A 24-hour Сandida sp. biofilm formation dynamically assesed with modified macrometric method

Full Text

Введение

Формирование биопленочных сообществ является одной из основных стратегий выживания бактерий и грибов в той экологической нише, которую они занимают. В биопленках бактериально-грибковые микросимбиоценозы приобретают защиту от различных физических (УФ излучение, высушивание), химических (изменение рН, антибиотики, биоциды, поверхностно-активные вещества), биологических антимикробных факторов (фагоциты, антитела, бактериофаги, факторы естественной резистентности макроорганизма), что позволяет рассматривать биопленку как одну из форм персистенции микроорганизмов [2]. Имеются сведения, что с образованием биопленок связаны до 80% инфекционных заболеваний и множественная антибиотикорезистентность микроорганизмов [17, 18]. В ряде обзорных работ отражено значение биопленок для различных областей науки и практики, демонстрирующее возросший интерес к этой проблеме и информация о большом количестве методов изучения, культивирования и индикации биопленок in vitro и in vivo [1, 7, 22, 23, 24].

Широко используются в последние десятилетия динамические методики исследования биопленкоообразования с использованием лабораторных ферментеров, аппарата Робинсона в его различных модификациях, проточный метод [12, 19]. Основным преимуществом динамических методов формирования биопленок является максимальное приближение к условиям живых систем [14]. Инновационные технические решения — использование флюоресцентной, конфокальной сканирующей лазерной и электронной микроскопии. Данные методы позволили выявить гетерогенную структуру бактериально-грибковых биопленок. Изучены гены, кодирующие белки адгезии Сandida sp. и описаны фазы формирования биопленки: прилипания, образование межклеточного матрикса и формирования зрелой биопленки, состоящей из единичных клеток и мицелия [21, 22, 27]. В своих работах M. Al-Fattani и соавт. изучили химический состав матрицы биопленок Сandida albicans (С. albicans) и Сandida tropicalis (C. tropicalis) [19]. Основными структурными компонентами были белки, углеводы, гексозамин и фосфор.

В последнее время изучение биопленок в бактериально-грибковых популяциях проводят методом флуоресцентной гибридизации in situ, который позволяет определить расположение мРНК в клетках, образующих биопленки. С помощью этого метода выявлены клетки-персистеры, ответственные за выживание популяции при воздействии факторов различной природы [11].

Изучение биопленок in vitro имеет целый ряд ограничений. D. Andes и соавт. изучали образование и структуру биопленок в центральной вене крыс с помощью флюоресцентной и электронной микроскопии [20]. Экспериментально доказано, что в пространстве, смежном с поверхностью катетера, клетки Сandida sp. плотно прилегали к внеклеточному матриксу. Слой, смежный с катетером, был менее плотен. Наиболее удаленная поверхность биопленки содержала единичные клетки Сandida sp., которые были вложены в волокнистый внеклеточный материал. Подобные особенности структуры биопленки Сandida sp. характерны и для моделей in vitro. Однако электронная микроскопия показала наличие клеток экспериментального животного в составе матрицы биопленки [28].

В этой связи, предлагаемые методы выявления биопленкообразования сложны, требуют специализированного оборудования, вивария, что создает в реальной клинической практике сложности в выявлении биопленок и создается ложное представление о низкой частоте данного биологического образования.

Вторая группа методов основана на создании статических условий культивирования микроорганизмов, которые удобны, высоко производительны и наглядны. Однако научный интерес отечественных исследователей к нему в последнее время значительно снизился, а практическое значение так и не получило должной оценки. Авторами предложен вариант модификации популярной методологии биопленкообразования на пластиковой посуде в течение суток. Биоритмы обеспечивают необходимую последовательность физиологических, метаболических и биохимических процессов и оптимальное соотношение ее параметров в каждый момент времени [13]. С этой точки зрения хронобиологический подход выступает одновременно и как методологический принцип, и как методический прием [4, 15].

Цель исследования — изучить динамику биопленкообразования Сandida sp. в течение суток модифицированным макрометрическим методом.

Материалы и методы

Объектом исследования служили 17 изолятов С. albicans, C. tropicalis и C. krusei, выделенные из женского репродуктивного тракта при кандидозном дисбиозе. Контроль — депонированные эталонные штаммы Сandida sp., полученные из американской коллекции типовых культур (АТСС) С. albicans 24433, C. tropicalis 750, C. krusei 6258. Данные виды грибов выбраны в качестве модели, так как в подавляющем большинстве случаев (85–90%) возбудителем кандидоза является C. аlbicans, наиболее патогенный и значимый в клинической практике вид. Среди остальных видов Сandida sp. клиническое значение имеют преимущественно C. tropicalis — 3–5%, C. krusei — 1–3%. В последнее время увеличивается количество заболеваний, вызванных именно грибами С. non-albicans [9].

Выделение и идентификацию грибов проводили по комплексу признаков: внешний вид колоний, хламидоспорообразование, тест на образование ростовых трубок, чувствительность к антифунгальным препаратам диско-диффузионным методом, ассимиляционная способность [6].

В работе представлена модификация способа оценки биопленкообразования, предложенного O’Toole G.A. и соавт. [27]. На первом этапе исследования были получены 24-часовые культуры, выращенные на питательной среде Сабуро с теллуритом (НПО «Питательные среды», Россия) при температуре 37°С, что соответствовало началу стационарной фазы развития грибов. Биопленки получали в стеклянных стандартных по ГОСТу пробирках (14 мл), промытых хромовой смесью. Исходную концентрацию микроорганизмов 0,5 МсFarland готовили с помощью прибора для определения мутности микробной суспензии — Densi-La-Meter (Lachema, Чехия). Рабочую концентрацию 1,5 × 10³ КОЕ/мл получали титрованием культуры в физиологическом растворе, затем добавляли в пробирки с бульоном Сабуро (НПО «Питательные среды», Россия) и инкубировали в термостате при температуре 37°С. Для удаления планктонной фазы популяции производили забор содержимого из пробирок пипеткой, не задевая стенок сосуда и дважды аккуратно промывали дистиллированной водой. Для количественной оценки способности дрожжевых грибов к пленкообразованию добавляли 2 мл генцианового фиолетового в пробирку. Спустя 45 мин сливали краситель, стенки пробирки многократно промывали дистиллированной водой. Для десорбции красителя в органический растворитель в каждую пробирку на 15 мин добавляли 2 мл 96% этилового спирта.

Кинетику образования биопленки изучали по изменению коэффициента пропускания света и оптической плотности на спектрофотометре КФК-3-01 при длине волны 540 нм, измерения проводили через 24, 36, 48, 72 и 96 ч. В качестве контроля применяли 96% этиловый спирт. Экстрагированный этанолом из биопленки генциановый фиолетовый помещали в одноразовые пластиковые кюветы «макро» размером 10 × 10 × 45 мм, объемом 4 мл (длина оптического пути 10 мм). Температура измеряемых жидкостей соответствовала комнатной температуре. Для получения статистических достоверных данных эксперимент повторяли 5 раз.

Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов осуществляли с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2010. Определяли М — среднее арифметическое, δ — среднеквадратичное отклонение, m — средняя ошибка среднего арифметического, данные представляли по форме М±m или М±δ. В случае соответствия сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по χ²) использовали t-критерий Стьюдента.

На втором этапе изучали биологическую активность пленкообразования Сandida sp. в течение двух суток с 4-часовым интервалом, в зимнее время года, IV фаза Луны. Использовали 48-часовую культуру грибов, что соответствовало максимальной адгезии их на поверхности стекла. Хронодизайн исследований подразумевал получение по оцениваемой функции 6-ти измерений в сутки с 3–5-ти кратным повторением условий эксперимента. Проведено 11 экспериментов, получено 486 измерений.

Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности, p < 0,05 [26]. Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с периодами Т = 12 и Т = 24 часа: мезор (M) — среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (A) — расстояние от экстремума до мезора и акрофаза (φ) — момент времени ожидаемого экстремума функции.

Непараметрическим методом статистической обработки — критерием Манна–Уитни (Т) — сравнивали различия между несвязанными выборками (опыт — контроль, музейные и госпитальные культуры). Анализируемые различия считали достоверными при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Все изоляты Сandida sp. обладали характерной скоростью роста. Адгезивные свойства грибов рода Candida зависели от фазы их развития. Стеклянная поверхность пробирки в питательной среде покрывалась первичной пленкой через 12 ч культивирования. При визуальном осмотре биопленки, уже через 24 ч культивирования, покрывали всю поверхность стекла, контаминированного с питательной средой.

Экспериментально выявлено, что наиболее оптимальным временем для исследования биопленкообразования является временная точка 48 часов. В этот период коэффициент пропускания света являлся самым высоким, так как клеточные стенки грибов внутри биопленки максимально сорбировали генциановый фиолетовый. Следовательно, способность клеток микромицетов к адгезии достоверно выше в стационарной фазе роста, чем логарифмической. Период культивирования 72–96 ч характеризовался снижением биопленкообразования грибов, так как их клетки теряли подвижность и начинали интенсивно выделять внеклеточные полимеры, образуя полимерный матрикс [13]. Подобные результаты были получены С.А. Лисовской (2008) при наблюдении 1–4-суточных культур с использование методики выращивания биопленок на нитроцеллюлозной поверхности [10].

Используемый нами хронобиологический прием позволил выявить наличие пленкообразующей активности грибов в течение суток (р < 0,05) и обнаружить общие закономерности проявления свойств у представителей всех изучаемых видов.

Суточная динамика биопленкобразования С. albicans характеризовалась ультрадианным (около 12-часовым) вкладом ритма в утреннее (04:00) и вечернее (16:00) время. У C. non-albicans выявлены достоверные циркадианные (околосуточные) ритмы активности адгезии к поверхности стекла. Максимальные значения показателя регистрировались у C. tropicalis в вечернее время — 17:00–17:23, а у C. krusei в ночные часы — 20:00–23:20. Вклад ритмов формирования биопленок музейными культурами представлен на рис. 1.

 

Рисунок 1. Вклад ритмов биопленкообразования музейных штаммов Сandida sp.

Figure 1. Contribution of biofilm formation rhythms of archival Candida sp. strains

Примечание. *р < 0,05

Note. *p < 0.05

 

Наличие циркадианных ритмов в спектральном составе микроорганизмов одновременно с ультрадианными гармониками указывало на усиление адаптивных возможностей микроорганизмов. Среднесуточные показатели биопленкообразования не превышали 1,4±0,05, что позволило судить о низкой активности всех изучаемых культур. Аналогичные результаты получены при изучении суточной динамики адгезивных свойств музейных штаммов Сandida sp., адсорбированных на формализированных эритроцитах человека 0 (I) группы Rh(+) [16].

У клинических изолятов грибов, выделенных из женского репродуктивного тракта при кандидозном дисбиозе, динамика биопленкообразования характеризовалась достоверными ультрадианными гармониками (рис. 2). Максимальные значения фиксировались в ранние утренние часы — 03:09–04:18 и в вечернее время с 18:45 до 20:20.

 

Рисунок 2. Вклад ритмов биопленкообразования клинических изолятов Сandida sp.

Figure 2. Contribution of biofilm formation rhythms for Сandida sp. clinical isolates

Примечание. *р < 0,05.

Note. *p < 0.05.

 

Ультрадианные ритмы характеризуют, напротив, вариабельность периодов, что имеет важное биологическое значение, определяющее устойчивость к внешним воздействиям и способность к адаптивному ответу на периодические раздражители [8]. Мезор пленкообразующей активности у всех изучаемых клинических изолятов составил 2,6±0,01 (р < 0,05). Амплитуда колебаний показателя выросла в 4,6 раз по сравнению с музейными штаммами. Представленные результаты модифицированным макрометрическим методом согласуются с данными, полученными авторами при изучении адгезии микроорганизмов экспресс-методом и развернутым методом В.И. Брилиса и соавт., 1986 г. [16]. Предложенной методикой доказано, что последовательность и согласованность формирования пленок клиническими изолятами Сandida sp. во времени принципиально не зависят от вида гриба и, возможно, данный механизм адаптации закономерен и является характерным признаком биологической активности дрожжевых патогенов.

Подход к инфекции с позиции хронобиологии расширяет представления о физиологии грибов. В ходе исследования установлены ритмометрические маркеры патогенности штамма — это вклад ритма и амплитудно-фазовая характеристика изучаемого свойства, которое не является стационарным — и дают возможность отличать патологические нарушения от приспособительных изменений [3, 4, 25].

Анализ хронопоказателей активности пленкообразования клинических изолятов и эталонных штаммов Сandida sp. показал, что у грибов, выделенных из организма человека, изменялся вклад ритма, мезор и амплитуда колебаний функции повышались в направлении «эталонные штаммы → клинические изоляты». Критерий Манна–Уитни у С. albicans составил 29, C. tropicalis — 26, C. krusei — 30 (р < 0,05).

Выявленная закономерность согласуется с данными биопленкообразования, полученными на силиконовых моделях. Доказано методами конфокальной сканирующей лазерной и электронной микроскопии, что биопленки С. albicans состояли из слоев бластоспор с плотно лежащей матрицей из полисахаридов. Биопленки С. non-albicans имели меньший объем, чем пленки С. albicans, и содержали только бластоспоры, собранные в одну группу. Полученные результаты свидетельствовали, что С. albicans формирует количественно большую и структурно более сложную биопленку, чем грибы Candida non-albicans [28]. У С. albicans межклеточный матрикс состоял на 57% из глюкозы, а в биопленке C. tropicalis преобладал гексозамин. Пленочные биологические образования у С. albicans легче отделялись от пластмассовых поверхностей с помощью обработки ферментом бета-1,3-глюканаза, чем C. tropicalis [5].

Заключение

Существование биопленок при хронических инфекциях требует совершенно новых подходов к их диагностике. Предложенный макрометрический метод решает задачи по ускорению и упрощению количественной оценки процесса биопленкообразования, увеличивает чувствительность, так как позволяет исключить ошибки, связанные с использованием полистеролового материала. Простота выполнения приведенной методики делает ее доступной для любой лаборатории.

Использование хронобиологического метода, на наш взгляд, открывает новые перспективы при изучении физиологии Сandida sp., так как дает возможность прогнозировать динамику состояния микроорганизма и учитывать особенности срочной и долговременной адаптации к разным факторам внешней среды. Выявление суточных ритмов биопленкообразующей активности у различных штаммов Сandida sp., открывает возможность управлять жизнеспособностью бактериально-грибковых ассоциаций и прогнозировать их устойчивость к различным антимикробным средствам.

Благодарности

Коллектив авторов выражает благодарность Тюменскому государственному медицинскому университету за поддержку в проведении исследования.

About the authors

Marina V. Nikolenko

Tyumen State Medical University

Email: nikolenko-marina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1099-0656

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Professor of the Department of Microbiology

Россия, 625023, Tyumen, Odesskaya str., 54

Natalya V. Baryshnikova

Tyumen State Medical University

Email: barnv7600@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-4920

Assistant Professor, Department of Microbiology

Россия, 625023, Tyumen, Odesskaya str., 54

Olga I. Malishevskaya

Tyumen State Medical University

Email: olgaivan1988@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8709-5281

PhD (Pharmacy), Associate Professor, Department of Pharmaceutical Disciplines

Россия, 625023, Tyumen, Odesskaya str., 54

Olga V. Enoktaeva

Tyumen State Medical University

Email: enoktaevaov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7256-3871

Assistant Professor, Department of Biology

Россия, 625023, Tyumen, Odesskaya str., 54

Ekaterina M. Vaseva

Tyumen State Medical University

Author for correspondence.
Email: yuga-21@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5556-3180

PhD (Pharmacy), Associate Professor, Department of Pharmaceutical Disciplines

Россия, 625023, Tyumen, Odesskaya str., 54

References

Supplementary files