхольдериями приводят к формированию у населения естественной иммунной прослойки, т.е. популяционного иммунитета, обусловленного накоплением в сыворотках специфических иммуноглобулинов. В ряде случаев это может происходить без манифестации инфекции. И, действительно, работами зарубежных авторов показана потенциальная возможность обнаружения мелиоидозных антител в сыворотках крови здоровых лиц [7]. Однако при этом авторы рекомендуют учитывать случаи возможных положительных реакций сывороточных антител, обусловленных перекрестной реактогенностью B. pseudomallei и B. thailandensis [10].

В целом, уровень сывороточных иммуноглобулинов может служить относительным показателем как распространенности возбудителя в эндемичной зоне, так и в целом его контагиозности.

Для выявления антител в сыворотках применяют различные методы иммуноанализа, одним из которых, включенных в принятые в Российской Федерации схемы экспресс-диагностики мелиоидоза (МУ 4.2.2787-10), является реакция непрямой гемагглютинации. РНГА представляет собой один из наиболее доступных и простых методов иммуноанализа, позволяющих в течение нескольких часов без использования специального оборудования получить точные, воспроизводимые и хорошо визуализируемые данные.

В зависимости от используемого препарата с помощью РНГА осуществляют выявление в исследуемых образцах либо антигенов, либо антител. В последнем случае РНГА-анализ позволяет провести оценку состояния естественного популяционного иммунитета у населения, проживающего в эндемичном регионе, в частности, провинций Ha Giang, Lang Son и Quang Ninh Социалистической Республики Вьетнам.

В рамках работы, проводимой Совместным Российско-Вьетнамским Тропическим научным-исследовательским и технологическим Центром, нами поставлена цель разработать эритроцитарный антигенный мелиоидозный диагностикум и определить возможность его использования для выявления мелиоидозных антител с помощью РНГА при изучении образцов сывороток случайного отбора у населения отдельных провинций Вьетнама как зоны эндемичного распространения B. pseudomallei.

Материалы и методы

В качестве биологической основы диагностикума для РНГА использовали эритроциты, полученные из дефибринированной крови барана и суспендированные в 0,15 М растворе NaCl до концентрации по объему 8%. Эритроциты были формалинизированы (3% формалин в соотношении 1:1, 37°С, 20 ч при постоянном перемешивании), танизированы (танин 1:40000, соотношение 1:1, 37°С, 15 мин), после чего отмыты путем центрифугирования (1500 об/мин, 3-кратно по 15 мин) и подвергнуты прогреванию (45°С, 30 мин).

Антигенный комплекс, предназначенный для сенсибилизации эритроцитов, получали из ацетовысушенных и дезинтегрированных («Artek sonic dismembrator model 150», 100 Вт, 20 кГЦ – 1 мин, 5×, на льду) клеток штамма В. pseudomallei 107, представленного в лаборатории Коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. После центрифугирования взвеси клеток (6000 об/мин – 25 мин) к надосадку добавляли 1:1 насыщенный раствор сульфата аммония (NH4)2SO4 и оставляли для высаливания (18 час, 4°С). Осадок отделяли центрифугированием (6000 об/мин – 25 мин), ресуспендировали в 0,15 М растворе NaCl, очищали от солей путем диализа, концентрировали, изучали методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (Laemmli U.K., 1970), после чего использовали в работе. Содержание белка в препарате определяли спектрофотометрически (NanoPhotometer P 300; Implen, Германия) по отношению к стандартному 1% раствору БСА при длине волны 280 нм. Подбор дозы сенситина проводили в диапазоне концентраций 250-1500 мкг/мл.

Сенсибилизацию эритроцитов полученным антигенным комплексом осуществляли в соответствии с его оптимальной сенсибилизирующей дозой [4].

Готовый препарат разливали в ампулы по 1 мл, замораживали до          -70°С, затем подвергали лиофилизации в протективной среде (1% НКС, 15% реополиглюкина, 7,5% сахарозы в дистиллированной воде) по 10-ступенчатой программе, в ходе которой в течение 24 час и более снижение вакуума от 0,3 до 0,1 (ГПа) сопровождалось плавным подъемом температуры полок десублиматора от -70°С до комнатной температуры [5]. После окончания процесса высушивания ампулы запаивали и вскрывали непосредственно перед началом исследования, добавляя к лиофилизату 1 мл 0,15 М хлорида натрия, содержащего с целью стабилизации препарата формалин в конечной концентрации 1%.

Изучение аналитических характеристик диагностикума до и после его высушивания проводили на моделях гомо- и гетерологичных гипериммунных сывороток, сывороток экспериментально зараженных животных, а также образцов сывороток человека из рандомного числа лиц, проживающих на эндемичных территориях 3-х провинций Вьетнама (Ha Giang, Lang Son, Quang Ninh) и вне их.

Все образцы сывороток для исследования в РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом были любезно предоставлены сотрудниками Совместного  Российско-Вьетнамского Тропического научно-исследовательского и технологического Центра под кодовыми наименованиями согласно Хельсинкской декларации [2, 3]. Сыворотки были разделены на аликвоты и зарезервированы в хранилище при температуре        -70°С.

Выполнение РНГА осуществляли в микроварианте. Сыворотки инактивировали при 56°С, разводили 1:10 в 0,15 М NaCl и титровали двойным шагом в объеме 50 мкл в 1% нормальной кроличьей сыворотке (НКС), содержащей 1% формалина, в полистироловой 96-луночной пластине с V-образным дном, после чего в каждую лунку вносили по 25 мкл 2,5% диагностикума, и пластину оставляли при комнатной температуре под крышкой. Отрицательными контролями служили лунки с добавлением интактной 1% НКС. Учет реакции осуществляли по 4-хкрестовой системе: предварительно через 2 час и окончательно – спустя 24 час после постановки.

Статистическую обработку полученных результатов проводили в программном обеспечении Microsoft Excel. Границы доверительного интервала (95% CI) рассчитывали по методу Уилсона (Wilson).

Результаты

Антигенный комплекс возбудителя мелиоидоза, осажденный с помощью насыщенного до 40% раствора сульфата аммония и ресуспендированный до концентрации 10 мг белка/мл, был использован для сенсибилизации обработанных танином и формалином эритроцитов. В состав сенситина входили 4 мажорных протеина – 28 кДа, 29 кДа, 40 кДа, 51,2 кДа.

Оптимальная сенсибилизирующая доза, при которой нагрузка сенситина обеспечивала получение образцов диагностикума с чувствительностью не ниже 1:1280 с контрольной гипериммунной козьей сывороткой, составила 250 мкг/мл, что послужило основанием для использования в ходе конструирования опытной серии препарата концентрации сенситина 500 мкг/мл (двойной сенсибилизирующей дозы).

Аналитические характеристики полученного диагностикума были изучены на наборах гомо- и гетерологичных гипериммунных сывороток, а также сывороток зараженных различными штаммами возбудителей особо опасных инфекций экспериментальных животных (табл. 1).

Таблица 1. Аналитические характеристики эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума по результатам РНГА с сыворотками экспериментальных животных

Table 1. Analytical characteristics of Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent according to the results of IHA with the experimental animal’s sera

Вид сыворотки

Type of serum

Титры в РНГА

IHA titers

1.              

Сыворотки кроликов, зараженных В. pseudomallei 107

Serum of rabbits infected with B. pseudomallei 107

1:1280-1:2560

2.              

Сыворотки белых мышей, зараженных B. pseudomallei 56830

Sera of white mice infected with B. pseudomallei 56830

1:160– 1:1280

3.              

Сыворотки кроликов, иммунизированных различными инактивированными штаммами возбудителей мелиоидоза (B. pseudomallei 56830, 57576, 59361«S» 111-6-1 и др.)

Sera of rabbits immunized with various inactivated strains of melioidosis pathogens (B. pseudomallei 56830, 57576, 59361 "S" 111-6-1, etc.)

1:3200-1:25600

4.              

Сыворотка козья гипериммунная мелиоидозная (против B. pseudomallei 100)

Goat serum hyperimmune melioidosis (against B. pseudomallei 100)

1:51200-1:204800

5.              

Сыворотка кролика, иммунизированного авирулентным штаммом B. pseudomallei VPA

Serum of a rabbit immunized with an avirulent strain B. pseudomallei VPA

1:320-1:640

6.              

Иммунная сыворотка кролика против B. thailandensis

Rabbit immune serum against B. thailandensis

1:400

7.              

Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia 423

Rabbit immune serum against B. cepacia 423

-

8.              

Иммунная сыворотка кролика против В. cepacia 8235

Rabbit immune serum against B. cepacia 8235

-

9.              

Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia 3181

Rabbit immune serum against B. cepacia 3181

1:40

10.           

Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia 8236

Rabbit immune serum against B. cepacia 8236

-

11.           

Иммунная сыворотка кролика против B. cepacia (ЭЦАг)

Rabbit immune serum against B. cepacia (ECAg)

1:20

12.           

Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa H-8

Rabbit immune serum against P. aeruginosa H-8

-

13.           

Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa H1

Rabbit immune serum against P. aeruginosa H1

-

14.           

Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa H-6

Rabbit immune serum against P. aeruginosa H-6

-

15.           

Иммунная сыворотка кролика против P. aeruginosa РАО 1

Rabbit immune serum against P. aeruginosa PAO 1

-

16.           

Иммунная сыворотка кролика против P. fluorescens 540

Rabbit immune serum against P. fluorescens 540

-

17.           

Иммунная сыворотка кролика против P. pseudoalcaligenses

Rabbit immune serum against P. pseudoalcaligenses

-

18.           

Иммунная сыворотка кролика против F. tularensis 32

Rabbit immune serum against F. tularensis 32

-

19.           

Иммунная сыворотка кролика против F. tularensis

Rabbit immune serum against F. tularensis

-

20.           

Иммунная сыворотка кролика против Y. pestis

Rabbit immune serum against Y. pestis

-

Как следует из данных таблицы, нами был получен препарат эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума, продемонстрировавший на моделях иммунных и переболевших мелиоидозом животных такие показатели чувствительности и специфичности, которые в полной мере в эксперименте обеспечивали выявление специфических антител к B. pseudomallei.

Для определения фоновых показателей возможных перекрестно-реагирующих антител у населения Российской Федерации были изучены в РНГА образцы 36 интактных сывороток человека (жителей г. Волгограда) при их титровании двукратным шагом с начального разведения 1:5.

Итоги РНГА, отражающие взаимодействие антигенов возбудителя мелиоидоза с антителами, присутствующими в образцах интактных сывороток человека, представлены в табл. 2.

Таблица 2. Результаты РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом при исследовании сывороток лиц, проживающих вне эндемичного региона

Table 2. Results of IHA with Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent in the study of sera of persons living outside the endemic region

 

Общее число проб

Total number of samples

Из них положительные в РНГА в титрах

Of these, positive in IHA in titers

1:5

1:10

1:20

n

% (95% CI)

n

% (95% CI)

n

% (95% CI)

36

14

38,9

(24,8-55,1)

9

25

(13,8-41,1)

0

-

 

Как следует из представленных данных, на модели образцов сывороток, полученных из неэндемичного региона, положительные результаты РНГА в титре проб 1:5 обнаружены в 14 (38,9%), 1:10 – в 9 (25%) наблюдений. В 13 случаях из 36 (36,1%) антител, перекрестно-реагирующих с возбудителем мелиоидоза, не было зарегистрировано ни в одном из изученных разведений, т.е. все 36 образцов сывороток, принадлежащих жителям неэндемичной зоны, в титрах от 1:20 и выше оказались отрицательными.

В рамках работы, проводимой совместно с Российско-Вьетнамским Тропическим научно-исследовательским и технологическим Центром, нами проведено тестирование в РНГА 550 образцов сывороток крови лиц, проживающих во вьетнамских провинциях Ha Giang, Lang Son, Quang Ninh (290, 195 и 65 проб соответственно) в возрасте от 18 до 81 года (Me=41, IQR 30-50), у которых отсутствовали клинические признаки мелиоидозной инфекции.

Изучение некоторых демографических показателей (пол, возраст), было выполнено с использованием проб сывороток, полученных из провинции Ha Giang. Выборка в равной мере охватывала взрослое население (как мужчин, так и женщин) в возрасте от 18 до 81 года (рис.1).

Рисунок 1. Распределение жителей провинции Ha Giang Социалистической республики Вьетнам, сыворотки которых были изучены в РНГА, по полу и возрасту

Figure 1. Distribution of residents of the province of Ha Giang of the Socialist Republic of Vietnam, whose sera were studied in the IHA, by sex and age

Таким образом, результаты РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом при изучении рандомных образцов сывороток жителей Вьетнама из провинций Ha Giang, Lang Son и Quang Ninh, потенциально содержащих антитела к возбудителю мелиоидоза, подтвердили возможность использования РНГА-анализа для выявления мелиоидозных антител в сыворотках человека (табл. 3).

Таблица 3. Результаты РНГА при определении титров мелиоидозных антител в образцах сывороток лиц, проживающих в провинциях Ha Giang, Lang Son, Quang Ninh Социалистической Республики Вьетнам

Table 3. Results of IHA in determining the titers of melioidоsis antibodies in the samples of sera of persons living in the provinces of Ha Giang, Lang Son, Quang Ninh of the Socialist Republic of Vietnam

 

Провинция

Provinces

Общее число проб

Total number of samples

Из них положительные в РНГА в титрах

Of these, positive in IHA in titers

1:10

1:20

1:40

1:80

n

% (95% CI)

n

% (95% CI)

n

% (95% CI)

n

% (95% CI)

Ha Giang

290

210

72,4

(67-77,2)

27

9,3

(6,5-13,2)

4

1,4

(0,54-3,5)

49

16,9

(13-21,6)

Lang Son

195

137

70,3

(63,5-76,2)

15

7,7

(4,7-12,3)

22

11,3

(7,6-16,5)

21

10,8 (7,2-15,9)

Quang Ninh

65

46

70,8

(58,8-80,4)

1

1,5

(0,3-8,2)

8

12,3

(6,4-22,5)

10

15,4

(8,6-26,1)

Всего:

550

393

71,5

(67,5-75,1)

43

7,8

(5,8-10,4)

34

6,1

(4,5-8,5)

80

14,6

(11,9-17,7)

 

Согласно полученным результатам, мелиоидозные антитела в изученных образцах сывороток обнаружены в титре проб 1:10 в 71,5% наблюдений, хотя при дальнейшем разведении сывороток количество положительных находок в РНГА резко снижалось и составляло для титров 1:20-1:40-1:80 соответственно 7,8%; 6,1% и 14,6% (в целом. около 30%).

Результаты реакции иллюстрированы гистограммой (рис. 2).

Рисунок 2. Титры РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикум при анализе сывороток клинически здоровых лиц, проживающих на территориях отдельных провинций Социалистической республики Вьетнама

Figure 2. Titers of IHA with Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent in the analysis of sera of clinically healthy individuals living in the territories of certain provinces of the Socialist Republic of Vietnam

 

Таким образом, положительные находки РНГА в титрах сывороток от 1:20 до 1:80 были зарегистрированы в образцах, принадлежащих жителям каждой из трех изученных провинций Вьетнама, и во всех наблюдениях отсутствовали в пробах, полученных от лиц, проживающих вне эндемичного региона.

Обсуждение

Формалинизированные танизированные эритроциты способны эффективно адсорбировать на своей поверхности белковые антигенные комплексы и как биологический носитель остаются востребованными компонентами диагностических тест-систем.

Опытные серии препарата, представляющий собой носитель, ковалентно связанный с антигенами возбудителя мелиоидоза, был получен при белковой нагрузке сенситина 500 мкг/мл.

Аналитические характеристики диагностикума были изучены на моделях более чем 20 образцов сывороток экспериментальных животных (коз, кроликов, белых мышей), подвергавшихся как иммунизации, так и заражению. При этом оказалось, что титры сывороток переболевших мелиоидозом в острой форме лабораторных белых мышей и кроликов составляют в РНГА (в зависимости от вида объекта) от 1:160 до 1:1280.

Уровень мелиоидозных антител в гипериммунных сыворотках, полученных в ходе многоцикловой иммунизации взвесями инактивированных клеток возбудителя здоровых животных (кроликов, коз), может достигать 1:25000 и даже – при использовании одного из наиболее вирулентных штаммов B. pseudomallei 100 - 1:204800.

Представляет интерес тот факт, что авирулентный штамм                     B. pseudomallei VPA, в геноме которого закрепилась необратимая делеция, вызывает у кроликов по результатам РНГА антителообразование такого же уровня, что и близкородственный возбудитель III группы патогенности         B. thailandensis 1:300-1:400. Как нам кажется, таким образом прослеживается четкая патогенетически значимая связь вирулентных свойств возбудителя мелиоидоза с его иммуногенностью.

Следует отметить, что в низких титрах (1:20-1:40) в отдельных случаях положительные результаты РНГА были продемонстрированы на моделях гипериммунных сывороток против близкородственных возбудителю мелиоидоза буркхольдерий В. сepacia–комплекса. При этом сыворотки, направленные против патогенных псевдомонад (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. pseudoalcaligenses), которые, как известно, также имеют перекрестно-реагирующие с возбудителем мелиоидоза антигенные детерминанты, как и сывороточные иммуноглобулины против F. tularensis или Y. pestis, в реакции с антигенным мелиоидозным диагностикумом в исследуемых разведениях (1:10 и выше) не взаимодействовали, что в целом подтверждает специфические свойства полученного препарата.

В ходе изучения аналитических характеристик эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума чувствительность РНГА при исследовании гипериммунных сывороток лабораторных животных составила 1:320-1:640 и выше (в отдельных случаях до 1:204800).

В 12 из 15 наблюдений активные центры антител сывороток, которые были получены путем иммунизации лабораторных животных гетерологичными или близкородственными возбудителями, не взаимодействовали с антигенными детерминантами возбудителя мелиоидоза, т.е. специфичность диагностикума составила 80%.

Таким образом, реакция непрямой гемагглютинации, не требующая применения специализированного оборудования, позволила в эксперименте в течение 2-4 час получить четкие, специфичные и легко визуализируемые результаты, что явилось весомым основанием для использования РНГА-анализав работе по изучению уровня мелиоидозных антител в сыворотках человека.

С этой целью нами отобраны образцы биопроб жителей как эндемичных (провинций Ha Giang, Lang Son и Quang Ninh Социалистической Республики Вьетнам), так и неэндемичной (РФ) местностей.

Контингент лиц, проживающих на территориях провинций Ha Giang, Lang Son и Quang Ninh, оказался представлен преимущественно фермерами (49,8%), а также другими категориями населения (врачи, учителя, рабочие, студенты и др., 51,2 %) - 274 и 276 человек соответственно.

Следует отметить, что провинции Ha Giang и Lang Son расположены в северных районах Вьетнама в гористой местности с высоким среднегодовым уровнем осадков и температурой до +22,78°С. Около 90% и 80 % населения провинций Ha Giang и Lang Son соответственно составляют сельские жители.

Провинция Quang Ninh находится в прибрежной зоне северного Вьетнама примерно в тех же климатических условиях, но является промышленным регионом, связанным, в основном, с добычей каменного угля. Около 50% жителей провинции Quang Ninh относят к городскому населению, многие из которых, тем не менее, по роду деятельности имеют близкий контакт с землей.

Такие условия способствуют формированию и поддержанию эндемичного очага мелиоидоза, являющегося источником значительного эпидемиологического риска для проживающих в данном регионе лиц, который, тем не менее, может быть снижен формированием у населения иммунной прослойки (коллективного иммунитета). При этом, согласно литературным данным, вероятной причиной формирования иммунитета у обследуемых лиц, кроме регистрируемого заболевания, может быть циркуляция штамма возбудителя мелиоидоза со сниженной вирулентностью или контакт с близкородственным видом, что в целом обеспечивает продукцию специфических антител и серопревалентность популяции [9]. Также существует мнение о возможности формирования популяционного иммунитета к B. pseudomallei под влиянием авирулентных почвенных штаммов B. thailandensis, которые имеют схожую с возбудителем мелиоидоза антигенную структуру и могут, в конечном итоге, приводить к выработке кросс-реактивных антител [8, 19, 20].

И, действительно, при исследовании образцов сывороток, полученных от жителей провинций Ha Giang (290), Lang Son (195) и Quang Ninh (65), оказалось, что в титре до 1:10 иммуноглобулины более 70% проб вступали в реакцию с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом. По-видимому, эти взаимодействия обусловлены неспецифическим связыванием разнобразных пулов IgG, присутствующих в сыворотках человека. При этом, начиная с титров от 1:20 и выше, средний уровень положительных результатов РНГА снижался до 7,8% (43), 6,1% (34) и 14,6% (80) соответственно (рис. 3). Среди интактных сывороток положительных результатов РНГА в разведениях от 1:20 и выше не было зарегистрировано ни в одном из наблюдений, что, с нашей точки зрения, является основанием для рекомендации проведения РНГА-исследований, связанных с иммунодиагностикой мелиоидоза, в титрах от 1:20 и выше. Полученные в отдельных случаях результаты титров 1:5-1:10 не могут иметь диагностического значения, так как, несомненно, обусловлены неспецифическими взаимодействиями перекрестно-реагирующих сывороточных антител.

 

Рисунок 3. Результаты РНГА с эритроцитарным антигенным мелиоидозным диагностикумом при изучении специфической активности сывороток лиц, проживающих на территории эндемичного региона Вьетнама и вне ее

Figure 3. The results of IHA with Erythrocyte Antigenic Melioidosis Diagnostic Agent in the study of the specific activity of sera from individuals living in the territory of the endemic region of Vietnam and beyond

По-видимому, нисходящая линия такой условной параболы (рис. 3) отражает, наряду с увеличением титра сывороток, уменьшение числа неспецифически-положительных результатов РНГА, при том, что более высокие разведения сывороток, соответствующие восходящей ветви, позволяют выявить в пробах присутствие специфически взаимодействующих с антигенами возбудителя мелиоидоза антител, выработанных иммунными лимфоцитами, возможно, вследствие постоянно-поддерживаемого контакта макроорганизма с возбудителем или даже перенесенной мелиоидозной инфекции.

Полученные нами данные находят подтверждение в материалах зарубежных авторов. Так, в соответствии с выводами Chaichana, присутствие специфических мелиоидозных иммуноглобулинов в сыворотках по результатам РНГА следует регистрировать, начиная с разведения от 1:80 и выше [7].

Cheng называет титры РНГА 1:40 – 1:80 «низко положительными» и пограничными, а 1:160 и выше – «высоко положительными», однозначно позволяющими подтвердить диагноз мелиоидоза с помощью некультуральных методов исследования [9].

При изучении некоторых демографических показателей (пол, возраст), выполненном на образцах сывороток, полученных от жителей провинции Ha Giang, показано, что независимо от возраста в титрах от 1:20 оказались серопозитивными 25 из 91 (27,4%) сывороток мужчин и 55 из 199 (27,6%) сывороток женщин, из чего следует, что положительные результаты проб не имеют корреляции ни с полом, ни с возрастом обследуемых [16].

Представленные результаты согласуются с выводами Chaichana, которая наиболее важным аспектом серопозитивности популяции считала область проживания людей (село или город) и род их деятельности, но не пол или возраст [7].

Таким образом, на основе выделенных антигенных комплексов B. pseudomallei проведено конструирование эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума, который был подвергнут лиофилизации по многоступенчатой программе [5], позволившей обеспечить в полной мере сохранение его аналитических характеристик как в условиях жаркого тропического климата, так и перепадов давления при авиаперелетах.

С помощью полученного нами эритроцитарного антигенного мелиоидозного диагностикума в РНГА проведено изучение 550 сывороток крови лиц, проживающих в провинция Ha Giang, Lang Son и Quang Ninh Социалистической Республики Вьетнам, а также 36 интактных сывороток лиц из неэндемичного региона.

По результатам выполненных исследований подтверждено формирование у 30% лиц, проживающих в эндемичной зоне, естественного иммунитета к мелиоидозу в виде присутствия в сыворотках мелиоидозных антител в титрах от 1:20 и выше. При этом не исключено, что титры от 1:80 и выше при иммунодиагностике мелиоидоза могут иметь критическое значение.

×

About the authors

Dmitrii Leonidovich Tereshko

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Author for correspondence.
Email: Dltereshko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5876-1270
SPIN-code: 4411-6205

Researcher, Laboratory of Immunodiagnostic Preparations

Russian Federation, 400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

Irina Vyacheslavovna Novitskaya

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Email: irvnov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8124-0310

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Leading Researcher, Laboratory of Immunodiagnostic Preparations

Russian Federation, 400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

Irina Borisovna Zakharova

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Email: zib279@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7808-7658

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Leading Researcher, Laboratory of Pathogenic Burkholderia

400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

Dang Hong Trien

Joint Russian-Vietnamese Tropical Research and Technology Center, Hanoi, Socialist Republic of Vietnam

Email: tropcenterhanoi@mail.ru

co-director

Viet Nam

Andrey Nikolaevich Kuznetsov

Joint Russian-Vietnamese Tropical Research and Technology Center, Hanoi, Socialist Republic of Vietnam

Email: forestkuz@mail.ru

Doctor of Biological Sciences, co-director

Viet Nam

Mikhail Yakovlevich Kulakov

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Email: mihailkulakov2115@gmail.com

Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher, Laboratory of Immunodiagnostic Preparations

400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

Anatoly Alexandrovich Budchenko

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Email: budchenko1976@yandex.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory of Proteomic Analysis

400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

Vladimir Georgievich Pushkar

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Email: gunner50@mail.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory of Immunodiagnostic Preparations

400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

Dmitry Viktorovich Viktorov

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Email: dvictorov09@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2722-7948

Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Deputy Director

400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

Andrey Vladimirovich Toporkov

Federal Government Health Institution «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Volgograd, Russia

Email: topotkov-andreyy@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-3449-4657

Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Institute Director

Russian Federation, 400131, st. Golubinskaya 7, Volgograd, Russia

References

  1. Захарова И.Б., Топорков А.В., Викторов Д.В. Мелиоидоз в аспектах эпидемиологии, клиники и лабораторной диагностики. Инфекция и иммунитет. 2021;11(3):409-422. [Zakharova I.B., Toporkov A.V., Viktorov D.V. Melioidosis in aspects of epidemiology, clinic, and laboratory diagnostics. Russian Journal of Infection and Immunity. 2021;11(3):409-422. (In Russ.)]
  2. Калинина О.В., Личная Е.В., Pham Thi Ha Giang, Bui Thi Lan Anh, Vo Viet Cuong, Pham Ngoc Quang, Чуланов В.П., Дмитриев А.В. Распространенность парентеральных вирусных гепатитов во Вьетнаме / Под ред. А.Ю. Поповой, А.В. Топоркова, 2019. С. 259-270. [Kalinina O.V., Personal E.V., Pham Thi Ha Giang, Bui Thi Lan Anh, Vo Viet Cuong, Pham Ngoc Quang, Chulanov V.P., Dmitriev A.V. Prevalence of parenteral viral hepatitis in Vietnam. Ed. A.Yu. Popova, A.V. Toporkov, 2019., pp. 259-270. (In Russ)]
  3. Личная Е.В., Фам Т.Ж., Петрова О.А., Чан Т.Н., Нгуен Т.Т., Буй Т.Н., Во В.К., Дмитриев А.В., Калинина О.В. Распространенность гепатита E среди коренного населения северной провинции Ха Занг, Вьетнам. Инфекция и иммунитет. 2021;11(4):692-700. [Lichnaia E.V., Pham T.G., Petrova O.A., Tran T.N., Nguyen T.T., Bui T.N., Vo V.C., Dmitriev A.V., Kalinina O.V. Hepatitis E virus seroprevalence in indigenous residents of the Hà Giang northern province of Vietnam. Russian Journal of Infection and Immunity. 2021;11(4):692-700. (In Russ.)]
  4. Патент РФ № 2013135369/15, 26.07.2013 Куделина А.М., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Пушкарь В.Г., Илюхин В.И., Будченко А. А., Прохватилова Е.В., Дубина И.А., Замарин А.Е., Мазурова И.Ю., Куликова А.С., Сенина Т.В. //Патент России № 2540902. 2015 Бюл. № 4. Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. [Kudelina A.M., Novitskaja I.V., Kulakov M.J., Pushkar’ V.G., Iljukhin V.I., Budchenko A.A., Prokhvatilova E.V., Dubina I.A., Zamarin A E.E., Mazurova I.Yu., Kulikova A.S., Senina T.V. Method for preparing erythrocytic diagnostic antigen for detecting actinobacillus mallei and melioidosis antigen antibodies. (In Russ.)]
  5. Патент РФ № 2011127595/06 05.07.2011 Пушкарь В.Г., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Павлова К.А. Степурина А.М. // Патент России №2476791. 2013 Бюл. №6. Способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума. [Pushkar' V. G., Novitskaja I.V., Kulakov M. J., Pavlova K. A., Stepurina A. M. Method for freeze drying erythrocyte diagnosticum. (In Russ.)]
  6. Brett P. J., Woods D. E. Pathogenesis of and immunity to melioidosis Acta trop., 2000, vol. 74, no 2-3, pp. 201-210. doi: 10.1016/s0001-706x(99)00071-6
  7. Chaichana P., Jenjaroen K., Amornchai P., Chumseng S., Langla S., Rongkard P., Sumonwiriya M., Jeeyapant A., Chantratita N., Teparrukkul P., Limmathurotsakul D., Day N., Wuthiekanun V., Dunachie S.J. Antibodies in melioidosis: the role of the indirect hemagglutination assay in evaluating patients and exposed populations Am J Trop Med Hyg., 2018, vol. 99, no. 6, pp. 1378-1385. doi: 10.4269/ajtmh.17-0998
  8. Charoenwong P., Lumbiganon P., Puapermpoonsiri S., The prevalence of the indirect hemagglutination test for melioidosis in children in an endemic area. Southeast Asian J Trop Med Public Health., 1992, vol. 23, no. 4, pp. 698–701.
  9. Cheng A.C., O'brien M., Freeman K., Lum G., Currie B.J. Indirect hemagglutination assay in patients with melioidosis in northern Australia Am J Trop Med Hyg., 2006, vol. 74, no. 2, pp. 330-334. doi: 10.4269/ajtmh.2006.74.330
  10. Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management Clin Microbiol Rev., 2005, vol. 18, no. 2, pp. 383-416. doi: 10.1128/CMR.18.2.383-416.2005
  11. Dong S., Wu L., Long F., Wu Q., Liu X., Pei H., Xu K., Lu Y., Wang Y., Lin Y., Xia Q. The prevalence and distribution of Burkholderia pseudomallei in rice paddy within Hainan, China Acta trop., 2018, vol. 187, pp. 165-168. doi: 10.1016/j.actatropica.2018.08.007
  12. Inglis T.J.J., Sagripanti J.L. Environmental factors that affect the survival and persistence of Burkholderia pseudomallei Appl Environ Microbiol., 2006, vol. 72, no. 11, pp. 6865-6875. doi: 10.1128/AEM.01036-06
  13. Manivanh L., Pierret A., Rattanavong S., Kounnavongsa O., Buisson Y., Elliott I., Maeght J.L., Xayyathip K., Silisouk J., Vongsouvath M., Phetsouvanh R., Newton P.N., Lacombe G., Ribolzi O., Rochelle-Newall E., Dance D.A.B. Burkholderia pseudomallei in a lowland rice paddy: seasonal changes and influence of soil depth and physico-chemical properties Sci rep., 2017, vol. 7, no. 1, pp. 1-11. doi: 10.1038/s41598-017-02946-z
  14. Phuong D.M., Trung T.T., Breitbach K., Tuan N.Q., Nübel U., Flunker G., Khang D.D., Quang N.X., Steinmetz I. Clinical and microbiological features of melioidosis in northern Vietnam Trans R Soc Trop Med Hyg. 2008, vol. 102, no. Supplement_1, pp. 30-36. doi: 10.1016/S0035-9203(08)70009-9
  15. Samy P.R, Stiles B.G., Sethi G., Lim L.H.K. Melioidosis: Clinical impact and public health threat in the tropics PLoS Negl Trop Dis., 2017, vol. 11. doi: 10.1371/journal.pntd.0004738
  16. So S.Y., Chau P.Y., Aquinas M., Gabriel M., Lam, W.K. Melioidosis: a serological survey in a tuberculosis sanatorium in Hong Kong. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1987, vol. 81, no. 6, pp. 1017–1019. doi: 10.1016/0035-9203(87)90384-1
  17. Thomas A.D., Forbes-Faulkner J., Parker M. Isolation of Pseudomonas pseudomallei from clay layers at defined depths Am J Epidemiol. 1979, vol. 110, no. 4, pp. 515-521. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a112832
  18. Wiersinga W.J., Virk H.S., Torres A. G., Currie B.J., Peacock S.J., Dance D., Limmathurotsakul D. Melioidosis Nat Rev Dis Primers. 2018, vol. 4, no. 1, pp. 1-22. doi: 10.1038/nrdp.2017.107
  19. Wuthiekanun V., Chierakul W., Langa S., Chaowagul W., Panpitpat C., Saipan P., Thoujaikong T., Day N.P., Peacock S.J. Development of antibodies to Burkholderia pseudomallei during childhood in melioidosis-endemic northeast Thailand. Am J Trop Med Hyg., 2006, vol. 74, no. 6, pp. 1074–1075. doi: 10.4269/ajtmh.2006.74.1074
  20. Wuthiekanun V., Langa S., Swaddiwudhipong W., Jedsadapanpong W., Kaengnet Y., Chierakul W., Day N.P., Peacock S.J. Short report: melioidosis in Myanmar: forgotten but not gone? Am J Trop Med Hyg., 2006, vol. 75, no. 5, pp. 945–946. doi: 10.4269/ajtmh.2006.75.945.

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Tereshko D.L., Novitskaya I.V., Zakharova I.B., Trien D., Kuznetsov A.N., Kulakov M.Y., Budchenko A.A., Pushkar V.G., Viktorov D.V., Toporkov A.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies