Resistance factors of klebsiella pneumoniae bacteria during COVID-19 pandemic

Olga N. Kolotova; Колотова Ольга Николаевна; L. V. Kataeva; Катаева Л. В.; I. V. Bakshtanovskaya; Бакштановская И. В.; T. F. Stepanova; Степанова Т. Ф.; K. B. Stepanova; Степанова К. Б.

doi:10.15789/2220-7619-RFO-1837

Resistance factors of klebsiella pneumoniae bacteria during COVID-19 pandemic

Authors: Kolotova O.N.¹, Kataeva L.V.¹, Bakshtanovskaya I.V.¹, Stepanova T.F.¹, Stepanova K.B.¹
Affiliations:
1. Tyumen Region Infection Pathology Research Institute
Issue: Vol 12, No 3 (2022)
Pages: 563-568
Section: SHORT COMMUNICATIONS
Submitted: 02.12.2021
Accepted: 19.03.2022
Published: 04.07.2022
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/1837
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-RFO-1837
ID: 1837

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Multidrug-resistant K. pneumoniae bacterial strains producing extended range of beta-lactamases or carbapenemases are of serious clinical concern. The aim of the study was to determine the resistance factors of K. pneumoniae strains isolated from the lower respiratory tract of patients diagnosed with community-acquired pneumonia during the COVID-19 pandemic. Materials and methods. The study of resistance to antimicrobial drugs included 138 strains of K. pneumoniae isolated from the sputum of patients treated in infectious diseases monohospitals in the city of Tyumen and the Tyumen region within the period from May 2020 to June 2021. Among the strains examined, 51.4% of them were isolated from SARS-CoV-2 positive patients. The presence of resistance genes was determined by PCR in 71 strains of K. pneumoniae (34 strains from COVID-19-positive and 37 strains from COVID-19-negative patients). Identification of isolated bacterial strains was carried out according to the protein spectra by using a desktop time-of-flight mass spectrometer with matrix laser desorption MALDI-TOF MS (Bruker, Germany). The belonging of the strains to the hypermucoid phenotype was determined using the string test. Sensitivity to antimicrobial drugs was assessed in the disk diffusion method on Muller–Hinton medium. The sensitivity of culture strains to bacteriophage preparations was determined by the drop method (spot-test). In the study, we used “Polyvalent Sextaphage Pyobacteriophage” and “Purified Polyvalent Klebsiella Bacteriophage” (JSC NPO Microgen, Russia). Detection of resistance genes to beta-lactam antibiotics by real-time PCR was carried out using the BakRezista kit (OOO DNA-technology, Russia). Results. The results of the study evidence that K. pneumoniae bacteria isolated from COVID-19-positive and COVID-19-negative patients diagnosed with community-acquired pneumonia displayed a high resistance to antimicrobial drugs and commercial phage-containing drugs. Resistance of K. pneumoniae strains was recorded from 50% (to aminoglycosides and carbapenems) to 90% (to inhibitor-protected penicillins). Sensitivity to bacteriophages was noted on average in no more than 20% of strains. It is important to emphasize that strains isolated from COVID-19-positive patients more often showed a hypermucoid phenotype, suggesting a high bacterial virulence, and also showed greater resistance to all groups of antibacterial drugs examined in the study, which is confirmed by the presence of resistance genes of the ESBL group and carbapenemase. The results of the study suggest that the high level of resistance of K. pneumoniae strains isolated from COVID-19-positive patients is associated with immunosuppression provoked by the SARS-CoV-2 virus, which contributes to their colonization by more virulent strains.

Keywords

pneumonia, COVID-19, Klebsiella pneumoniae, resistance factors, antimicrobial sensitivity, beta-lactamase

Full Text

Введение

Пандемия новой коронавирусной инфекции сопровождается высоким уровнем заболеваемости внебольничной пневмонией (ВП), вызванной ассоциацией возбудителей с высокой долей осложненных и затяжных случаев [1]. Разрушение иммунных клеток вирусом SARS-CoV-2 делает пациентов уязвимыми к вторичным бактериальным инфекциям. Независимым фактором риска неблагоприятного исхода пневмонии является выделение из биоматериала возбудителей с множественной антимикробной устойчивостью — ESKAPE-патогенов [3, 5, 15]. В настоящее время наблюдается рост числа случаев ВП, обусловленной представителями условно-патогенных бактерий, в частности K. pneumoniae [2, 13].

Наличие капсулы у штаммов K. pneumoniae, обеспечивает способность бактерий ускользать от иммунного ответа организма, включая защиту от фагоцитоза, катионных антимикробных пептидов, системы комплемента [8, 11]. Гиперпродукция капсульных полисахаридов значительно повышает вирулентность бактерий. Инфекции, вызванные гипермукоидными штаммами, считаются особо тяжелыми и могут приводить к летальному исходу [10, 12, 14]. Еще одним фактором вирулентности является выработка ферментов бета-лактамаз. Бета-лактамазы содержат в своей структуре циклическую амидную связь и способны расщеплять пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы и монобактамы. По механизму действия все бета-лактамазы делятся на сериновые (классы A, C, D) и металло-бета-лактамазы (класс B) [9, 10]. К бета-лактамазам класса А расширенного спектра действия относятся TEM, SHV, CTX. Характерные для K. pneumoniae карбапенемазы относятся к сериновым бета-лактамазам: молекулярный класс А (КРС), D (OXA-48) и к металло-бета-лактамазам класса В (NDM, VIM, IMP) [4, 6]. Наличие карбапенемаз у штаммов бактерий в настоящее время считается серьезной проблемой и является важным маркером экстремальной антибиотикорезистентности, поскольку ассоциируется с устойчивостью к большинству не бета-лактамных препаратов [4, 6, 7].

Целью данного исследования было определение факторов резистентности штаммов K. pneumoniae, изолированных из нижних дыхательных путей пациентов с диагнозом «внебольничная пневмония» в период пандемии COVID-19.

Материалы и методы

Проанализировано 2046 проб содержимого нижних дыхательных путей от пациентов, находящихся на амбулаторном и стационарном лечении в моногоспиталях г. Тюмени, с подтвержденным диагнозом ВП. Средний возраст пациентов составил 60 лет. Клинический материал получен в период с мая 2020 г. по июнь 2021 г.

Отбор и транспортировка биологического материала для лабораторного исследования проводились в соответствии с СанПин 3.3686- 21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». Бактериологическое исследование мокроты проведено в соответствии с МР 4.2.0114-16 «Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии». Идентификация выделенных штаммов бактерий выполнялась с помощью настольного времяпролетного масс-спектрометра с матричной лазерной десорбцией MALDI-ToF MS (Bruker, Германия) по белковым спектрам и оценивалась по высоким показателям достоверности (score более 2).

Исследование фенотипа бактерий, чувствительности к бактериофагам и антимикробным препаратам (АМП) проведено на 138 штаммах K. pneumoniae, изолированных из мокроты пациентов с диагнозом ВП.

Гипермукоидный фенотип штаммов определяли при постановке string-теста. Если при снятии колонии, выращенной на 5% кровяном агаре, за бактериологической петлей образовывался «тяж» высотой более 5 мм от поверхности питательной среды, тест считали положительным.

Бактериальную суспензию для оценки резистентности к антимикробным препаратам и препаратам бактериофагов готовили по стандартной методике с оптической плотностью 0,5 по МакФарланду. Резистентность к антимикробным препаратам определяли диско-диффузионным методом на среде Мюллера–Хинтон (HiMedia, Индия), результаты анализировали в соответствии с действующими нормативными документами (Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам», версия-2018-03, и МУК 4.2.1890-04). В исследование взяты диски с амоксициллин-клавулановой кислотой, ципрофлоксацином, амикацином, цефтазидимом, цефотаксимом, имипенемом, меропенемом производства ООО «НИЦФ», Россия. Определение чувствительности штаммов культур к препаратам бактериофагов проводили капельным методом (spot-test), для этого использовали «Секстафаг пиобактериофаг поливалентный», «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный» (АО «НПО “Микроген”», Россия). Литическую активность фага оценивали по количеству «крестов», «+++» и «++++» принимали за высокую чувствительность штаммов к исследуемым бактериофагам.

Определение наличия генов резистентности методом ПЦР проведено на 71 штамме K. pneumoniae (34 штамма от ковидпозитивных и 37 штаммов от ковиднегативных пациентов). ДНК из суточной культуры бактерий выделяли с помощью набора «Проба-НК/50» (ООО «ДНК-Технология», Россия). Обнаружение генов резистентности молекулярных классов А, B, D к бета-лактамным антибиотикам методом ПЦР в режиме реального времени осуществляли набором «БакРезиста», ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия).

Все пробы отделяемого нижних дыхательных путей исследованы методом ПЦР на наличие вируса SARS-CoV-2. Для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 использовали тест-системы «Вектор-ПЦРрв-2019-nCoV-RG» (ГНЦ «Вектор», Россия), «SARS-CoV-2/SARS-CoV» («ДНК-технология», Россия).

Результаты и обсуждение

Бактериологическое исследование отделяемого нижних дыхательных путей показало, что бактерии K. pneumoniae выделяются в 5,9% у ковидпозитивных пациентов и в 10,4% случаев у ковиднегативных. Практически все изоляты K. pneumoniae находились в ассоциациях с другими бактериями, такими как грибы рода Candida, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium. В чистой культуре штаммы K. pneumoniae у ковидпозитивных пациентов изолированы в 0,8%, у ковиднегативных — 2,3% случаев.

Колонии исследуемых бактерий K. pneumoniae на среде Эндо определены как блестящие, выпуклые, слизистые, с ровным краем. На кровяном агаре колонии средних размеров, слизистые, с ровным краем, зону гемолиза не образовывали. Все штаммы разлагали глюкозу, сахарозу, маннит, цитрат, не обладали подвижностью. На основании string-теста выявлено 13,8% изолятов с гипермукоидным фенотипом, при этом 80% из них были выделены от ковидпозитивных пациентов.

При определении чувствительности к препаратам бактериофагов показано, что «Секстафаг пиобактериофаг поливалентный» обладает лучшей литической активностью в отношении исследуемых культур K. pneumoniae в сравнении с препаратом «Бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный». Так, 20,6% штаммов проявляли чувствительность к «Секстафагу пиобактериофагу поливалентному» и только 5,9% были чувствительны к «Бактериофагу клебсиелл поливалентному очищенному».

Исследование чувствительности к АМП диско-диффузионным методом штаммов K. pneumoniae, изолированных от ковидпозитивных пациентов, выявило резистентность к ингибитор-защищенным пенициллинам (амоксициллин/клавулановая кислота) более чем в 90% случаев; резистентность к фторхинолонам (ципрофлоксацин), цефалоспоринам III поколения (цефотаксим, цефтазидим) составила более 80%. Резистентность их к аминогликозидам (амикацин) и карбапенемам (имипенем, меропенем) выявлена у половины штаммов. Штаммы K. pneumoniae, изолированные от ковиднегативных пациентов, обладали резистентностью ко всем перечисленным группам АМП. Она составила в среднем от 50 до 70% (рис.).

Рисунок. Резистентность штаммов K. pneumoniae к антибиотикам (%)

Сравнительная характеристика по частоте обнаружения и уровню резистентности бактерий K. pneumoniae, изолированных от ковидпозитивных и ковиднегативных пациентов свидетельствует о том, что ковидпозитивные пациенты контаминированы ими почти в 2 раза реже, но резистентность их в 1,3 раза выше.

Молекулярно-генетическими методами показано, что 94,1% исследованных штаммов, изолированных от ковидпозитивных и 89,2% — от ковиднегативных пациентов, являются продуцентами бета-лактамаз расширенного спектра действия класса А. Из них ведущее место занимают гены резистентности SHV и TEM. Вместе с тем 32,3% изолятов ковидпозитивных пациентов и 35,1% штаммов ковиднегативных пациентов обладали тремя генами бета-лактамаз класса А (SHV, ТЕМ, СТХ-М-1). При этом наличие ESBL, выявленных диско-диффузионным методом, в среднем составило 10%. Обнаружено несколько типов карбапенемаз: Нью-Дели металло-бета-лактамазы (NDM) и оксациллиназы (OXA-48, OXA-51, OXA-23, OXA-40). У штаммов, выделенных от ковиднегативных пациентов, гены OXA-48 определялись в 2 раза чаще. Гены резистентности Klebsiella pneumoniae карбапенемаза (KPC) выявлялись в 1,4 раза чаще у ковиднегативных пациентов, что составило 89,2% (табл.).

Таблица. Распределение генов бета-лактамаз штаммов K. pneumoniae, изолированных из мокроты пациентов с диагнозом «внебольничная пневмония»

Table. Distribution of beta-lactamase genes in K. pneumoniae strains isolated from sputum of patients diagnosed with community-acquired pneumonia

Бета-лактамазы Beta-lactamase				Штаммы *K. pneumoniae* (n = 71) K. pneumoniae strains
				Ковидпозитивные COVID-positive (n = 34)		Ковиднегативные COVID-negative (n = 37)
				абс. abs.	%	абс. abs.	%
Сериновые Serine	Класс Class	А	CTX-M-1	13	38,2	16	43,2
			TEM	23	67,6	26	70,3
			SHV	32	94,1	33	89,2
			KPC	22	64,7	33	89,2
		D	OXA-40	0	0	1	2,7
			OXA-51-like	3	8,8	1	2,7
			OXA-23-like	1	2,9	2	5,4
			OXA-48-like	5	14,7	11	29,7
Металло-бета-лактамазы Metal-beta-lactamase		B	NDM	4	11,7	1	2,7

Из 10 штаммов, изолированных от ковидпозитивных, и 5 штаммов ковиднегативных пациентов, чувствительных к АМП и обладающих гипермукоидным типом, методом ПЦР выявлены образцы, несущие гены ESBL: SHV, TEM, СТХ-М, карбапенемазы КРС и оксациллиназы OXA-48.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что бактерии K. pneumoniae, изолированные от ковидпозитивных и ковиднегативных пациентов с внебольничной пневмонией, обладали высокой резистентностью к АМП и коммерческим фагосодержащим лекарственным препаратам. Резистентность штаммов K. pneumoniae регистрировалась от 50% (к аминогликозидам и карбапенемам) до 90% (к ингибитор-защищенным пенициллинам). Чувствительность к бактериофагам отмечалась не более чем у 20% штаммов. Важно подчеркнуть, что штаммы, изолированные от ковидпозитивных пациентов, чаще проявляли гипермукоидный фенотип, предполагающий высокую вирулентность бактерий, а также отличались большей резистентность ко всем взятым в исследование группам АМП, что подтверждается наличием генов резистентности группы ESBL и карбапенемаз. Полученные результаты исследования позволяют предположить, что высокий уровень резистентности штаммов K. pneumoniae, изолированных от ковидпозитивных пациентов, связан с иммунодепрессией, спровоцированной вирусом SARS-CoV-2.