Topical issues of clinical symptoms and diagnostics of septic shock

Full Text

Введение

Цирроз печени (ЦП) является тяжелым бременем для здоровья населения во всем мире в связи с ростом заболеваемости, потерей трудоспособности, высокой смертностью и большими затратами на лечение. По данным систематического анализа, в 2017 г. в мире ЦП стал причиной смерти более чем 1,3 млрд пациентов. При этом, несмотря на наличие эффективных методов профилактики и лечения инфекций, обусловленных вирусом гепатита B (HBV) и C (HCV), вирусные гепатиты по-прежнему остаются ведущими причинами развития цирроза печени и его осложнений. Так, в структуре смертности 55% приходится на ЦП вирусной этиологии [7].

В свете современных представлений ЦП рассматривается как мультисистемное заболевание, в патогенезе которого центральную роль играют иммунные дисфункции. Согласно этой концепции, нарушения в иммунной системе на стадиях компенсированного ЦП (независимо от его этиологии) проявляются избыточным воспалением, обусловленным высвобождением молекул опасности (DAMPs) из поврежденных гепатоцитов. По мере прогрессии и декомпенсации заболевания, ассоциированных с транслокацией кишечной флоры, провоспалительный ответ сменяется противовоспалительным ответом с развитием иммунодепрессии, манифестирующей в виде «иммунологического паралича» на стадии быстрого развития печеночной недостаточности [2]. Учитывая этот факт, изучение иммунных нарушений у пациентов ЦП является непременным условием для выявления новых мишеней и прогностических биомаркеров.

Иммунные дисфункции при ЦП во многом обусловлены клетками врожденного иммунитета. Среди них большое значение уделяется моноцитам, участвующим в защите от патогенов, воспалении и фиброгенезе [3, 13]. Циркулирующие моноциты представляют гетерогенную и крайне пластичную популяцию миелоидных клеток, выполняют множество функций (антигенпрезентирующую, регуляторную, цитотоксическую, репаративную) и являются источником макрофагов и дендритных клеток [3]. В периферической крови моноциты представлены 3 субпопуляциями — классическими (кMo; CD14⁺⁺CD16^–), промежуточными (пMo; CD14⁺⁺CD16⁺) и неклассическими (нMo; CD14⁺CD16⁺⁺) [18]. Указанные субпопуляции характеризуются не только фенотипическими, но и функциональными различиями — профилем/уровнем экспрессируемых цитокинов и хемокиновых рецепторов, способностью к дифференцировке (в макрофаги, дендритные клетки и остеокласты), а также функциональной активностью дифференцированных из моноцитов клеток [9, 16].

Вовлечение моноцитов в патологический процесс подтверждается изменением их субпопуляционной структуры, в частности возрастанием доли CD16⁺-моноцитов, выявленной способностью CD16⁺-моноцитов мигрировать в печень и модулировать процессы воспаления и фиброгенеза [10], а также ассоциацией CD16⁺-моноцитов с выраженностью печеночных повреждений, прогрессией заболевания и риском летального исхода [3, 4]. Однако исследования в этом направлении немногочисленны и данные о причастности отдельных субпопуляций CD16⁺-моноцитов к прогрессии ЦП неоднозначны. Так, если по данным одних авторов профиброгенная активность характерна для пМо [10, 19], то по данным других свойственна нМо [6, 11]. Противоречивые результаты имеются также в отношении сопряженности CD16⁺-моноцитов с прогрессией заболевания, которая может быть как прямой [11], так и обратной [4].

Следует отметить, что одним из ограничений этих исследований было то, что субпопуляции моноцитов и их клиническая значимость оценивались либо в выборках пациентов со смешанной этиологией ЦП, либо в когортах пациентов с хроническими заболеваниями печени (ХЗП), включающих, наряду с ЦП, больных хроническими гепатитами на различных стадиях фиброза. Соответственно, сведения об изменениях численности и значимости субпопуляций моноцитов при вирусном ЦП, в том числе у пациентов с HCV- и HVB-ассоциированным ЦП до настоящего времени отсутствуют.

Целью настоящего исследования стала сравнительная оценка структуры циркулирующего пула моноцитов у больных ЦП вирусной этиологии и анализ сопряженности между содержанием отдельных субпопуляций моноцитов с выраженностью поражения печени и тяжестью заболевания в сравнении с токсическим и билиарным/аутоиммунным ЦП.

Материалы и методы

Настоящее проспективное когортное исследование проводили в рамках фундаментальных и поисковых научных исследований. Последовательно отбирали пациентов с ЦП вирусной этиологии (обоего пола, в возрасте от 18 до 70 лет), проходивших обследование и лечение на базе отделения иммунологии клиники иммунопатологии НИИФКИ в период с сентября 2018 г. по июнь 2020 г. Диагноз ЦП базировался на результатах гистологического исследования, а также комплекса клинических, лабораторных и радиологических данных у пациентов с явными признаками портальной гипертензии. Гепатит С диагностировали по наличию анти-HCV-антител и HCV-РНК: гепатит B — при выявлении HBsAg; гепатит D — по выявлению HBsAg и анти-HDV-антител; микст-инфекция — при одновременном выявлении гепатита С и В или B+D. Критериями исключения являлось одновременное участие в другом клиническом исследовании, несоответствие критериям включения, активный алкоголизм и/или употребление наркотических средств, ВИЧ-инфекция, декомпенсированные заболевания легких и сердца, кровотечение из варикозно расширенных вен пищевода, наличие гепатоцеллюлярной карциномы или других онкологических заболеваний, острые инфекции, тромбоцитопения ниже 50 × 10⁹/л, психические нарушения, беременность, неспособность пациента подписать информированное согласие. Пациенты на момент обследования не получали противовирусной терапии. Степень тяжести ЦП оценивали по шкале Чайлда–Пью и MELD (шкала прогнозирования выживаемости пациентов в листе ожидания на трансплантацию печени). В группы сравнения вошли пациенты с алкогольным ЦП и билиарным/аутоиммунным ЦП. Контрольную группу составили 29 сопоставимых по полу и возрасту доноров крови. Исследования проводились после получения от всех участников письменного информированного согласия и были одобрены решением локального этического комитета НИИФКИ.

Общелабораторные тесты проводили стандартно с использованием сертифицированного оборудования. При поступлении у всех пациентов забирали венозную кровь для иммунологических исследований. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли методом центрифугирования гепаринизированной крови в градиенте плотности фиколла-верографина (ρ = 1,078). Лизис эритроцитов при необходимости проводили раствором VersaLyse (Beckman Coulter, Франция) в соответствии с инструкцией. Оценку кМо (CD14⁺⁺CD16^–), пМо (CD14⁺⁺CD16⁺) и нМо (CD14⁺CD16⁺⁺) проводили по общепринятой методике с использованием РerCP, FITC- и PE-меченых моноклональных анти-HLA-DR, анти-CD14- и анти-CD16-антител, соответственно (BD Pharmingen, США). Комплексное лечение пациентов включало стандартную базисную терапию (с учетом класса ЦП) и внутривенную инфузию аутологичных костномозговых клеток, как описано ранее [15]. Ответ на терапию оценивали через 12 мес. Отсутствие изменений балла Чайлда–Пью (стабилизация) у пациентов с исходно прогрессирующим ЦП или снижение балла по шкале Чайлда–Пью (уменьшение тяжести ЦП) расценивали как наличие клинического ответа, возрастание балла Чайлда–Пью через 12 мес. или летальный исход в течении 12 мес. — как отсутствие ответа.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде медианных значений (Ме) и квартильного диапазона (LQ–UQ, 25–75% квартили). Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрические критерии: U-критерий Манна–Уитни. Корреляционный анализ проводили с помощью ранговой корреляции Спирмена (Rs). Различия считали достоверными при уровне значимости p < 0,05. ROC-анализ для оценки прогностической значимости потенциальных предикторов ответа проводили с использованием программы GraphPad 5.0.

Результаты

Характеристика пациентов

Исследуемую группу составил 31 пациент с вирусным ЦП в возрасте от 35 до 57 лет (табл. 1). Хронический гепатит С в качестве причины ЦП был диагностирован у 19 пациентов. В этой подгруппе генотип 1b выявлялся у 10 и генотип 3а — у 7 пациентов. В 2 случаях определить генотип не представлялось возможным. Репликация вируса при HCV-ассоциированном ЦП выявлялась у 4 из 19 пациентов. Хронический гепатит В как причина ЦП был диагностирован у 12 пациентов и в 8 случаях сочетался с гепатитом D. Репликация вируса у больных с HВV/(HDV)-ассоциированным ЦП регистрировалась у 9 из 12 пациентов. Группы сравнения были представлены пациентами с алкогольным ЦП (n = 7), а также билиарным/аутоиммунным ЦП (n = 13), причиной которого у 9 пациентов являлся первичный билиарный цирроз и у 4 — аутоиммунный гепатит. Контрольную группу составили 29 доноров (16 мужчин и 13 женщин) в возрасте от 33 до 65 лет (Ме = 47,2).

 

Таблица 1. Характеристика больных ЦП

Table 1. Characteristics of LC patients

Параметры Parameters	Исследуемая группа (вирусный ЦП) Study group (viral LC)	Группы сравнения Comparison groups
		Алкогольный ЦП Alcoholic LC	Билиарный/Аутоиммунный ЦП Biliary/Autoimmune LC
Количество пациентов Number of patients	31	7	13
Возраст (Me; min–max), лет Age, years	48 (35–57)	57 (48–62)	55 (44–60)
Пол, М/Ж Sex, M/F	22/9	5/2	1/12
Шкала Чайлда–Пью/Child–Pugh scale (Ме; LQ–UQ)	6,0 (6,0–7,0)	7,0 (6,0–8,0)	6,0 (5,0–7,0)
Шкала Чайлда–Пью/Child–Pugh scale А, n (%) Шкала Чайлда–Пью/Child–Pugh scale B, n (%) Шкала Чайлда–Пью/Child–Pugh scale C, n (%) Шкала Чайлда–Пью/Child–Pugh scale B+C, n (%)	21/31 (67,7%) 9/31 (29,0%) 1/31 (3,3%) 10/31(32,3%)	3/7 (42,8%) 3/7 (42,8%) 1/7 (14,4%) 4/7 (57,2%)	7/13 (53,8%) 6/13 (46,2%) 0/13 (0%) 6/13 (46,2%)
MELD (Ме; LQ–UQ)	12,0 (9,6–13,3)	13,0 (10,0–16,0)	12,5 (8,6–16,0)

 

В соответствии с классификацией ЦП по Чайлду–Пью, класс А в исследуемой группе выявлялся у 21 (67,7%), класс В — у 9 (29,0%) и класс С — у 1 (3,3%) пациента. Таким образом доля больных с декомпенсированным ЦП (В+С) составила 32,3%. В группах сравнения количество пациентов с декомпенсированным ЦП было несколько выше (57,2 и 46,2% при алкогольном и билиарном/аутоиммунном ЦП соответственно), но эти различия не были статистически значимы. Больные ЦП в сформированных группах были также сопоставимы по медианным значениям балла Чайлда–Пью и MELD. Единственным и вполне ожидаемым различием было превалирование пациентов женского пола среди больных с билиарным/аутоиммунным ЦП.

Моноциты и их субпопуляции у больных вирусным ЦП

Пациенты с вирусным ЦП характеризовались повышенным процентным содержанием моноцитов в периферической крови (табл. 2) в сравнении с контрольной группой доноров и, учитывая лимфопению, сниженным лимфоцитарно-моноцитарным индексом. Эти изменения регистрировались как у больных с HCV-, так и HBV/HDV-инфекцией, а также выявлялись в группах сравнения — при алкогольном и билиарном/ аутоиммунном ЦП с наибольшей выраженностью при алкогольном ЦП. Возрастание абсолютного количества моноцитов при вирусном ЦП, как и в группах сравнения, в силу лейкопении не достигало статистической значимости.

 

Таблица 2. Характеристика моноцитарного звена у больных ЦП в исследуемой группе, в группах сравнения и у здоровых доноров

Table 2. Monocyte lineage characteristics in LC patients from study group, comparison groups and healthy donors

Группы Groups			Лейкоциты Leukocytes	Моноциты Monocytes		ЛМИ LMI
			× 109/l	%	× 109/l
1	Доноры/Donors	n = 29	6,1 (5,2–7,6)	7,1 (6,5–8,2)	0,35 (0,3–0,4)	4,3 (3,4–5,5)
Вирусный ЦП (Viral LC)
2	Общая группа Total group	n = 31	4,1(3,3–5,7) р = 0,045	10,4 (8,1–13) р = 0,00001	0,44 (0,32–0,52) р = 0,13	3,8 (2,7–4,7) р = 0,01
3	HCV	n = 17	4,4 (3,7–5,2) р = 0,049	10,7 (8,3–14) р = 0,0009	0,46 (0,34–0,63) р = 0,17	4,1 (2,7–4,9) р = 0,043
4	HBV/HDV	n = 12	4,0 (3,1–5,0) р = 0,006	10,4 (8,1–12) р = 0,0003	0,38 (0,32–0,4) р = 0,76	3,8 (2,9–4,7) р = 0,023
Группы сравнения/Comparison groups
5	Алкогольный ЦП Alcoholic LC	n = 7	4,7 (3,3–5,7) р = 0,07	12,3 (9,9–16) р = 0,0006	0,50 (0,28–0,76) р = 0,5	2,7 (2,3–4,4) р = 0,02
6	Билиарный/аутоиммунный ЦП Biliary/autoimmune LC	n = 13	4,8 (3,6–6,2) р = 0,02	11,7 (8,8–14) р = 0,009	0,39 (0,31–0,49) р = 0,33	3,9 (2,7–4,4) р = 0,008
Р(3–4)			0,12	0,54	0,16	0,82
Р(2–5)			0,91	0,23	0,48	0,26
Р(2–6)			0,43	0,74	0,79	0,89

Примечание. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (LQ–UQ). ЛМИ — лимфоцитарно-моноцитарный индекс, P — достоверность различий между донорами и больными, Р_{(3–4, 2–5, 2–6)} — достоверность различий между группами больных ЦП, U-критерий Манна–Уитни.

Note. Data are presented as median (Me) and interquartile range (LQ–UQ). LMI — lymphocyte-monocytic index, P — the significance of differences between donors and patients, P_{(3–4, 2–5, 2–6)} — the significance of differences between groups of LC patients, Mann–Whitney U-test.

 

Оценка субпопуляций моноцитов при вирусном ЦП (табл. 3) показала достоверное увеличение доли пМо и нМо, а также тенденцию к снижению относительного содержания кМо и двукратное снижение индекса кМо/пМо. Сравнение пациентов с HCV- и HBV/(HDV)-ассоциированным ЦП не выявило различий: обе подгруппы характеризовались сходными изменениями субпопуляционной структуры моноцитов и индекса кМо/пМо. Увеличение доли пМо и нМо и снижение индекса кМ/пМо не было обусловлено репликацией вируса, поскольку в подгруппах с наличием и отсутствием вирусной репликации содержание и соотношение субпопуляций моноцитов было сопоставимо. Учитывая эти факты, больные с HCV- и HBV/(HDV), независимо от фазы репликации вируса, были объединены в дальнейших исследованиях в общую группу.

 

Таблица 3. Субпопуляции моноцитов у больных ЦП в исследуемой группе, группах сравнения и здоровых доноров

Table 3. Monocyte subsets in LC patients from study group, comparison groups and healthy donors

Группы Groups			Субпопуляции моноцитов, % Monocyte subsets, %			Соотношение кМо/пМо cMo/iMo ratio
			кМо cMo	пМо iMo	нМо nMo
1	Доноры/Donors	n = 22	89 (83–91)	4,0 (3,0–5,0)	2,0 (1,0–3,0)	22 (16–39)
Вирусный ЦП/Viral LC
2	Общая группа/Total group	n = 31	85 (81–90) р = 0,25	8,0 (5,0–12,0) р = 0,000008	2,5 (2,0–4,0) р = 0,01	10,0 (7,3–18,0) р = 0,00007
3	HCV	n = 17	87 (81–90) р = 0,7	8,0 (5,0–10,0) р = 0,0002	2,4 (2,0–3,0) р = 0,039	11,0 (9,1–19,0) р = 0,0004
4	HBV/HDV	n = 12	84 (82–90) р = 0,16	8,5 (5,1–12,0) р = 0,003	3,5 (1,7–4,0) р = 0,047	9,8 (7,1–17,0) р = 0,004
P (3–4)			0,35	0,65	0,63	0,66
5	Репликация (–)/Replication (–)	n = 16	87 (82–90)	8,0 (5,0–11,0)	2,4 (2,0–3,0)	10,0 (7,4–15,0)
6	Репликация (+)/Replication (+)	n = 15	83 (81–86)	7,0 (5,0–10,0)	3,5 (2,0–7,5)	9,7 (6,5–15,0)
P (5–6)			0,31	0,48	0,11	0,77
Группы сравнения/Comparison groups
Алкогольный ЦП Alcoholic LC		n = 7	85 (84–86) р = 0,14	11,0 (8,0–11) р = 0,00018	3,0 (2,0–5,0) р = 0,045	7,8 (6,4–11,0) р = 0,00013
Билиарный/аутоиммунный ЦП Biliary/autoimmune LC		n = 13	83 (81–86) р = 0,033	7,0 (5,0–10,0) р = 0,004	4,1 (3,0–6,0) р = 0,0002	12,0 (7,9–18,0) р = 0,004

Примечание. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (LQ–UQ). кМо, пМо и нМо — классические, промежуточные и неклассические моноциты, соответственно. Р — достоверность различий между донорами и больными; Р_(3–4) — достоверность различий между подгруппами с HCV- и HBV/HDV-ассоциированным ЦП; Р_(5–6) — достоверность различий между подгруппами с наличием и отсутствием репликации вируса. U-критерий Манна–Уитни.

Note. Data are presented as median (Me) and interquartile range (LQ–UQ). cMo, iMo and nMo are classical, intermediate and non-classical monocytes, respectively. P — the significance of differences between donors and patients; P_(3–4) — the significance of differences between subgroups with HCV- and HBV/HDV-associated LC; P_(5–6) — the significance of differences between subgroups with and without viral replication. Mann–Whitney U-test.

 

Изменения субпопуляционной структуры моноцитов в группах сравнения в целом были сходными. Из особенностей можно отметить более выраженное по сравнению с донорами снижение кМн у пациентов с билиарным/аутоиммунным ЦП (pU = 0,033). Кроме того, в сравнении с вирусным ЦП пациенты с алкогольным и билиарным/аутоиммунным ЦП характеризовались более высоким содержанием пМо и нМо соответственно, но эти различия не были статистически значимы

Сопряженность субпопуляций моноцитов с маркерами печеночных повреждений

Анализ сопряженности субпопуляций моноцитов (табл. 4) с лабораторным индикаторами, отражающими повреждения печеночных клеток (уровень билирубина, ЛДГ, АСТ/АЛТ) и снижение белково-синтезирующей функции печени (альбумин), выявил у больных вирусным ЦП наличие прямой корреляционной связи пМо с концентрацией общего билирубина (r = 0,48; p = 0,011), индексом AСТ/AЛТ (r = 0,47; р = 0,016) и уровнем ЛДГ (r = 0,47; р = 0,02) и выраженной обратной корреляции пМо с уровнем альбумина (r = –0,57; p = 0,002). В то же время относительное содержание кМо и их отношение с пМо находились в обратной корреляционной зависимости с индексом AСТ/AЛТ.

 

Таблица 4. Корреляционные связи субпопуляций моноцитов с лабораторными индикаторами поражения печени

Table 4. Correlations between monocyte subsets and laboratory indicators of liver injury

Биохимические маркеры Biochemical markers	Вирусный ЦП Viral LC n = 31	Алкогольный ЦП Alcoholic LC n = 7	Билиарный/аутоиммунный ЦП Biliary/autoimmune LC n = 13
Общий билирубин/Total bilirubin
кМо/cMo	–0,23 (0,24)	–0,15 (0,47)	0,24 (0,47)
пМо/iMo	0,48 (0,011)	0,03 (0,95)	–0,18 (0,58)
нМо/nMo	0,15 (0,52)	0,15 (0,77)	–0,40 (0,21)
кМо/пМо | cMo/iMo	–0,23 (0,025)	–0,15 (0,77)	0,24 (0,47)
АСТ/АЛТ | AST/ALT
кМо/cMo	–0,52 (0,006)	0,39 (0,43)	0,21 (0,52)
пМо/iMo	0,47 (0,016)	–0,09 (0,86)	–0,55 (0,08)
нМо/nMo	0,06 (0,77)	0,45 (0,36)	–0,35 (0,27)
кМо/пМо | cMo/iMo	–0,53 (0,049)	0,39 (0,43)	0,20 (0,50)
ЛДГ/LDH
кМо/cMo	–0,04 (0,82)	0,11 (0,55)	–0,36 (0,27)
пМо/iMo	0,47 (0,02)	–0, 3 (0,60)	0,06 (0,87)
нМо/nMo	0,19 (0,36)	–0,3 (0,58)	0,28 (0,39)
кМо/пМо | cMo/iMo	–0,04 (0,8)	0,11 (0,85)	–0,36 (0,27)
Альбумин/Albumen
кМо/cMo	0,13 (0,50)	–0,11 (0,55)	0,07 (0,84)
пМо/iMo	–0,57 (0,002)	0,10 (0,86)	–0,12 (0,51)
нМо/nMo	–0,22 (0,26)	0,11 (0,85)	0,52 (0,09)
кМо/пМо | cMo/iMo	0,13 (0,50)	–0,11 (0,85)	0,06 (0,84)

Примечание. Представлены коэффициенты корреляции по Спирмену и их достоверность (в скобках).

Note. The Spearman correlation coefficients and their significance (in brackets) are presented.

 

При алкогольном ЦП таких сопряженностей не наблюдалось, тогда как при билиарном/аутоиммунном ЦП на уровне выраженного тренда доля пМо обратно коррелировала с индексом АСТ/АЛТ (r = –0,55; р = 0,08), а содержание нМо находилось в прямой взаимосвязи с концентрацией альбумина (r = 0,52; р = 0,09). Таким образом, прямая сопряженность пМо с повреждением печени и снижением ее белковосинтезирующей функции была характерна для больных вирусным ЦП и не прослеживалась при алкогольном и билиарном/аутоиммунном ЦП.

Сопряженность циркулирующих моноцитов с тяжестью ЦП

При сравнении пациентов с компенсированным и декомпенсированным вирусным ЦП (табл. 5) более выраженные изменения субпопуляционного состава моноцитов выявлялись у пациентов с большей тяжестью (класс В+С по шкале Чайлда–Пью). Так, достоверное снижение кМо регистрировалось только у больных с классом В+С, тогда как в группе с классом А проявлялось в виде тренда. Кроме того, пациенты с декомпенсированным вирусным ЦП отличались достоверно более высоким содержанием пМо и более низким индексом кМо/пМо.

В группах сравнения таких закономерностей не прослеживались. Напротив, при алкогольном ЦП содержание пМо было более высоким у пациентов с классом А, чем с классом В+С, а при билиарном/аутоиммунном ЦП доля нМо у пациентов с классом А превышала таковую у пациентов с классом В+С, хотя эти различия проявлялись в виде тенденции. Индекс соотношения кМо/пМо при алкогольном и билиарном/аутоиммунном ЦП в подгруппах с компенсированным и декомпенсированным ЦП значимо не различался.

 

Таблица 5. Субпопуляции моноцитов у больных с различной тяжестью ЦП по шкале Чайлда–Пью

Table 5. Monocytes subsets in patients with different severity of LC according to the Child–Pugh scale

Группы Groups		Субпопуляции моноцитов, % Monocyte subsets, %			Соотношение кМо/пМо cMo/iMo ratio
		кМо cMo	пМо iMo	нМо nMo
Доноры/Donors	n = 22	89 (83–91)	4,0 (3,0–5,0)	2,0 (1,0–3,0)	22 (16–39)
Вирусный ЦП/Viral LC
– class А	n = 21	85 (81–90)	6,0 (5,0–9,0)**	2,5 (2,0–4,0)*	15 (9,3–19)**
– class В+С	n = 10	82 (79–87)*	10 (8,0–13)**	3,0 (2,0–6,0)**	7,9 (6,5–10)**
РU (А vs B+C)		0,67	0,02	0,53	0,02
Алкогольный ЦП/Alcoholic LC
– class А	n = 3	85 (85–88)	11 (10–18)**	2,0 (2,0–5,0)	7,7 (4,9–8,5)**
– class B+C	n = 4	85 (77–85)	9,5 (7,0–11)**	3,0 (2,5–4,5)*	9,2 (7,1–12)**
РU (А vs B+C)		0,27	0,27	0,45	0, 28
Билиарный/аутоиммунный ЦП | Biliary/autoimmune LC
– class А	n = 7	82 (81–88)	6,0 (3,0–8,6)	5,0 (4,1–13)**	14 (9,5–30)
– class B+C	n = 6	84 (79–86)	8,5 (5,0–12)**	3,5 (2,0–4,0)	10 (7,1–17)*
РU (А vs B+C)		0,83	0,34	0,06	0, 25

Примечание. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (LQ–UQ). *^, ** — p < 0,05 и p < 0,01 достоверность различий между донорами и больными; РU — достоверность различий между группами Чайлда–Пью класса А и класса В+С, U-критерий Манна–Уитни.

Note. Data are presented as median (Me) and interquartile range (LQ–UQ). *^, ** — p< 0,05 and p < 0,01 — the significance of differences between donors and patients; РU — the significance of differences between the groups Child–Pugh class A and class B+C, Mann–Whitney U-test.

 

Вовлечение субпопуляций Мо в прогрессию заболевания при вирусном ЦП подтверждалось также наличием прямой корреляции (табл. 6) балла Чайлда–Пью с относительным содержанием пМо (r_S = 0,57; p = 0,001) и обратной корреляции с долей кМо (r_S = –0,35; p = 0,059) и индексом кМо/пМо (r_S = –0,56; p = 0,01). Схожие результаты получены при анализе корреляций с баллом MELD, который находился в прямой сопряженности c долей пМо (r_S = 0,41; p = 0,033) и обратной — с индексом кМо/пМо (r_S = –0,40; p = 0,039). Анализ в группах сравнения показал, что у пациентов с алкогольным ЦП содержание пМо обратно коррелировало с баллом Чайлда–Пью и особенно MELD. Соответственно, между индексом кМо/пМо и баллом MELD выявлялась сильная прямая корреляция (r_S = 0,94; p = 0,002). Ассоциация кМо с тяжестью по шкале Чайлда–Пью также носила характер отрицательной связи (r_S = –0,37; p = 0,041). В группе с билиарным/аутоиммунным ЦП тяжесть заболевания обратно коррелировала с относительным содержанием нМо, что проявлялось в виде тренда в отношении балла тяжести по Чайлда–Пью (p = 0,09) и сильной достоверной корреляции с баллом MELD (r_S = –0,76; p = 0,006).

 

Таблица 6. Корреляционные связи субпопуляций моноцитов с тяжестью заболевания больных ЦП

Table 6. Correlations between monocyte subsets and disease severity of LC patients

Группы/маркеры Groups/markers	Вирусный ЦП Viral LC n = 31	Алкогольный ЦП Alcoholic LC n = 7	Билиарный/аутоиммунный ЦП Biliary/autoimmune LC n = 13
Корреляция с баллом Чайлда–Пью/Correlation with the Child–Pugh score
кМо/cMo	–0,35 (0,059)	–0,37 (0,041)	–0,13 (0,67)
пМо/iMo	0,57 (0,001)	–0,52 (0,20)	0,13 (0, 69)
нМо/nMo	0,30 (0,11)	0,13 (0,78)	–0,49 (0,09)
кМо/пМо | cMo/iMo	–0,56 (0,01)	0,56 (0,18)	–0,18 (0,56)
Корреляция с баллом MELD/Correlation with the MELD score
кМо/cMo	–0,24 (0,23)	–0,39 (0,38)	0,16 (0,63)
пМо/iMo	0,41 (0,033)	–0,93 (0,002)	0,028 (0,93)
нМо/nMo	0,05 (0,80)	–0,09 (0,84)	–0,76 (0,006)
кМо/пМо | cMo/iMo	–0,40 (0,039)	0,94 (0,0018)	–0,09 (0,79)

Примечание. Представлены коэффициенты корреляции по Спирмену и их достоверность (в скобках).

Note. The Spearman correlation coefficients and their significance (in brackets) are presented.

 

Сопряженность субпопуляций моноцитов с отдаленным ответом на терапию/ прогрессией ЦП

Поскольку большинство рекрутированных пациентов после проведения комплексной терапии имели результаты повторного обследования на период 12-месячного наблюдения, одной из задач стала оценка прогностической значимости исследуемых субпопуляций моноцитов в качестве предиктора отдаленного ответа/прогрессии заболевания. Стабилизация или уменьшение тяжести заболевания (снижение балла Чайлда–Пью) через 12 мес. после терапии при вирусном ЦП регистрировались у 21 из 27 больных. Соответственно, нарастание тяжести, свидетельствующее о прогрессии ЦП, было отмечено только у 6 пациентов (22% случаев). В группе с алкогольным ЦП прогрессии заболевания ни у одного из 7 пролеченных пациентов не наблюдалось, а в группе с билиарным/аутоиммунным ЦП выявлялось лишь у одного из 11 пациентов (9% случаев). Таким образом, пациенты с вирусным ЦП менее эффективно отвечали на проводимое комплексное лечение по сравнению с больными из групп сравнения. Прогрессия ЦП вирусной этиология регистрировалась как у пациентов с компенсированной (n = 3), так и декомпенсированной формой заболевания (n = 3) и не была связана с большей тяжестью больных вирусным ЦП (табл. 1).

Сопоставление субпопуляций моноцитов в группах сравнения показало, что пациенты с прогрессией заболевания при обследовании до начала терапии характеризовались тенденцией к меньшему содержанию кМо (р = 0,059), достоверно более высоким количеством пМо и двукратно меньшим индексом соотношения кМо/пМо (данные не представлены).

Проведение ROC-анализа показало (табл. 7), что прогностические модели, основанные на оценке кМо, пМо и индекса кМо/пМо у больных вирусным ЦП, характеризовались высокой точностью прогноза при использовании в качеств предикторов прогрессии заболевания, поскольку площадь под кривой превышала 0,75 и была наибольшей для индекса кМо/пМо (AUC = 0,89; рис.). При значениях индекса < 9,5 прогрессия прогнозировалась с чувствительностью 83,3 и специфичностью 76,2%. Важно отметить, что балл Чайлда–Пью и MЕLD оказались менее эффективными маркерами в качестве предикторов прогрессии ЦП после комплексной терапии в сравнении с индексом кМо/пМо.

 

Таблица 7. Прогностическая значимость субпопуляций моноцитов, соотношения кМо/пМо, шкал Чайлда–Пью и MЕLD в качестве предикторов отдаленного ответа/прогрессии вирусного ЦП

Table 7. Comparative characteristics of the prognostic significance of monocyte subsets, cMo/iMo ratio, Child–Pugh and MELD scores as a predictor for long-term response/progression of viral LC

Параметры Parameters	AUC (P value)	95% доверительный интервал Confidence interval	Пороговое значение Threshold value	SN/SP, %	Отношение правдоподобия Likelihood ratio
кМо/cMo	0,76 (0,054)	0,57–0,95	< 84,5%	83/62	2,19
пМо/iMo	0,82 (0,016)	0,65–0,99	> 8,5%	67/71,4	2,33
кМо/пМо | cMo/iMo	0,89 (0,004)	0,74–1,04	< 9,5	83,3/76,2	3,50
Балл Чайлда–Пью Child–Pugh score	0,74 (0,080)	0,51–0,97	> 6,5	50/70	1,67
Балл MЕLD MELD score	0,78 (0,040)	0,59–0,98	> 12,9	83/66	2,50

Примечание. AUC — площадь под кривой, SN/SP — чувствительность/специфичность.

Note. AUC — area under curve, SN/SP — sensitivity/ specificity.

 

Рисунок. Прогностическая значимость соотношения кМо/пМо в оценке прогрессии вирусного ЦП через 12 мес. после комплексной терапии (ROC-анализ)

 

Обсуждение

Способность моноцитов при ХЗП мигрировать из периферической крови в печень и дифференцироваться в различные функциональные типы макрофагов, участвующих в регуляции воспаления, образования фиброзной ткани и ее деградации, а также гетерогенность циркулирующих моноцитов по миграционной, функциональной и дифференцировочной способности свидетельствует о патогенетической [3, 19] и потенциальной прогностической значимости этих клеток в качестве индикаторов воспалительного процесса и прогрессии заболевания [8]. Тем не менее сведения об особенностях моноцитарного паттерна в зависимости от этиологии и тяжести ЦП, особенно вирусного генеза, остаются малочисленными и зачастую противоречивыми.

Проведенные нами исследования продемонстрировали возрастание относительного количества моноцитов, в том числе пМо и нМо и снижение кМо у больных вирусными ЦП и показали, что 1) изменения в субпопуляционной структуре циркулирующих моноцитов на стадии ЦП не зависят от типа вирусной инфекции (HCV vs HВV/HDV) и репликации вируса и 2) аналогичные изменения в моноцитарном звене наблюдаются и при других формах ЦП, в частности, алкогольном и билиарном/аутоиммунном ЦП.

Полученные нами результаты в группах сравнения согласуются с данными литературы о повышенном содержании пМо при первичном билиарном циррозе [11] и алкогольном ЦП [4, 10]. Относительно HBV/HDV-ассоциированной инфекции, имеющиеся в литературе данные ограничены сообщением о повышенном содержании пМо при активном течении хронического гепатита В [17], а также возрастании общей популяции CD16⁺-моноцитов в смешанной группе пациентов, включающей больных хроническим гепатитом В и С на стадии фиброза и ЦП [19]. Соответственно, нами впервые продемонстрировано увеличение обеих субпопуляций CD16⁺-моноцитов (пМо и нМо) в изолированной группе пациентов с HBV/HDV-инфекцией на стадии ЦП. Что касается HCV-ассоциированного ЦП, V.L. Gadd и соавт. не выявили увеличения субпопуляций CD16⁺-моноцитов при HCV-ассоциированных ХЗП, что может быть отчасти связано с включением в исследование значительной доли пациентов на стадии фиброза [6]. Наряду с этим, имеются сообщения о повышенном содержании пМо в смешанной группе больных ЦП, включающей около 20% пациентов с ЦП, обусловленным HCV-инфекцией [4]. С этих позиций наши результаты однозначно демонстрируют увеличение промежуточных и неклассических моноцитов у больных с HCV-ассоциированным ЦП. При этом важным моментом является тот факт, что на стадии ЦП увеличения субпопуляций CD16⁺-моноцитов при HCV- и HВV-инфекции происходит в одинаковой степени и не связано с репликацией вируса.

Возрастание CD16⁺-моноцитов описано при многих хронических заболеваниях, включая сердечно-сосудистую патологию [14]. Тем не менее экспансия этих клеток при вирусных ЦП, по-видимому, не является исключительно следствием коморбидности, поскольку по данным литературы доля CD16⁺-моноцитов коррелирует с концентрацией провоспалительных цитокинов и клинической прогрессией заболевания [19]. Также показано, что CD16⁺-моноциты обладают более высокой (по сравнению с классическими CD14⁺CD16^–-моноцитами) способностью к трансэндотелиальной миграции [10], секреции цитокинов и хемокинов с провоспалительной и профиброгенной активностью (TNFα, IL-6, CXCL8/IL-8, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL5 и IL-13), активации звездчатых клеток и Th1-ответа [10, 11, 19]. Тем не менее и в этом аспекте данные достаточно противоречивы и включают сообщения о прямой сопряженности CD16⁺-моноцитов с прогрессией заболевания [11, 17, 19], обратной зависимости [4, 12] и отсутствии таковой [6].

Полученные нами данные косвенно свидетельствуют о разнонаправленных эффектах кМо и пМо при вирусном ЦП, в частности о негативном эффекте пМо и протективном кМо. Характерно, что прямая сопряженность пМо с маркерами повреждения/недостаточности печеночных клеток и тяжестью ЦП была характерна для вирусного ЦП и не выявлялась в группах сравнения. Напротив, при алкогольном ЦП тяжесть заболевания обратно коррелирует с содержанием пМо, а при билиарном/аутоиммунном ЦП — с долей нМо, свидетельствуя в пользу протективной активности субпопуляций CD16⁺-моноцитов.

Выявление разными авторами как прямой, так и обратной сопряженности пМо или нМо с тяжестью/клинической прогрессией заболевания позволяет предполагать, что функциональная активность этих субпопуляций может существенно различаться в зависимости от стадии заболевания и этиологического фактора. Так, на начальных стадиях ХЗП моноциты характеризуются признаками активации и высокой провоспалительной активности, тогда как на более продвинутых и, особенно, декомпенсированных стадиях ЦП проявляют противовоспалительные свойства, ассоциированные с усилением экспрессии MERTK и снижением экспрессии HLA-DR, продукции активных метаболитов кислорода и провоспалительных цитокинов, что, в конечном счете, обусловливает потерю способности к защите от инфекции [3, 13]. В нашем исследовании пациенты с вирусным ЦП не отличались от больных групп сравнения (алкогольный и билиарный/аутоиммунный ЦП) по медианным значениям балла Чайлда–Пью или MЕLD. Тем не менее прямая сопряженность пМо с тяжестью при вирусном ЦП ассоциировалась с меньшей долей пациентов с декомпенсированным ЦП, чем при алкогольном ЦП (32 против 57%), при котором пМо находились в обратной зависимости с баллом тяжести. Полученные результаты также не исключают вклад самой вирусной инфекции в детерминирование функциональной активности отдельных субпопуляций моноцитов и их сопряженность с тяжестью заболевания. В настоящей работе мы не оценивали функциональный фенотип моноцитов. Это, с одной стороны, является серьезным ограничением, с другой — определяет направления будущих исследований.

Одним из важных этапов работы стала попытка оценить прогностическую значимость субпопуляций моноцитов в качестве предиктора прогрессии вирусного ЦП через 12 мес. после комплексного лечения. Как выяснилось, пациенты с прогрессией вирусного ЦП исходно (до проведения терапии) по субпопуляционной структуре моноцитов отличались от больных со стабильным течением/снижением тяжести. Соответственно, по результатам ROC-анализа, прогностические модели, основанные на определении субпопуляций моноцитов и их соотношения, характеризовались «хорошим» (для кМо) и «очень хорошим» (для пМо и, особенно, для индекса кМо/пМо) качеством при прогнозировании риска прогрессии заболевания.

Необходимость прогностических моделей при ЦП традиционно связывают с оптимизацией алгоритма ведения пациентов в листе ожидания трансплантации печени. Основными инструментами прогнозирования для этих целей являются мультифакториальные шкалы оценки тяжести — шкала Чайлда–Пью и MELD. Однако данные шкалы предназначены в большей степени для оценки риска летального исхода и характеризуются недостаточной эффективностью при индивидуальном прогнозе характера течения заболевания [1, 5]. В литературе также имеются сообщения о связи моноцитов и их функций с риском летального исхода [4, 6]. Более того, C.C. Cardoso и соавт. продемонстрировали прогностическую значимость кМо и пМо в отношении риска 3-месячной летальности у пациентов с декомпенсированным ЦП в смешанной выборке с преобладанием алкогольного ЦП [4]. В нашей выборке более половины пациентов имели компенсированную стадию ЦП (класс А), а пациенты с декомпенсированным ЦП были представлены преимущественно больными с классом В. Соответственно, нами впервые 1) продемонстрирована возможность прогноза прогрессии на более ранних стадиях ЦП, 2) показана возможность такого прогноза у пациентов с вирусным ЦП, и 3) в качестве оптимального предиктора прогрессии идентифицирован индекс соотношения кМо/пМо.

В целом полученные результаты свидетельствуют, что, в отличие от пациентов с алкогольным и билиарным/аутоиммунным ЦП, у пациентов с вирусным ЦП возрастание пМо ассоциировано с выраженностью повреждений печени и тяжестью заболевания, что обосновывает необходимость дифференцированного подхода к разработке прогностических моделей и иммунотерапевтических стратегий при вирусных ЦП.

About the authors

Olga Y. Leplina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Author for correspondence.
Email: oleplina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3169-8643

PhD, MD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy

Россия, Novosibirsk

Marina A. Tikhonova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: martix-59@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7987-2017

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy

Россия, Novosibirsk

Ilona V. Meledina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: ilonameledina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0463-0002

PhD (Medicine), Head of the Immunology Department, Clinics of Immunopathology

Россия, Novosibirsk

Olga I. Zheltova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: olzheltova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3656-2630

PhD (Medicine), Immunologist, Immunology Department, Clinics of Immunopathology

Россия, Novosibirsk

Ekaterina Y. Shevela

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: shevelak@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8997-3586

PhD, MD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy

Россия, Novosibirsk

Alexander A. Ostanin

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: ostanin62@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6895-938X

PhD, MD (Medicine), Professor, Head Researcher, Laboratory of Cellular Immunotherapy

Россия, Novosibirsk

Elena R. Chernykh

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: ct_lab@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2346-6279

PhD, MD (Medicine), Professor, RAS Corresponding Member, Head of the Laboratory of Cellular Immunotherapy

Россия, Novosibirsk

References

Supplementary files