Lassa fever. Part 2. Laboratory diagnostics, treatment, development of medications

Full Text

Лихорадка ласса. Часть 2. Лабораторная диагностика, лечение, разработки лекарственных препаратов*

Введение

Глобализация и скоростные средства передвижения способствуют распространению инфекций, опасных для человека. Патогены, передаваемые воздушно-капельным путем, такие как поксвирусы, вирусы гриппа, Нипах и Ласса обладают пандемическим потенциалом. Ярким примером в настоящее время является коронавирус SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) [35], который вызвал пандемию коронавирусной болезни в 2019 г. (coronavirus disease, COVID-19) [54]. По данным ВОЗ на 14.12.2021 г., COVID-19 охватила уже 223 страны и территории, где зарегистрировано 269 млн подтвержденных случаев, погибли более 5,3 млн человек [68].

Эндемичность лихорадки Ласса (ЛЛ) ограничена ареалами обитания грызунов вида «африканская многососковая крыса» (Mastomys natalensis) в Западной Африке, где заражение человека происходит, в основном, при непосредственном контакте с выделениями инфицированных животных, оставленными на продуктах питания или попавшими в питьевую воду. Но передача вируса Ласса (Lassa virus, LASV) может происходить также и от человека к человеку через инфицированную кровь или другие жидкости организма [1, 13, 65], так как больной человек является источником инфекции довольно длительное время — в течение двух месяцев [13]. Описаны импортированные случаи ЛЛ, в результате чего из 35 заболевших человек (это путешественники или специалисты разных профессий, вернувшиеся на родину) погибло почти 20% [16, 49]. При этом в Германии зафиксированы факты вторичной передачи LASV врачам как от внешне здорового пациента, но оказавшегося инфицированным [40], так и при вскрытии тела 40-летней медсестры, погибшей в результате ЛЛ после эвакуации из Того в тяжелом состоянии [52].

Клиническая диагностика ЛЛ сложна, так как заболевание проявляется неспецифическими симптомами, характерными и для других эндемичных инфекций (желтая лихорадка и денге, малярия, брюшной тиф и др.) [15, 66]. К таким симптомам относятся повышение температуры тела, недомогание, боль в животе, рвота, головная боль и миалгия [19]. Кроме того, для большинства экономически слабо развитых стран Африки характерно неудовлетворительное состояние лабораторной сети, что так же усложняет выявление возбудителя. Дерматологические проявления в виде сыпи, связанные с отложением иммунных комплексов в кожных капиллярах, характерны как для ЛЛ, так и для желтой лихорадки, оспы обезьян, лихорадок Чикунгунья, денге, Зика и болезни, вызванной вирусом Эбола (БВВЭ). Появление макулопапулезной и эритематозной сыпи описывается в настоящее время и у некоторых заболевших COVID-19, поэтому кожные проявления должны быть дифференцированы по тонким признакам для каждой болезни [20].

Из-за контагиозности и высокой летальности среди тяжело заболевших, LASV классифицирован ВОЗ как патоген категории А с потенциальной угрозой его использования для биотерроризма. Кроме того, в cоответствии с «Планом исследований и разработок….» этой организации, LASV включен в список патогенов с эпидемическим потенциалом [79]. Дифференциальная диагностика ЛЛ важна, так как в качестве средства для лечения может быть экстренно применен противовирусный препарат рибовирин [67]. Известно, что рибавирин эффективен, если его прием начат в дебюте болезни [56]. Но важно отметить, что описаны побочные действия препарата — это развитие анемии и нарушение функции почек [38, 70]. Зарегистрированные вакцины для профилактики ЛЛ отсутствуют [46], поэтому актуальны подходящие методы лечения, снижающие токсичность рибовирина. Кроме того, необходимы разработки эффективных и безопасных терапевтических препаратов [42, 53, 57, 67]. Более подробно современные литературные данные по этиологии, эпидемиологии и клинической картине лихорадки Ласса представлены в первой части обзора [2].

Иммунитет и выявляемые биологические маркеры при ЛЛ

Реакция организма человека на инфицирование LASV остается пока не очень понятной. При большинстве других вирусных инфекций первоначально вырабатываются антитела класса IgM, затем их количество резко уменьшается. Период реконвалесценции сопровождается увеличением концентрации антител класса IgG, которые сохраняются еще долгое время после того, как инфекция проходит. А в случае ЛЛ, по результатам некоторых ранних и современных наблюдений, показано, что инфекция может приводить к выработке IgM и IgG почти одновременно или IgG появляются в плазме крови даже раньше, чем IgM [36, 87]. Есть сообщение, что в сыворотках крови нормальных здоровых доноров, проживающих на неэндемичных по ЛЛ регионах Сьерра-Леоне, у которых в последнее время не было лихорадочных заболеваний, выявлены высокие уровни IgM, специфичных к LASV, что позволяет предположить, что наличие IgM действительно может не коррелировать с острой инфекцией [41]. И вопреки иммунологической догме показано, что IgM, специфичные к LASV, могут сохраняться у переболевших в течение многих лет [23].

Виремия является основным показателем острой инфекции при заражении LASV [23]. Поэтому для раннего диагностирования ЛЛ предпочтительными методами являются ОТ-ПЦР по определению вирусных РНК [18, 28, 29, 64] или методы ИФА для выявления антигенов [18, 21, 41, 44, 76].

Методы научных исследований LASV и лабораторной диагностики ЛЛ

Сбор, хранение и обращение с образцами, содержащими LASV, требуют соблюдения мер предосторожности по уровню биобезопасности, аналогичному при работе с вирусом Эбола (Ebola virus, EBOV) [77]. По Санитарным правилам РФ LASV относится к 1 группе патогенности [11]. В связи с этим верификация диагноза «лихорадка Ласса», а тем более научные исследования с возбудителем болезни, проводятся только в специализированных центрах с высоким уровнем биозащиты. По стандартам западных стран это наивысший, четвертый, уровень безопасности — BSL-4 (Biosafety level) [21]. В РФ такая работа возможна в учреждениях противочумной системы Роспотребнадзора [8] методами, не требующими накопления возбудителя. В полном объеме научные исследования проводятся в референс-центрах этого ведомства по мониторингу за экзотическими, редко встречающимися и новыми инфекционными болезнями, например, во ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» [9], а также в научных организациях Министерства обороны [14]. Наличие лабораторий уровня BSL-4 во всем мире ограничено, и это, возможно, привело к ограничению исследований по разработке и валидации тест-систем для диагностирования ЛЛ с использованием инфекционного материала [66]. По рекомендации ВОЗ, если отсутствует соответствующее обеспечение для соблюдения мер предосторожности, образцы с подозрением на содержание LASV могут быть инактивированы и подготовлены к анализу в боксе биологической безопасности класса II/III [66]. Инактивация вируса достигается при нагревании биологического образца до 60°C в течение 60 мин. Рекомендуется также использовать сочетанную термическую и химическую инактивацию. В зависимости от предполагаемого последующего тестирования биологического материала (например, молекулярно-генетического или иммунохимического обнаружения патогена, клинических лабораторных тестов и т. д.) выбирают различные методы химической инактивации с использованием растворов, содержащих соли гуанидина, например, тризол и тритон X-100 [66]. Гамма (γ)-облучение также эффективно для инактивации LASV в жидких и высушенных образцах. Но поскольку доза радиации, поглощаемая вирусом, изменяется в зависимости от температуры нагревания [31], для подтверждения инактивации требуется обязательное эмпирическое тестирование биобезопасности образца [66].

С 1970 г. клинический диагноз ЛЛ стали подтверждать иммунохимическими анализами с использованием антигена LASV, впервые выделенного в 1969 г. [24], и методом фиксации комплемента антителами сывороток крови реконвалесцентов [83]. Методы научных исследований LASV включают: анализы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) по обнаружению вирусной РНК, электронную микроскопию, выделение инфекционного вируса на культуре чувствительных клеток, реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), иммуноферментный (ИФА) и иммунохроматографический (ИХА) анализы по выявлению антител и/или антигена, а также иммуноблоттинг [7, 10, 27, 77]. Для диагностики ЛЛ в настоящее время используют, в основном, тест-системы на основе молекулярно-генетических методов [27, 66].

Электронная микроскопия

Морфологические характеристики LASV, относящегося к семейству Arenaviridae, позволяют с помощью электронной микроскопии проводить общую идентификацию этиологического агента аренавирусной инфекции — вириона сферической формы с диаметром от 70 до 150 нм, двойной липидной оболочкой и гладкой поверхностью с Т-образными шипами, состоящими из трех молекул гликопротеина (glycoprotein, GP) [65]. Вирионы содержат включения — крупные однородные гранулы размером 20–25 нм [58], представляющие собой нефункциональные клеточные рибосомы, что и послужило основой для наименования семейства — «areno» (песок) [65].

Выделение вируса на культуре чувствительных клеток и реакция непрямой иммунофлуоресценции

Для исследований используют образцы крови, мочи, рвотных масс, смывов из зева, спинномозговой и плевральной жидкостей заболевших или секционный материал органов (печени, селезенки, легких, почек, сердца и плаценты), полученный при вскрытии в случаях инфекции с летальным исходом. Наиболее ранний срок для выделения LASV из сыворотки крови и смывов из зева — третьи сутки, из мочи — девятые. Из сыворотки крови и смывов из зева вирус можно выделить вплоть до 19-х суток болезни, из мочи — до 32-х [47, 66]. Эндемичность ЛЛ в Сьерре-Леоне, Либерии и Гвинее в 1980 г. подтверждали с использованием метода РНИФ, используя меченые специфические антитела для выявления антигена в тканях погибших пациентов. Результаты гистопатологических исследований продемонстрировали тропизм LASV к клеткам тканей различных внутренних органов [48].

Для выявления инфекционного LASV, вне зависимости от его генотипа [47], используют культуру клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки), при инфицировании которой в течение 3-х суток после инокуляции появляются «бляшки» (очаги погибших клеток), и обычно к пятым суткам от заражения они четко определены, дискретны, имеют размер от 1,5 до 2,0 мм [81]. Цитопатическое действие (ЦПД) на чувствительные клетки биологического образца в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ), может указывать на присутствие инфекционного LASV, однако для подтверждения идентичности этого вируса необходимо использовать дополнительные методы, такие как детекция отдельных вирусных антигенов или цельных вирионов методами РНИФ и электронной микроскопии, а также выявление генетического материала с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [30].

Титрованием инфекционного материала на культуре клеток Vero в 50%-ных тканевых цитопатических дозах в миллилитре (ТЦПД₅₀/мл) количественно определяют виремию, и такой показатель может обеспечить дополнительную информацию о характеристике патогена, поскольку его концентрация в крови, в титре равном или выше 10³ ТЦПД₅₀/мл, как правило, приводит к летальному исходу при ЛЛ [47]. Но для получения результатов этот метод требует времени, по крайней мере, нескольких суток (в зависимости от концентрации инфекционных частиц в образце) и не доступен широко из-за необходимости принятия мер предосторожности BSL-4, что ограничивает его полезность для ранней диагностики ЛЛ [66].

Методом РНИФ вирусный антиген может быть обнаружен до развития его явного ЦПД на клетки [33]. Например, при использовании мышиных моноклональных антител (МКА) этим методом показано, что при инфицировании клеток Vero в дозе одна БОЕ/мл, максимальное накопление вирусных частиц происходит на третьи сутки [5]. При исследовании сывороток крови пациентов с подозрением на ЛЛ с октября 1996 г. по февраль 1998 г. в государственном госпитале г. Кенема в Сьерра-Леоне и четырех наблюдательных больницах в Гвинее было обнаружено, что методом РНИФ антитела выявлялись значительно раньше у впоследствии погибших пациентов, чем у выживших (на 9,3 и 14,1 день соответственно, р < 0,05). Интересно, что такой связи между выживаемостью пациентов и их антителами, выявленными в ИФА, отмечено не было [18]. На основе метода РНИФ в 2016 г. описано получение надежного набора по выявлению антител, специфичных к LASV и EBOV, для своевременной и дифференциальной диагностики особо опасных инфекций и организации противоэпидемических мероприятий в случае их завоза на территорию Республики Беларусь. В качестве положительного контроля при выявлении специфических человеческих антител на антигене LASV, фиксированном ацетоном в лизате инфицированных клеток Vero, использовали поликлональные антитела морских свинок, иммунизированных последовательно инактивированным и инфекционным вирусным препаратом в дозе 1000 БОЕ/животное [10].

Молекулярно-генетические методы исследования

В 2000 г. Bowen с соавт. опубликовали результаты молекулярно-генетических исследований по географической картине распространения ЛЛ на основании данных секвенирования последовательностей нуклеотидных оснований (н.о.) гена нуклеопротеина (nucleoprotein, NP) 54-х изолятов LASV. Оказалось, что нуклеотидная и, соответственно, белковая (по аминокислотным остаткам, а.о.) дивергенция среди вирусных изолятов достигает 27 и 15%, соответственно. Авторы также отметили, что, судя по полученной информации о последовательностях н.о. S-сегмента, LASV является вирусом с высокой генетической изменчивостью [22]. Известные в настоящее время вирусные изоляты генотипически разделены на cемь линий (I–VII) [51]. Такое разнообразие генотипов LASV, связанных с географическими ареалами, усложняет эффективный дизайн молекулярно-генетических методов диагностики ЛЛ. Использование праймеров, специфичных к определенной последовательности н.о. конкретного генотипа, идеально подходит для исследований его циркуляции в определенных странах/регионах. В контексте же экспортируемых случаев ЛЛ из нескольких стран, где она является эндемичной, для точной диагностики ЛЛ необходимо использовать несколько ПЦР-тест-систем [66] с набором праймеров, специфичных к наиболее консервативным участкам генома разных известных генотипов.

Геном LASV, как и гены других представителей семейства Arenaviridae, представляет собой молекулу РНК и состоит из двух сегментов — большого L (large) и малого S (small) размером 7 и 3,4 kb, соединенных консервативными комплементарными последовательностями на 3′- и 5′-концах. L-сегмент обладает амбисентной стратегией кодирования (т. е. имеет участки как негативно-, так и позитивно-нитевой РНК), кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (белок L) и матриксный цинк-связывающий Z-белок. S-сегмент генома кодирует NP, а также предшественник гликопротеина (glycoprotein precursor, GPC), состоящий из cтабильного сигнального пептида (stable signal peptide, SSP) и двух доменов — GP1 и GP2 [65].

Начиная с 1990-х гг., первые разработанные анализы на основе ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) для обнаружения генетического материала LASV, в основном, были нацелены на S-сегмент вирусной РНК [28, 29, 55, 64]. Протокол ОТ-ПЦР, описанный Demby с соавт. в 1994 г., длительное время считался надежным и использовался многими лабораториями для рутинной диагностики ЛЛ. Выбор праймеров, нацеленных на консервативные районы S-сегмента РНК, кодирующие гены GPC и NP, был основан на фрагментах геномов нескольких изолятов, выделенных в Сьерра-Леоне, Либерии и Нигерии. Это участки 554–578, 602–634, 676–652 н.о. для гена GPC и 2625–2649, 2654–2688, 2770–2746 н.о. для гена NP, соответственно. Такой подход позволил обнаруживать от 1 до 10 копий плазмиды или транскрипта РНК LASV, содержащих целевую последовательность [28]. В 2003 г. при оценке in silico было обнаружено, что опубликованные для диагностического использования последовательности некоторых олигонуклетидных праймеров комплементарны далеко не всем штаммам и изолятам LASV [30]. Когда были подтверждены ложноотрицательные результаты для некоторых вирусных изолятов из Либерии и Нигерии из-за несоответствия последовательности на 3′-конце обратного праймера, протокол ОТ-ПЦР Demby с соавт. от 1994 г. был переработан в 2010 г. Olschlager с соавт. В результате для амплификации была выбрана 5′-область S-сегмента РНК (позиции гена GPC от 20 до 1000 н.о.). При разработке нового набора праймеров (GPC RT-PCR/2007 assay) учитывались 62 последовательности н.о. S-сегмента РНК изолятов LASV, выделенных в эндемичных странах, включая 40 последовательностей, полученных лично авторами. Аналитические и клинические характеристики нового анализа были тщательно валидированы с использованием 11-ти вирусных изолятов из Сьерра-Леоне, Либерии, Кот-д’Ивуара и Нигерии. При этом аналитическая чувствительность метода составляла от 4 до 30 копий геномной РНК/мл [64].

Стандартные ОТ-ПЦР-анализы с набором только амплифицирующих праймеров обычно применяются из-за меньшей сложности в процедуре их выполнения [60, 64]. ПЦР-РВ с использованием таких праймеров и меченого зонда, который гибридизирует ампликон, позволяет повысить специфичность анализа [73, 82]. Будучи более технологически сложным, прибор для ПЦР-РВ контролирует температуру, обрабатывает данные, анализирует результаты и, следовательно, обладает большей производительностью и более быстрой сквозной обработкой, чем стандартная ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией результатов. Тем не менее, специфичность праймерных и зондовых анализов в сочетании с генетическим разнообразием LASV неизбежно увеличивает вероятность получения ложноотрицательных результатов [66].

С появлением в базе данных GenBank [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/genbank] дополнительной информации о генетических последовательностях LASV начались исследования по разработке анализов ОТ-ПЦР, нацеленных на L-сегмент РНК, кодирующий полимеразу и белок Z [27, 41]. За последние годы большое количество геномов LASV были полностью секвенированы и оказалось, что последовательности L-генов также демонстрируют высокую генетическую изменчивость, как и последовательности генов GPC и NP, даже в пределах одной генетической линии. Таким образом, генетическое разнообразие LASV является естественной особенностью, которая, скорее всего, будет ограничением в использовании ПЦР-РВ для точной диагностики ЛЛ [27]. На данный момент времени (12.11.2021 г.) в GenBank депонированы результаты секвенирования некоторых частей генома LASV: по S-сегменту — 482 последовательности NP, более 200 последовательностей гена GPC или с включением части гена NP; по L-сегменту — 7 последовательностей гена L и более 100 — гена L с включением части гена Z. Самые свежие данные представлены в 2021 г., и по аффеляции авторов понятно, что исследования LASV проводятся только в экономически развитых странах — это CША, Германия, Великобритания, Япония и ЮАР [2].

Одним из простых и надежных методов молекулярно-генетических исследований особо опасных вирусов в настоящее время в литературе описывается метод петлевой изотермической амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP). Анализ характеризуется высокой специфичностью, так как при его постановке используют две или три пары праймеров, комплементарных шести или восьми регионам искомой ДНК соответственно. По аналогии с ПЦР учет накопления продуктов реакции может быть проведен как методом электрофореза в агарозном геле, так и визуальным/приборным определением протекания реакции — при измерении оптической плотности реакционной смеси или изменения ее окраски при добавлении специальных интеркалирующих красителей. При этом следует тщательно подбирать концентрацию таких красителей, так как они могут ингибировать процесс амплификации [3].

Внедрение в рутинную диагностику метода быстрого метагемномного секвенирования в реальном времени на платформе WGS (whole genome sequencing analysis) для обнаружения в клиническом образце особо опасных патогенов, таких как Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, EBOV, LASV и др., также приобретают все большее значение. Существует возможность внедрения WGS для быстрой и точной диагностики в реальном времени на основе портативного секвенатора MinION производства компании Oxford Nanopore Technologies [86]. Механизм секвенирования MinION основан на транслокации одной нити нуклеиновой кислоты через специальный нанопоровый белок, расположенный в электрически устойчивой полимерной мембране [34]. Сила тока изменяется по мере того, как н.о. проходят через пору в различных комбинациях, и в результате последовательность ДНК может быть выровнена простым считыванием [86].

Молекулярно-генетические методы являются чувствительными и специфичными анализами для обнаружения генетического материала LASV [60], но они не всегда доступны в эндемичных районах [50] и технологически сложны, по сравнению с иммуноферментными анализами [41]. В связи с этим необходимы тест-системы, которые можно использовать в «полевых условиях» — в госпиталях и на дому заболевших. К этому классу диагностических инструментов можно отнести серологические тесты на основе иммунохроматографического анализа (ИХА) [21, 77].

Иммуноферментный анализ по выявлению антигена

Учитывая большое генетическое разнообразие LASV, диагноз, основанный на иммуноферментном обнаружении в сыворотке крови вирусного NP (относительно консервативного антигена), может уменьшить вариабельность результатов [66]. Обнаружение вирусных антигенов полезно для ранней диагностики в качестве дополнительного теста к молекулярно-генетической диагностике болезни. Причем оба эти подхода являются прогностическими, так как уровень вируса в крови, как правило, обратно пропорционален выживаемости при ЛЛ [18]. Вирусные антигены могут быть обнаружены методом ИФА при их взаимодействии со специфическими антивирусными антителами. В начале 1980-х гг. был разработан тест с использованием двух видов антител класса IgG в качестве компонентов, «захватывающих» и «детектирующих» вирусный антиген. Препараты IgG были получены из сывороток крови инфицированных обезьян вида Макака-резус (как модель ЛЛ) и морских свинок, соответственно. Этот тест позволял выявлять виремию в титре до 10² БОЕ/мл у экспериментально инфицированных животных. Инактивация вируса β-пропиолактоном и γ-облучением не снижала его иммунохимической активности, что важно для безопасной лабораторной работы [61]. Далее этими же авторами было обнаружено, что с использованием данного метода можно выявить антиген и в сыворотках крови пациентов с явными симптомами ЛЛ [44]. Пять видов мышиных моноклональных антител (МКА), специфичных к белку NP, а также поликлональные антитела кролика, иммунизированного инактивированным антигеном, использовали в качестве «захватывающих» и «детектирующих» вирусный антиген, присутствующий в сыворотках крови пациентов [18]. Наряду с методом ИФА появляются и новые высокочувствительные технологии для выявления антигенов LASV. Например, платформа Luminex MagPix с использованием микросфер xMAP, с которыми посредством ковалентных связей соединены «захватывающие» мышиные МКА, специфичные к белкам NP или GPС LASV. При этом «детектирующие» МКА мечены эфиром биотина. Необходимо отметить, что, несмотря на высокую чувствительность данной платформы по сравнению с ИФА, в литературе нет данных о ее применении на практике, возможно из-за высокой стоимости. В лабораторных условиях была показана возможность дифференциальной диагностики БВВЭ и ЛЛ на примере инфицированных Macaca mulatta. При этом образцы сывороток крови животных, инфицированных LASV и EBOV, предварительно были инактивированы γ-облучением и проверены на безопасность [76]. Разработан экспресс-тест на основе иммунохроматографическиого анализа (ИХА) и пары МКА, специфичных к белку NP, с чувствительностью и специфичностью 90 и 100% соответственно. При его использовании показано, что антигенемия белка NP LASV (антиген в крови) может появляться у пациентов раньше, чем вирусная РНК [21].

Иммуноферментный анализ по выявлению антител

Первые иммуноферментные тесты по выявлению антител классов IgM и IgG разработаны на основе антигена LASV, инактивированного β-пропиолактоном и γ-облучением. В первом случае в качестве иммуносорбента для IgM тестируемой сыворотки крови человека использовали антивидовые (козьи) анти-IgM-антитела, во втором — IgG, полученные из сывороток крови инфицированных морских свинок. Экспериментальной моделью были обезьяны вида Макак-резус. В результате показано, что IgM, специфичные к LASV, обнаруживаются с 10-х суток от инфицирования с максимальным титром специфических антител на 36-е сутки и сохраняются в течение 1,5 лет. Антитела класса IgG появлялись в сыворотке крови позже, чем IgM, и их титр достигал пика на 73-е сутки [61]. Применение вышеописанных тестов позволило обнаружить, что сыворотки крови пациентов в острой фазе ЛЛ содержат как вирусный антиген, так и антитела класса IgM. Отмечено также, что повышение титра антител совпадает со снижением антигенемии [44]. Вирусные препараты, инактивированные 0,3%-ным раствором β-пропиолактона и обработанные γ-облучением (в дозе 3 × 10⁶ Рад), использованы в мультиплексном ИФА по одновременному выявлению антител класса IgG, специфичных к LASV, а также к вирусам Эбола, Марбург, лихорадок долины Рифт и Крым-Конго [63]. Показано, что рекомбинантный белок NP LASV, полученный в рекомбинантной бакуловирусной системе экспрессии гена NP в культуре клеток HeLa (клетки раковой опухоли шейки матки), эффективно выявляет антитела класса IgG, присутствующие в сыворотках крови пациентов с ЛЛ и экспериментально инфицированных Macaca fascicularis [74]. Рекомбинантные белки NP и GPС LASV, а также белки VP40 и GP EBOV, полученные в эукариотической системе экспрессии соответствующих генов (на культуре клеток почки эмбриона человека, 293T), оказались подходящими антигенами — аналогами вирусных белков для разработки теста по дифференциальной серологической диагностики ЛЛ и БВВЭ на платформе Luminex MagPix [76].

Иммуноблоттинг по выявлению антител

Рекомбинантный N-терминально усеченный белок NP LASV (штамм Josiah), синтезированный в E. coli, аффинно очищенный и полностью денатурированный при концентрации один микрограмм (мкг), использовали для выявления IgG, специфичных к LASV, в сыворотках крови людей при проведении простого иммуноблот-анализа на нитроцеллюлозной мембране. Отмечено, что для обнаружения специфических IgM количество рекомбинантного белка необходимо было увеличить до 5 мкг. Для оценки чувствительности и специфичности разработанного метода было собрано 913 образцов сывороток крови из эндемичных регионов и из районов, в которых LASV не был эндемичным. Показано, что, по сравнению с анализом непрямой иммунофлуоресценции, иммуноблоттинг имел специфичность от 90,0 до 99,3%, в зависимости от географического происхождения образцов. Установлено, что чувствительность анализа была самой высокой для гвинейских образцов (90,7%) и ниже — для либерийских образцов (75%) [80].

Лечение

Еще в 1986 г. в Сьерре-Леоне было обнаружено, что внутривенное введение рибавирина (1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) снижало летальность с 55 до 5% среди пациентов с тяжелой ЛЛ, у которых при госпитализации в крови был выявлен повышенный уровень аспартатаминотрансферазы, что могло свидетельствовать о начале процесса некроза тканей. Но лечение оказывалось успешным только при условии, если оно проводилось в течение первых шести суток после начала лихорадочного состояния [56]. До сих пор лечение пациентов с ЛЛ основано на применении этого препарата, который является аналогом гуанозина и проявляет широкую противовирусную активность в отношении нескольких видов вирусов, содержащих РНК или ДНК [25], например гепатита С [70], гепатитов А и В [12], гриппа и простого герпеса 1 типа [89], возбудителей лихорадок Крым-Конго, Батаи, боливийской, долины Рифт и лихорадки с почечным синдромом [12]. Кроме того, было замечено, что рибавирин действует в качестве иммуномодулирующего агента, повышая регуляцию специфических генов, стимулированных интерфероном, а также усиливая адаптивный противовирусный иммунный ответ. Но основным механизмом действия рибавирина, скорее всего, является защита инфицированных клеток от гибели и, возможно, снижение воспалительной реакции [25]. Также показано, что этот препарат эффективно подавляет репликацию LASV in vitro, но не влияет на снижение виремии in vivo при инфицировании химерных мышей линии Ifnar–/–B6 C57BL/6 [25]. Есть данные, что накопление препарата в эритроцитах вызывает гемолиз [38], что приводит к развитию анемии и нарушению функции почек [70]. Описан необычный дерматологический побочный эффект рибавирина — угревидные высыпания [39]. Для снижения тяжелых побочных эффектов у пациентов необходимо полное прекращение лечения или индивидуальное снижение дозы препарата, что, в свою очередь, может снизить его противовирусное действие [26]. Рибавирин (торговые марки: Copegus, Rebetol, Ribasphere, Vilona, Virazole) выпускается в виде капсул и аэрозолей. На сегодняшний день существуют сомнения в эффективности рибавирина и в отсутствии у него серьезных побочных эффектов для здоровья, поэтому необходимы более тщательные исследования этого препарата [75].

При лечении пациентов с ЛЛ рекомендуется проводить комплексное воздействие на организм с применением химиопрепаратов и средств интенсивной терапии — аскорутина, викасола, кортикостероидов, сердечно-сосудистых препаратов, переливание плазмы и цельной крови. Лечение должно быть направлено на устранение жидкостного, электролитического и осмотического дисбаланса. При развитии шока необходимо сократить потребление соли и воды, а внутрисосудистый объем жидкости увеличивать с помощью коллоидных растворов. В зависимости от степени кровопотери показано немедленное переливание крови (до 1–1,5 л в сутки) и введение сосудосуживающих препаратов, например, гепарина внутривенно в дозе 10 000–50 000 ЕД/сут под контролем свертываемости крови [1, 13].

Иммунную плазму в объеме 250–500 мл рекомендуется вводить на максимально ранних сроках заболевания — в первые 7–10 суток от появления симптомов ЛЛ [6]. Ранее было описано, что введение реконвалесцентной плазмы пациентам с повышенным уровнем аспартатаминотрансферазы при тяжелом течении ЛЛ не предотвращало их гибели [56]. Но есть сообщения об эффективной терапии экспериментально инфицированных животных (морских свинок и приматов вида Macaca fascicularis) при введении им антител, выделенных из сывороток крови людей, выживших после ЛЛ. Факт отсутствия развития заболевания и предотвращения гибели животного от летальных доз LASV при введении специфических антител указывает на протективную роль гуморального иммунного ответа [43, 44]. Тем не менее при использовании такого подхода для лечения пациентов с ЛЛ необходим предварительный контроль сывороток крови реконвалесцентов in vitro в отношении их нейтрализующей активности для прогнозирования защитной эффективности [43], так как у переболевших людей наблюдается очень слабая гуморальная реакция. Обычно титры нейтрализующих антител низкие и выявляются только через несколько месяцев после выздоровления [44]. Географическое происхождение плазмы также является важным фактором, так как на экспериментальных животных показано, что антитела, специфичные к гомологичным генотипам LASV, нейтрализуют вирус эффективнее [45].

Фавипиравир (Т-705, пиразиновое соединение, ингибитор РНК-полимеразы) — новое противовирусное средство с широким спектром действия против РНК-вирусов, лицензированное в Японии для лечения гриппа [67] и снижающее летальность у тяжело заболевших при других РНК-вирусных инфекциях, включая БВВЭ [59], и, возможно, COVID-19 [37]. Но следует учитывать последние данные по токсичности и тератогенности этого препарата [37]. Впервые фавипиравир был применен в сочетании с рибавирином для лечения пациентов с ЛЛ в Германии, когда два сотрудника госпиталя в г. Кельн заразились при выхаживании медицинского миссионера, эвакуированного из Того в тяжелом состоянии и погибшего, несмотря на интенсивную терапию. У заболевших врачей был выявлен повышенный уровень трансаминаз печени. В этом же сообщении отмечается, что после выздоровления у них в крови и сперме длительное время (до 52-х суток) определялась вирусная РНК, что позволило предположить потенциальную возможность передачи LASV половым путем [67].

Разработки лекарственных препаратов

Поиск эффективных терапевтических препаратов против ЛЛ идет не быстрыми темпами, так как эта инфекция эндемична только для слаборазвитых стран, где фундаментальные исследования противовирусных препаратов невозможны в силу отсутствия специализированных лабораторий типа BSL4 [78]. Использование для лечения рибавирина рекомендуется в случаях, когда угроза жизни превышает риск побочного действия. Снижение токсичности рибавирина, и, соответственно, уменьшение противовирусного эффекта, можно компенсировать при его использовании в меньшей концентрации с другими лекарственными препаратами. Например, синергическое взаимодействие рибавирина и фавипиравира было выявлено при изучении их сочетанного терапевтического потенциала на мышах линии Ifnar–/–B6 C57BL/6, инфицированных летальной дозой LASV [62]. Такой подход в лечении был опробирован и на людях [67]. Возможно, что новые изостерические аналоги рибавирина, сохраняющие свою биологическую активность в отношении вирусов [89], окажутся менее токсичными и их можно будет использовать в терепевтических целях у людей.

Российскими учеными в конце 1990-х гг. был получен гетерологичный препарат IgG (с титром вируснейтрализующих антител не менее 1:512) из сыворотки крови лошадей, иммунизированных инфекционным LASV. При доклиническом изучении показана безвредность препарата для лабораторных животных (белых мышей, морских свинок, обезьян) и высокая специфическая активность. Экспериментально обоснована тактика введения препарата — как в виде монотерапии, так и в комбинации с виразолом [4].

Использование иммунной плазмы реконвалесцентов для лечения оказалось успешным, как было сказано выше, в случае присутствия в крови нейтрализующих антител, которые кроме того были специфичны к гомологичному инфицирующему генотипу LASV [45]. Было обнаружено, что такие антитела обычно специфичны к вирусному гликопротеину (GP), который состоит из двух субъединиц — GP1 и GP2, имеющих эпитопы для связывания с клеточными рецепторами (например, с α-дистрогликаном) и слияния с мембраной клетки-хозяина. Эти данные позволили предположить, что препараты МКА, нацеленных на эпитопы комплекса GP, могут иметь терапевтическую пользу для людей [57]. Первые мышиные МКА для исследования антигенной структуры LASV были получены к вирусному препарату, инактивированному γ-излучением, и описаны довольно давно (в 1991 г.). По результатам конкурентного ИФА было обнаружено, что наиболее консервативные эпитопы разных вирусных изолятов локализуются на субъединице GP2 [71]. Эпитопы комплекса GP LASV, распознаваемые антителами естественно инфицированных людей, картированы совсем недавно (в 2016 г.) с использованием делеционных вариантов рекомбинантного белка GP. Рекомбинантные человеческие МКА (113 видов) были получены клонированием генов, кодирующих цепи соответствующих IgG. Для этого были использованы мРНК В-клеток выживших после тяжело перенесенной ЛЛ (пятнадцать человек из Сьерра-Леоне и двое из Нигерии). При выборе доноров В-клеток учитывался нейтрализующий титр специфических поликлональных антител, присутствующих в сыворотках крови. В результате были получены данные о том, что 50% видов МКА специфичны к субъединице GP2 в районе эпитопа слияния с клеткой. Остальные виды МКА, по 25% от общего количества, специфичны к GP1 и общим эпитопам комплекса GP1+GP2 соответственно. Методом иммунопреципитации авторы определили, что вирусные эпитопы для нейтрализующих МКА, в основном, имеют сложные конформационные четвертичные структуры. Из 16-ти видов МКА, нейтрализующих LASV (штамм Josiah, линия IV) in vitro, доминирующее количество — 13 видов — специфичны к эпитопам, сформированным комплексом GP1+GP2, а три вида — только к эпитопам субъединицы GP1 [69]. Препарат из 5-ти видов вышеописанных человеческих МКА, перекрестно нейтрализующих in vitro вирусные изоляты, отнесенные к линиям I–IV LASV, использовали для лечения приматов вида Macaca fascicularis. Животные были инфицированы летальной дозой (3500 БОЕ/мл) вирусного препарата, и их лечение начинали на поздних стадиях болезни. В результате было показано, что МКА на 100% защищали приматов от гибели. Таким образом, эти исследования представляют собой новую стратегию разработки специфических препаратов для лечения людей от ЛЛ [57].

Есть мнение, что исследование антивирусной активности медикаментов, уже одобренных в США Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) для лечения при других заболеваниях, сократит время разработки препаратов и для терапии при ЛЛ, так как они уже прошли проверку на безопасность, фармакокинетику и вирусные мишени. Препараты, препятствующие проникновению вируса в клетку, могут блокировать его репликацию и распространение на ранней стадии болезни [85]. Мишенью для противовирусных препаратов может быть cтабильный сигнальный пептид (SSP), входящий в состав гликопротеинового комплекса и способствующий слиянию вируса с мембраной инфицируемой клетки. Этот пептид содержит 58 а.о., цепь которых пронизывает двойную липидную вирусную мембрану, в том числе с 8-ю а.о. в эктодомене GP LASV [31]. Например, лосмапимод — экспериментальный антидепрессант (разработанный фирмой GlaxoSmithKline), который действует на макрофаги и эндотелиальные клетки как селективный ингибитор медиаторов воспаления — ферментов, известных как P38 митоген-активированные протеинкиназы [17], был использован при скрининге in vitro в числе 102-х видов препаратов, исследуемых для возможного клинического применения при ЛЛ. Было показано, что лосмапимод ингибирует рН-зависимое слияние LASV с клеткой как раз воздействуя на пептид SSP. Интересно, что на другие аренавирусы лосмапимод не оказывал влияния [88]. Для высокопроизводительного скрининга более тысячи препаратов на антивирусную активность были использованы вирусоподобные частицы (ВПЧ) на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего ген GP LASV и репортерный ген люциферазы. После трех раундов скрининга было установлено, что фенотрин (противопаразитарное средство) и лацидипин (антагонист кальциевых каналов клетки) являются высокоэффективными веществами, ингибирующими проникновение LASV в клетку через кальциевые каналы [85]. Известно, что кальциевые каналы клеток оказались мишенью и для других оболочечных вирусов, например для вируса японского энцефалита [84] и EBOV [72].

При вспышках опасных инфекций, таких как БВВЭ и ЛЛ, географические ареалы этиологических агентов которых могут пересекаться в Африке, а симптомы болезней на ранних стадиях почти неотличимы, интересен подход в использовании лекарственных препаратов, с выявленной in vitro антивирусной активностью против EBOV и LASV. Оба эти патогена используют похожие пути проникновения в клетку: контакт с поверхностными рецепторами, макропиноцитоз, прикрепление к эндосомальным рецепторам и рН-зависимое переключение конформации вирусных гликопротеинов для запуска слияния с поздними эндосомами. С использованием ВПЧ, экспонирующих на своей поверхности гликопротеины LASV и EBOV, были тестированы восемь препаратов: амодиахин (противомалярийный), апилимод (противоопухолевый), арбидол (противогриппозный), никлозамин (антигельминтный), зонипорид (кардиопротектор), кломифен (индуктор овуляции у женщин и секреции тестостерона у мужчин), сертралин (антидепрессант) и торимифен (противоопухолевый). В результате обнаружено, что пять препаратов (амодиахин, апилимод, арбидол, никлозамин, зонипорид) оказали примерно эквивалентные степени ингибирования проникновения ВПЧ EBOV и LASV в клетки. Три препарата (кломифен, сертралин и торимифен) были более активными против EBOV. Авторы рассматривают использование этих препаратов в виде различных комбинаций для лечения людей [42]. Cкрининг натуральных продуктов также может способствовать поиску лекарственных препаратов и исследованию механизмов, лежащих в основе патогенеза LASV. Например, из библиотеки 1058 готовых чистых соединений (производство Weikeqi Biotech, Sichuan, China), выделенных из растительных экстрактов, ингибирующая активность против ВПЧ LASV in vitro была обнаружена для бергамоттина кожуры грейпфрукта и кастицина семян древовидного кустарника Vitex agnus-castus семейства Яснотковые. Авторы считают, что механизм действия этих растительных препаратов, скорее всего, направлен на прямое антивирусное действие через блокирование слияния мембран вируса и клетки [53].

Заключение

Как показал анализ литературы, основными иммуногенами LASV являются белки NP и GPС (GP1/GP2), поэтому при разработке ИФА-тест-систем по выявлению специфических антител используют рекомбинантные аналоги этих белков. При этом, вопреки иммунологической догме, инфекция может приводить к выработке антител классов IgM и IgG почти одновременно, а IgG появляются в плазме крови заболевших даже раньше, чем IgM, что является препятствием при определении фазы болезни — острой, первичной или повторной ЛЛ. Кроме того, IgM, специфичные к LASV, могут сохраняться у переболевших в течение многих лет.

Виремия является основным показателем острой инфекции при заражении LASV. Показано, что антигенемия белка NP LASV может появляться у пациентов раньше, чем вирусная РНК. В связи с этим методы выявления вирусных РНК и антигенов в сыворотке крови пациентов с ЛЛ имеют решающее значение для подтверждения диагноза, применения мер предосторожности при уходе за пациентами и доступной противовирусной терапии, например препарата рибавирин.

Известные в настоящее время изоляты LASV генотипически разделены на cемь линий (I–VII). Такое разнообразие его генотипов, связанных с географическими ареалами, усложняет эффективный дизайн молекулярно-генетических методов диагностики ЛЛ. Использование праймеров, специфичных к конкретному генотипу, идеально подходит для исследований его циркуляции в определенных странах/регионах. В контексте же экспортируемых случаев ЛЛ из нескольких стран, где она является эндемичной, для точной диагностики ЛЛ необходимо использовать несколько ПЦР-тест-систем с набором праймеров, специфичных к консервативным участкам генома разных известных вирусных генотипов. Ранее при разработке молекулярно-генетических методов диагностики исследователи, в основном, использовали последовательности генов GPC и NP S-сегмента генома LASV, но с появлением в базе данных GenBank дополнительной информации о новых генетических последовательностях, начались разработки анализов на основе ОТ-ПЦР с праймерами, нацеленными на L-сегмент РНК, кодирующий полимеразу и белок Z.

Тест-системы на основе молекулярно-генетических методов являются чувствительными и специфичными для обнаружения РНК LASV, но не всегда доступны в эндемичных районах и технологически сложны по сравнению с иммуноферментными анализами. В связи с этим необходимы тесты, которые можно использовать в «полевых условиях» — в госпиталях и в домашних условиях. Например, на основе иммунохроматографического анализ (ИХА). Учитывая большое генетическое разнообразие LASV, диагноз, основанный на иммуноферментном обнаружении в сыворотке крови вирусного нуклеопротеина (относительно консервативного антигена), может оказаться более достоверным. Причем оба эти подхода лабораторной диагностики являются прогностическими, так как уровень вируса в крови, как правило, обратно пропорционален выживаемости при ЛЛ.

На протяжении длительного времени единственным средством для лечения пациентов с ЛЛ является рибавирин, но из-за токсичности его применение рекомендовано только тогда когда угроза жизни превышает риск развития тяжелых побочных эффектов в виде анемии и нарушения функции почек. Использование иммунной плазмы реконвалесцентов для лечения может быть успешным в случае присутствия в крови нейтрализующих антител, специфичных к вирусному гликопротеину, которые, кроме того, специфичны именно к гомологичному инфицирующему генотипу LASV. Альтернативой использованию иммунной плазмы реконвалесцентов является получение рекомбинатных человеческих МКА клонированием генов, кодирующих цепи IgG В-клеток пациентов, выживших после тяжелой ЛЛ. Кроме того, в настоящее время ведутся исследования по поиску безопасных препаратов, обладающих широкой антивирусной активностью. Показано, что химически синтезированные или природные молекулы (например, экстрагированные из растений), нацеленные на проникновение LASV (а именно на SSP, который способствует слиянию вируса с мембраной инфицируемой клетки), могут блокировать in vitro вирусную репликацию. Для безопасности скрининга потенциальных анти-LASV препаратов in vitro используют ВПЧ, экспонирующие на своей поверхности вирусные гликопротеины. Интересен подход в исследовании лекарственных препаратов на ингибирующую активность против двух этиологических агентов — EBOV и LASV, так как географические ареалы этих вирусов могут пересекаться в Африке, и симптомы вызываемых ими болезней на ранних стадиях почти неотличимы.

Конфликт интересов

Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

 

* Часть 1 опубликована в № 3 журнала «Инфекция и иммунитет» за 2022 г.

About the authors

Elena I. Kazachinskaia

Research Institute of Virology, Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences; State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector”, Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare (Rospotrebnadzor)

Author for correspondence.
Email: lena.kazachinskaia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1856-6147

PhD, MD (Biology), Leading Researcher, Department of Experimental Modeling of Pathogenesis of Infectious Diseases, Leading Researcher, Department of Bioengineering

Россия, Novosibirsk; Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

V. S. Aripov

State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector”, Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: aripov_vs@vector.nsc.ru

PhD Candidate, Junior Researcher, Department of Bioengineering

Россия, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

A. V. Ivanova

State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector”, Federal Service for the Oversight of Consumer Protection and Welfare (Rospotrebnadzor)

Email: Ivanova_av@vector.nsc.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Department of Bioengineering

Россия, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

A. M. Shestopalov

Research Institute of Virology, Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: shestopalov2@mail.ru

PhD, MD (Biology), Professor, Head of the Department of Experimental Modeling of Pathogenesis of Infectious Diseases

Россия, Novosibirsk

References

Supplementary files