Biological characteristics of the enteroaggregative escherichia coli ont:h30 18-726 (no. B-8857) strain isolated from a patient with ulcerative colitis and a new method of pcr identification

Full Text

Введение

В настоящее время в связи с внедрением и использованием молекулярно-генетических методов в лабораторную практику доступным становится изучение микробиома человека не только при инфекционной патологии, но и при различных полиэтиологичных нозологиях. Роль микробного фактора является дискутабельным вопросом в отношении воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) человека. Гипотеза, которая находится в процессе экспериментального подтверждения, заключается в выявлении специфического инфекционного агента, вызывающего заболевания, который не был обнаружен до настоящего времени. Также обсуждается вопрос о возникновении дисбаланса между индигенной микробиотой и слизистой оболочкой толстой кишки, который приводит к трансформации некоторых представителей нормобиоты, в частности E. coli [15]. Высокая пластичность генома E. coli способствует неконтролируемому формированию уникальных патогенных штаммов из комменсальных. Установлено, что распространенность штаммов-носителей генетических маркеров известных детерминант персистенции и патогенности в кишечной микробиоте здоровых лиц без признаков острого или хронического заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) не превышает 10%. При снижении концентрации и активности индигенной микробиоты в популяции E. coli могут произойти изменения, способствующие увеличению клонов потенциальных патогенов. Опасность таких микробиологических нарушений становится очевидной, если принять во внимание чрезвычайно широкий спектр факторов вирулентности E. coli: эндо- и экзотоксины, цитотоксины, колицины, адгезины, инвазины, а также антилизоцимная, антикомплементарная и гемолизирующая активность, способность подавлять фагоцитоз, гистоповреждающие ферменты и метаболиты, резистентность к антимикробным препаратам (АМП), способность к L-трансформации и др. [3, 14]. В последние годы обсуждается роль адгезивно-инвазивных E. coli (AIEC) в инициацию аутоиммунного процесса при болезни Крона (БК) [26]. Известно, что AIEC могут проникать и размножаться в макрофагах, вызывая высвобождение большого количества фактора некроза опухоли (TNFα), который вызывает воспаление кишечника, характерное для БК [23, 27]. При изучении причин возникновения язвенного колита (ЯК), который характеризуется поражением дистальных отделов толстой кишки, в последние годы также высказываются предположения о роли E. coli как возможного патобионта-инициатора заболевания [23, 27]. При среднетяжелом и тяжелом течении ЯК современные стандарты лечения регламентируют применение АМП [6, 11, 23].

Цель исследования: изучить биологические свойства штамма E. coli ONT:H30 18-726 (№ В-8857) и разработать новый способ детекции энтероагрегативных штаммов E. coli из биопсийного материала пациентов с гистоморфологическим диагнозом «язвенный колит».

Материалы и методы

Исследование было проведено на базе эндоскопического отделения Клиник Самарского государственного медицинского университета (г. Самара). Биопсийный материал в соответствии с критериями включения и исключения из исследования был получен в ходе стандартной эндоскопической процедуры при проведении колоноскопии 46 пациентам с гистоморфологически установленным диагнозом «язвенный колит» [4, 10]. Идентификацию штаммов E. coli проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-ToF MS) с использованием системы Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия) [1]. Чувствительность к 18 антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом с использованием агара Мюллера–Хинтон (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия) и дисков (Oxoid, Великобритания). Интерпретацию результатов проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» 2018 г. [7]. Чувствительность к 5 препаратам бактериофагов: «Бактериофаг колипротейный», «Пиобактериофаг поливалентный очищенный», «Секстафаг», «Пиобактериофаг поливалентный», «Пиобактериофаг комплексный», «Интести» (АО «НПО Микроген», Россия) проводили согласно действующим клиническим рекомендациям [9]. Для интерпретации результатов использовали показатели: R – устойчив (0/+), I — промежуточная чувствительность (++), S — чувствителен (+++/++++).

Принадлежность штаммов к диареегенным E. coli (DEC) проводили молекулярным методом с использованием набора реагентов «АмплиСенс^®Эшерихиозы – FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия) в режиме «реального времени» (амплификатор «СXT-1000», Bio-Rad, США). Подготовку библиотеки генома EAgEC проводили с помощью набора TrueSeq (Illumina Inc., США), секвенирование выполняли на платформе MiSeq (Illumina). Аннотацию генома проводили с помощью утилиты Prokka v. 1.11 и геномного сервера FAST. Для анализа последовательностей ДНК полных геномов штаммов E. coli использовали веб-сайт Центра геномной эпидемиологии (https://cge.cbs.dtu.dk/services). Поиск генетических детерминант патогенности, вирулентности, антибиотикорезистентности и установление антигенной характеристики штамма (О- и Н-антигенов) проводили с использованием онлайн сервисов: PathogenFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/PathogenFinder); VirulenceFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder); ResFinder 2.1 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ ResFinder); SerotypeFinder 1.1 (https://cge.cbs.dtu.dk/ services/SerotypeFinder).

Разработка детекции штаммов EAgEC, колонизирующих дно язвенной поверхности слизистой оболочки толстой кишки при ЯК, базировалась на ПЦР-методике и заключалась в выявлении уникального сочетания SNP-полиморфизмов гена глутаматдекарбоксилазы (gad) E. coli ONT:H30 18-726.

Результаты

Скрининг принадлежности штаммов к DEC, проведенный молекулярным методом, выявил наличие специфичных EAgEC участков ДНК в штамме E. coli 18-726. По культурально-ферментативным свойствам штамм EAgEC 18-726 характеризовался типичными видовыми признаками E. coli: давал положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную Фогеса–Проскауэра, не расщеплял мочевину, не образовывал сероводород и фенилаланиндезаминазу, не ферментировал инозит и адонит, не рос на цитратном агаре Симмонса, был индол-положительным, ферментировал маннит и глюкозу до кислоты и газа, обладал β-галактозидазной активностью. По ферментативным свойствам штамм проявлял вариабельность в отношении углеводов, спиртов и аминокислот (табл. 1).

 

Таблица 1. Основные ферментативные свойства штамма EAgEC 18-726, выделенного от пациента с язвенным колитом

Table 1. Main enzymatic properties of strain EAgEC 18-726 isolated from a patient with ulcerative colitis

Тест или cубстрат Assay or substrate	Штамм EAgEC 18-726 EAgEC 18-726 strain	Тест или субстрат Assay or substrate	Штамм EAgEC 18-726 EAgEC 18-726 strain
Лактоза Lactose	+	Дульцит Dulcite	+
Сахароза Sucrose	–	Сорбит Sorbitol	–
Арабиноза Arabinose	–	Салицин Salicin	–
Мальтоза Maltose	–	Орнитин Ornithine	+
Ксилоза Xylose	–	Лизин Lysine	+
Рамноза Ramnose	+	Аргинин Arginine	–

Примечание. «+» — положительная реакция; «–» — отрицательная реакция.

Note. “+” — positive reaction; “–” — negative reaction.

 

Результаты изучения чувствительности к АМП EAgEC 18-726 показали, что штамм в соответствии с международными критериями характеризовался фенотипом множественной резистентности (MDR) — резистентность к трем и более классам АМП. Резистентность была отмечена к β-лактамам (аминопенициллины, ингибитор-защищенные аминопенициллины, цефалоспорины III–IV поколения), хинолонам/фторхинолонам, аминогликозидам, тетрациклину, сульфаниламидам и триметоприму. Штамм сохранял чувствительность к карбапенемам (меропенем), хлорамфениколу и нитрофурантоину. Методом «двойных дисков» с цефтазидимом, цефотаксимом, цефепимом и амоксициллин/клавуланатом установлено, что штамм являлся продуцентом бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС).

Изучение спектра литического действия бактериофагов и их активности в отношении штамма EAgEC 18-726 выявило его фагорезистентность ко всем тестируемым препаратам (табл. 2).

 

Таблица 2. Чувствительность штамма EAgEC 18-726 к препаратам бактериофагов

Table 2. Sensitivity of strain EAgEC 18-726 to bacteriophage preparations

Бактериофаг Bacteriophage	Наличие лизиса Lysis	Результат Result
Колипротейный Coli-Proteus	–	R
Пиополивалентный очищенный Pyopolyvalent purified	1+	R
Секстафаг Sextaphage	–	R
Комплексный Complex	–	R
Интести Intesti	–	R

Примечание. «–» — отсутствие литической активности; «1+» — низкая литическая активность; R — нечувствителен к бактериофагу.

Note. “–” — lack of lytic activity; “1+” — low lytic activity; R — bacteriophage insensivity.

 

Анализ генома EAgEC 18-726 с помощью платформы SerotypeFinder 2.0 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/SerotypeFinder), онлайн-ресурса «Center for Genomic Epidemiology», показал, что штамм имел уникальную последовательность гена, кодирующего О-антиген, которая отличалась от 188 известных О-антигенов (ONT). По идентичности нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез Н-антигена, штамм принадлежал к серовару Н30. Таким образом, антигенная формула штамма EAgEC 18-726 выражалась как ONT:H30.

В табл. 3 представлены гены вирулентности штамма EAgEC ONT:H30 18-726. Результаты анализа на платформе VirulenceFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder) показали наличие генов вирулентности с идентичностью 100–99,9% референтным образцам: ген aap (антиагрегационный белок, дисперзин), ген aar (белок-регулятор транскрипционного активатора класса AraC/XylS), ген aggA (большая субъединица адгезионно-агрегационных фимбрий I типа), ген iss (белок устойчивости к бактерицидному действию сыворотки крови), ген capU (гомолог гексозилтрансферазы); с идентичностью 99,7–99,56% референтным образцам: ген aggC (периплазматический шаперон, сборщик начального этапа адгезивно-агрегационных фимбрий I типа) и ген aggD (шаперон, сборщик адгезивно-агрегационных фимбрий I типа); с идентичностью 98,95% — ген gad (глутамат декарбоксилаза) и идентичностью 98,17% — ген aggB (белок афимбриальной адгезивной оболочки энтеробактерий AfaD).

 

Таблица 3. Характеристика генов вирулентности штамма E. coli ONT: H30 18-726, кодирующих механизмы реализации факторов патогенности

Table 3. Characteristics of the virulence genes of E. coli ONT: H30 18-726 strain encoding mechanisms to enable pathogenicity factors

Ген Gene	Идентичность, % Identity, %	Референт/образец, п.н. Reference/sample, bp	Функция белка Protein function	Референс-номер Reference No.
aap	100	351/351	Антиагрегационный белок, дисперзин Anti-aggregation protein, dispersin	Z32523
aar	100	201/201	Белок-регулятор транскрипционного активатора класса AraC/XylS AraC/XylS class regulator protein of the transcriptional activator	SSI_AA794
aggA	100	516/516	Большая субъединица адгезивно-агрегационных фимбрий I типа type I adhesive-aggregation fimbriae large subunit	SSI_AA804
aggB	98,17	438/438	Белок афимбриально-адгезивной оболочки энтеробактерий AfaD Enterobacterial afimbrial-adhesive membrane AfaD protein	U12894
aggC	99,7	2311/2385	Периплазматический шаперон, сборщик начального этапа адгезионно-агрегационных фимбрий I типа Periplasmic chaperone, assembler of the initial stage for adhesion-aggregation type I fimbriae	AFRH01000026
aggD	99,56	687/759	Шаперон, сборщик адгезионно-агрегационных фимбрий I типа Chaperone, adhesion-aggregation type I fimbriae collector	U12894
capU	99,9	1016/1089	Гомолог гексозилтрансферазы Hexosyltransferase homologue	CU928145
gad	98,95	1243/1401	Глутаматдекарбоксилаза Glutamate decabroxylase	FN554766
iss	100	294/294	Устойчивость к бактерицидному действию сыворотки крови Resistance to blood serum bactericidal effect	CP001846

 

Анализ сборки геномных данных с использованием интернет-сервиса ResFinder 4.1 выявил совокупность генетических механизмов реализации устойчивости к антибиотикам, которые описаны в табл. 4.

 

Таблица 4. Характеристика генов штамма E. coli ONT: H30 18-726, кодирующих механизмы устойчивости к антибактериальным препаратам

Table 4. Characteristics of the E. coli ONT: H30 18-726 strain genes encoding mechanisms of antibacterial drug resistance

Гены резистентности Resistance genes	Идентичность, % Identity, %	Референт/ образец, п.н. Reference/ sample, bp	Контиг Contig	Референс-номер Reference No.
Бета-лактамы Beta-lactams
blaCTX-М-15	100	876/876	NODE_386_length_4574_cov_78.801483	AY04443 6
blaTEM-1B	100	861/861	NODE_474_length_3323_cov_77.119469	AY45
Аминогликозиды Aminoglycosides
ААС (3)-IIa	99,77	861/861	NODE_90_length_2624_cov_87.983994	X51534
ААС (6’)-Ib-кр	100	600/600	NODE_793_length_723_cov_95.589211	DQ30391 8
aadA1	100	789/789	NODE_120_length_24792_cov_89.782104	JQ48015 6
aadA5	100	789/789	NODE_380_length_1006_cov_86.854874	AF13736 1
APH (3”)-Ib	100	803/804	NODE_215_length_4521_cov_79.155052	AF02460 2
APH (3”)-Ib	99,88	804/804	NODE_215_length_4521_cov_79.155052	AF31347 2
APH (3”)-Ib	99,88	804/804	NODE_215_length_4521_cov_79.155052	AF32155 0
APH (3”)-Ib	99,88	804/804	NODE_215_length_4521_cov_79.155052	AF32155 1
АРН (6)-Id	100	837/837	NODE_215_length_4521_cov_79.155052	M28829
aadA1	100	789/789	NODE_120_length_24792_cov_89.782104	JQ48015 6
Макролиды Macrolides
mdf (A)	98.13	1233/1233	NODE_176_length_28514_cov_76.946098	Y08743
mph (A)	100	906/906	NODE_203_length_7502_cov_81.290855	D16251
Хлорамфеникол Chloramphenicol
catB3	100	442/633	NODE_741_length_781_cov_ 64.875801	AJ00981 8
catB3	100	442/633	NODE_741_length_781_cov_64.875801	U13880
Хинолоны/Фторхинолоны Quinolones/Fluorquinolones
gyrA p. S83A*	100	600/600	NODE_793_length_723_cov 95.589211	DQ303918
Сульфаниламиды Sulfonamides
sul1	100	840/840	NODE_203_length_7502_cov_81.290855	U12338
sul2	100	816/816	NODE_515_length_4637_cov_74.394867	AY03413 8
Тетрациклины Tetracyclines
tet (D)	100	1185/1185	NODE_474_length_3323_cov_77.119469	AF46707 7
Триметроприм Trimetroprim
dfrA1	100	474/474	NODE_120_length_24792_cov_89.782104	X00926
dfrA17	100	354/474	NODE_309_length_1052_cov_83.835548	AM9372 44
dfrA17	100	354/474	NODE_309_length_1052_cov_83.835548	FJ460238

Примечание. * — мутации в генах.

Note. * — genes mutation.

 

Штамм E. coli ONT:H30 18-726 был депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ с присвоением регистрационного номера В-8857 и выдачей свидетельства о депонировании от 25.11.2019 г. № 193.

Представленность широкого спектра генов, кодирующих факторы вирулентности, наличие значительного количества мобильных генетических элементов, а также множественная резистентность к АМП и фагоустойчивость E. coli ONT:H30 18-726 обосновали необходимость в создании способа выявления аналогичных штаммов в биологическом материале пациентов с ЯК. Метод основан на выявлении уникального сочетания SNP-полиморфизмов гена глутамат декарбоксилазы (gad), расположенных в диапазоне NZ_GL896790.1:2763405–2763726 штамма E. coli ONT:H30 18-726 с использованием четырех специфических праймеров. Нуклеотидные последовательности праймеров представлены в табл. 5. Проведение ПЦР возможно как в режиме «реального времени», так и с последующей электрофоретической детекцией.

 

Таблица 5. Нуклеотидные последовательности праймеров для детекции SNP-полиморфизмов гена gad

Table 5. Nucleotide primer sequences for detecting SNP polymorphisms in the bacterial gad gene

Праймеры первой реакционной cмеси First reaction mix primers	Праймеры второй реакционной смеси Second reaction mix primers
F1: CGTCAGAACCTGGCCACTTTT	F2: TCGACCTGCGTTGCGTAAAC
R1: TATCCGTTGGTTTGCCTGCA	R2: CATCCCAGTAGCGGGCG
Размер ПЦР-продукта: 292 п.н. PCR product size: 292 bp	Размер ПЦР-продукта: 240 п.н. PCR product size: 240 bp

Примечание. Реакции с обеими парами праймеров проводятся отдельно друг от друга.

Note. PCR with both pairs of primers is carried out separately.

 

Состав реакционной смеси: очищенная вода, пара праймеров — 0,4 мкМ каждого, 1х буфер для амплификации, концентрация Mg²⁺ — 2,5 мМ, 1x SybrGreen для детекции в «режиме реального времени», 1х раствор полимеразы без экзонуклеазной активности, матрица ДНК — 5 мкл на 20 мкл реакционной среды, режим амплификации приведен в табл. 6.

Таблица 6. Режимы амплификации для детекции SNP-полиморфизмов гена gad

Table 6. Amplification modes for detection of gad gene SNP polymorphisms

№ цикла Cycle No.	Температура, °С Temperature, °C	Время Time	Количество циклов Number of cycles
1	95	5 мин 5min	1
2	95	30 с 30 s	40
3	65	65 с 65 s
4	72	20 с 20 s
5	72	5 мин 5 min	1

При детекции в режиме «реального времени» о наличии EAgEC свидетельствует повышение интенсивности флуоресценции по каналу FAM в обеих реакционных смесях одновременно, при этом пороговое значение цикла (Ct) — 35. При гель-электрофоретической детекции о наличии энтероагрегативного штамма E. coli можно судить по наличию продуктов амплификации специфических длин в обеих реакционных смесях одновременно: для первой реакции — 292 п.н., для второй — 240 п.н. [8]. Получен патент на изобретение «Способ выявления энтероагрегативных штаммов E. coli из толстой кишки у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника» (№ 2758475 RU от 28.10.2021) [8].

Обсуждение

Воспалительные заболевания кишечника, к которым относится ЯК, являются одной из наиболее серьезных проблем гастроэнтерологии во всех странах. По тяжести течения, частоте осложнений и летальности они занимают ведущее место в структуре болезней [11, 18]. Несмотря на многолетнюю историю изучения, этиология ЯК остается неизвестной, а патогенез недостаточно раскрытым [11].

Патогенные E. coli характеризуются широким спектром факторов вирулентности, включая адгезины, токсины, сидерофоры, капсулы и инвазины и др. Такие штаммы могут вызвать патологический процесс практически каждого органа или системы. Не исключена роль E. coli при хронических заболеваниях ЖКТ, в инициации и поддержании патологического воспалительного процесса, а также язвенно-некротических реакций [16]. Генетическое разнообразие E. coli, наличие специфических генов вирулентности позволяют предположить этиологическую значимость этих микроорганизмов в развитии ЯК [5, 28]. Штаммы EAgEC — одной из шести патогрупп DEC — вызывают острые кишечные инфекции у детей и взрослых во всех странах. Метааналитические эпидемиологические исследования выявили статистически значимую связь EAgEC с диареями: острыми, продолжительными, хроническими, диареями ВИЧ-инфицированных и путешественников [17]. Длительная персистенция EAgEC может вызывать хроническое воспаление кишечника, снижая его абсорбционную функцию, приводя к алиментарной дистрофии, анемии, гипопротеинемии, нарушениям физического и когнитивного состояния [20]. EAgEC, в отличие от других патогенных E. coli, характеризует широкая вариабельность генетических маркеров вирулентности [16, 24]. Это указывает на то, что вызывать воспалительный процесс способны только штаммы EAgEC, несущие специфические гены вирулентности. В то же время ни один из факторов вирулентности не был неопровержимо связан с вирулентностью EAgEC, а гены, кодирующие их, не присутствуют равномерно во всех изолированных штаммах. Эксперименты in vitro, in vivo и ex vivo убедительно показали, что EAgEC могут адгезироваться на эпителиоциты тощей, подвздошной и толстой кишки, образуя прочную биопленку с последующим цитотоксическим и провоспалительным действием. Патогенез заболевания включает три этапа: а) обильное прилипание к слизистой оболочке кишечника — адгезия и колонизация; б) продукция цитотоксинов и энтеротоксинов; в) индукция воспаления слизистой оболочки. Воспаление, вызванное EAgEC, является результатом обильной колонизации слизистой оболочки кишечника [12, 19].

Проведенный анализ полногеномного секвенирования показал, что у штамма E. coli ONT:H30 18-726 (№ В-8857) присутствует несколько детерминант, ассоциированных с адгезией и колонизацией — aggA, aggВ, aggС и aggD, кодирующих активатор транскрипции экспрессии хромосомных и плазмидо-кодируемых факторов вирулентности, включая антиагрегационный белок дисперзин (ген aap), который способствует проникновению бактерии через слизь крипт толстой кишки [25]. Данный метаболический путь может привести к генерализации инфекции — развитию сепсиса — за счет блокировки фибриногена, который участвует в механизме тромбоза — защитной реакции организма при сепсисе [2, 21]. Вирулентный адгезивный аппарат дополнительно представлен геном агрегативного регулона — aar, который обеспечивает активность более 40 генетических элементов, ответственных за взаимодействие с эпителиальными клетками кишечника человека [22]. У изученного штамма был идентифицирован ген iss, обеспечивающий устойчивость к бактерицидному действию сыворотки крови, наличие которого можно расценивать как потенциал гематогенной генерализации инфекции или существенного ухудшения течения основного заболевания, в настоящем случае — ЯК.

К одним из основных препаратов для лечения ЯК и поддержания ремиссии относятся АМП, поэтому проблема антибиотикорезистентности представляется особо актуальной. Проведенное исследование показало, что штамм E. coli ONT:H30 18-726 (№ В-8857) характеризовался множественной устойчивостью к АМП разных групп. Резистентность к цефалоспоринам III–IV поколения обусловлена продукцией эпидемически значимой глобально распространенной в популяции грамотрицательных бактерий цефалоспориназы CTX-M15. Низкая литическая активность и полная фагоустойчивость к биологическим препаратам — бактериофагам — в отношении изученного штамма предполагает невозможность применения отечественных препаратов к элиминации данного патогена при эмпирической терапии ЯК. Фагоустойчивость к биологическим агентам отмечается в литературе и характеризуется развитием резистентности к препаратам данного типа, а также необходимостью регулярного обновления фармакологического набора фаготерапевтических препаратов [13].

Таким образом, данные, полученные по результатам полногеномного секвенирования штамма EAgEC, выделенного от пациента с гистологически подтвержденным диагнозом «язвенный колит», свидетельствуют, что традиционные культуральные методы изучения штаммов E. coli, колонизирующих кишечник пациентов с ЯК, включая определение чувствительности к АМП, подходят только для фенотипической характеристики выделенного изолята. В виду этого одним из перспективных направлений в детекции EAgEC у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, а также в изучении механизмов резистентности к АМП, становится применение современных генетических методик. Использование дополнительных методов позволит получить информацию, необходимую клиницисту для принятия решения о назначении адекватной этиотропной терапии пациентов с ЯК. Для получения достоверных данных об этиологии ЯК и роли EAgEC в патогенезе воспаления толстого кишечника требуется проведение дальнейших исследований. Особенно это становится актуальным в связи с широким распространением среди больных ЯК грамотрицательных бактерий с фенотипом множественной резистентности к АМП, продуцирующих БЛРС.

Благодарности

Особая благодарность выражается Никите Андреевичу Буланцеву — выпускнику магистратуры SCAMT ИТМО (Санкт-Петербург) за помощь в обработке массивов сиквенс-данных.

About the authors

Maria A. Makarova

St. Petersburg Pasteur Institute; Mechnikov North-Western State Medical University

Email: makmaria@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3600-2377
SPIN-code: 7915-1758

DSc (Medicine), Senior Researcher, Laboratory of Enteric Infections; Associate Professor, Department of Medical Microbiology

Россия, St. Petersburg; Saint-Petersburg

Egor E. Kruglov

Reaviz Medical University; State Research and Test Institute of Military Medicine

Email: krugegr@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-6955-1025
SPIN-code: 7994-1414

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Clinical Medicine; Researcher, Research and Testing Department

Россия, Самара; Санкт-Петербург

Lidia A. Kaftyreva

Saint-Petersburg Pasteur Institute; Mechnikov North-West State Medical University

Author for correspondence.
Email: kaflidia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0989-1404
SPIN-code: 6721-7873

DSc (Medicine), Leading Researcher, Typhoid Epidemiology Research Group; Professor, Department of Medical Microbiology

Россия, St. Petersburg; St. Petersburg

References

Supplementary files