A diagnostic algorithm for Helicobacter pylori detection and identification in gastric mucosal biopsies

Full Text

Введение

Helicobacter pylori (H. pylori) — грамотрицательная микроаэрофильная спиральная бактерия, которая колонизирует слизистую оболочку желудка (СОЖ) более чем у 50% населения мира, при значительных региональных различиях распространенности [6, 12]. H. pylori является этиологическим агентом таких заболеваний, как хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, аденокарцинома и лимфома, ассоциированная со слизистой оболочкой желудка (MALT-лимфома) [3, 6, 8, 10, 12, 13]. Тяжесть воспаления и его последствия значительно варьируют и зависят от факторов вирулентности микроорганизма, иммунологических и генетических особенностей человека и факторов окружающей среды [3, 6, 7, 8, 10]. Этиологическая роль H. pylori в развитии гастродуоденальной патологии позволяет успешно использовать антибактериальную терапию для его эрадикации [1, 3, 4, 5, 7, 9]. Для диагностики H. pylori-инфекции используют комплекс бактериологических, иммунологических, биохимических, молекулярно-биологических тестов, которые позволяют решать задачи от первичной специфической диагностики до оценки популяции микроорганизма [1, 2, 3, 5, 7, 8, 9, 11]. Выделяют инвазивные (требующие для осуществления процедуры гастродуоденоскопии и взятия биоптата СОЖ) и неинвазивные (предусматривающие исследование других биологических материалов: крови, кала, мочи, проб выдыхаемого воздуха) методы диагностики, выбор которых требует дифференцированного подхода, учитывая разнообразие клинических проявлений данной инфекции.

Материалы и методы

Работа выполнена на базе ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера с использованием образцов биологического материала, полученного в 2013–2024 гг. Исследование одобрено независимым локальным этическим комитетом ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (протокол № 50/04-2019, 22.06.2020). С помощью бактериологического и молекулярно-биологического методов обследовано 610 пациентов (57% женщин, 43% мужчин) в возрасте от 19 до 73 лет с диагнозами: хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки, рак желудка и поджелудочной железы. Исследованию подлежали биоптаты слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки, образцы резецированных органов, полученных при проведении эзофагогастродуоденоскопии или во время оперативных вмешательств в условиях строгой асептики.

Выделение культур H. pylori из биоптатов СОЖ и двенадцатиперстной кишки проведено в соответствии с методикой, описанной в издании «Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство» [2]. Выделение и культивирование H. pylori осуществляли на среде, содержащей Колумбийский агар с добавлением 5–7% дефибринированной лошадиной крови и 1% раствора IsoVitalex (BD Biosciences, США). Инкубация посевов осуществлялась в микроаэрофильных условиях (10% CO₂, 85% N₂, 5% O₂) с использованием анаэростатов системы GasPac 100 (BD Biosciences, США) при температуре 35–37°C в течение 4–7 дней. Для первичной идентификации мазки культур окрашивали по Граму. Видовую идентификацию выделенных штаммов проводили с использованием биохимических тестов (уреазный, каталазный, оксидазный), при положительном результате которых выделенную культуру идентифицировали как H. pylori.

Для выделения ДНК из биоптатов СОЖ и/или двенадцатиперстной кишки использованы комплекты реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-Б» (ООО «НекстБио», Россия). Постановку ПЦР в формате реального времени осуществляли «Набором реагентов для выявления ДНК Helicobacter pylori методом полимеразной цепной реакции» (ДНК-Технология, Россия) согласно инструкции производителя. Детекцию генов вирулентности H. pylori (vacA и cagA) проводили с использованием «Набора реагентов для обнаружения ДНК Helicobacter pylori методом ПЦР-РВ» (ЗАО «Синтол», Россия). Для оценки статистической значимости различий применяли расчет критерия χ² Пирсона для четырехпольных таблиц и расчет 95% доверительных интервалов по методу Уилсона.

Результаты

При выполнении данной работы нами был разработан и апробирован алгоритм исследования биоптатов СОЖ для обнаружения и идентификации H. pylori (рис. 1).

 

Рисунок. Алгоритм исследования биоптатов СОЖ для обнаружения, идентификации и характеристики H. pylori

Figure. Proposed diagnostic algorithm for the detection, identification, and characterization of H. pylori from gastric biopsies

 

При наличии показаний к обследованию пациента на H. pylori во время проведения эзофагогастродуоденоскопии выполняют Быстрый уреазный тест (БУТ). При его положительном результате осуществляют забор не менее двух биоптатов слизистой оболочки желудка (предпочтительно из тела и антрального отдела желудка) для дальнейшего бактериологического исследования на H. pylori. При отрицательном результате БУТ, но при подозрении на наличие данного микроорганизма (данные анамнеза, результаты эндоскопического исследования или других тестов) также возможен забор биоптатов для исследования. Биоптаты помещают в транспортную среду (стерильный физиологический раствор, 20% раствор глюкозы, тиогликоливая среда для контроля стерильности, коммерческие среды). Использование транспортных сред позволяет сохранять жизнеспособность H. pylori до 24 часов при условии хранения при температуре +4°C. При применении для транспортировки бульона для бруцелл с 20% содержанием глицерина возможно хранение образцов в замороженном виде при температуре –70°C. В лаборатории биоптаты гомогенизируют и проводят посев на селективные питательные среды. Инкубацию посевов осуществляют в анаэростатах в микроаэрофильных условиях при температуре 35–37°C. Видимый рост мелких, гладких, прозрачных, влажных колоний диаметром около 1 мм наблюдают через 4–7 дней инкубации. Для первичной идентификации мазки культур окрашивают по Граму. Видовую идентификацию клинических изолятов осуществляют с использованием биохимических тестов (уреазный, каталазный, оксидазный). При наличии грамотрицательных изогнутых палочек и положительном результате биохимических тестов выделенную культуру идентифицируют как H. pylori. Также проводят идентификацию культуры с помощью масс-спектрометрического анализа с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией с времяпролетным разделением (MALDI-ToF). После получения чистой культуры определяют ее чувствительность к антибактериальным препаратам (АБП) с учетом результатов через 72 часа инкубации в микроаэрофильных условиях при температуре 35–37°C. Для постановки теста используют градиетный метод диффузии в агар. Критерии оценки указаны в «The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 15.0, 2025, https://www.eucast.org».

Помимо бактериологического исследования, из каждого биоптата СОЖ дополнительно выделяют ДНК и исследуют методом ПЦР для обнаружения H. pylori. Молекулярный анализ также можно проводить, используя материал после постановки БУТ или зафиксированные в формалине образцы СОЖ, которые использовались для гистологического исследования. Преимуществом молекулярно-биологических методов исследования являются менее жесткие требования к срокам доставки и условиям транспортировки образцов, а также возможность отсроченного исследования, например, после получения заключения гистологического анализа. Кроме факта присутствия ДНК данного микроорганизма в исследуемом материале, на этом этапе возможно определение детерминант факторов вирулентности или мутаций, обуславливающих резистентность H. pylori к АБП при условии наличия соответствующих коммерческих тест-систем.

Для дальнейшего углубленного изучения штаммов проводят выделение ДНК микроорганизма и исследуют с помощью различных молекулярно-генетических методов (полногеномное секвенирование, MLST-типирование, ПЦР). Например, определяют наличие детерминант вирулентности, а также осуществляют поиск новых потенциальных маркеров резистентности H. pylori.

Результаты бактериологического исследования биоптатов СОЖ пациентов с различной патологией желудочно-кишечного тракта представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Частота выявления штаммов H. pylori из биоптатов СОЖ в зависимости от патологии

Table 1. Prevalence of H. pylori in gastric biopsies according to gastrointestinal pathology

Диагноз Diagnosis	Всего обследовано человек, n Total number of people examined, n	Выделено штаммов H. pylori, абс. (%) (95%ДИ) Isolated H. pylori strains, abs. (%) (95%CI)	ПЦР+, абс. (%) (95%ДИ) PCR+, abs. (%) (95%CI)
Хронический гастрит Chronic gastritis	478	158 (33,1%) (29,0–37,4)	230 (48,1%) (43,7–52,6)
Язвенная болезнь Peptic ulcer disease	85	35 (41,2%) (31,3–51,8)	49 (57,7%) (47,0–67,6)
Рак желудка Gastric cancer	42	4 (9,5%) (3,8–22,1)	15 (35,7%) (23,0–50,8)
Другое Other	3	0 (0%) (0–56,2)	0 (0%) (0–56,2)
Без патологии ЖКТ No pathology GUT	2	0 (0%) (0–65,8)	0 (0%) (0–65,8)
Итого Total	610	197 (32,3%) (29,0–37,4)	294 (48,2%) (44,3–52,2)

 

Как видно из полученных данных, частота выделения штаммов H. pylori с помощью культурального метода составила 33,1%. Относительно невысокий процент выделения может быть связан с требовательностью данного микроорганизма к условиям транспортировки и культивирования, а также неравномерностью распределения патогена по СОЖ, что также отмечают в своей работе Ansari S. с соавт. [3]. Частота выделения штаммов H. pylori варьировала в зависимости от тяжести инфекции: наибольший показатель был отмечен у пациентов с язвенной болезнью (41,2%), тогда как минимальный — при раке желудка (9,5%). Низкая частота выделения патогена при раке желудка, вероятно, связана с качественным изменением желудочного эпителия и образованием неблагоприятных условий для роста H. pylori [7, 11].

При исследовании биоптатов СОЖ и/или двенадцатиперстной кишки на наличие H. pylori с помощью метода ПЦР в 48,2% случаев был получен положительный результат. При этом при хроническом гастрите, язвенной болезни и раке желудка частота обнаружения H. pylori составила 48,1, 57,7 и 35,7% соответственно. У пациентов без перечисленных патологий и других заболеваний желудочно-кишечного тракта H. pylori не выявлен (табл. 1).

Кроме этого, в 537 биоптатах слизистой оболочки желудка с помощью метода ПЦР определяли наличие детерминант генов вирулентности H. pylori — vacA и cagA (табл. 2). Ген vacA H. pylori обнаружен у 48,0% образцов. При определении наличия данного гена в биоптатах в зависимости от нозологии обнаружено, что при хроническом гастрите, язвенной болезни и раке желудка частота обнаружения vacA H. pylori составила 47,4, 52,4 и 44,0% соответственно.

 

Таблица 2. Частота обнаружения генов vacA и cagA H. pylori в биоптатах СОЖ при различной желудочно-кишечной патологии

Table 2. Frequency of vacA and cagA H. pylori genes detection in gastric biopsy samples across different gastroduodenal pathologies

Диагноз Diagnosis	Количество обследованных, n Number of examined, n	Наличие гена vacА, абс. (%) (95%ДИ) The presence of the vacA gene, abs. (%) (95%CI)	Наличие гена cagA у vacA+ штаммов, абс. (%) (95%ДИ) Presence of the cagA gene in vacA+ strains, abs. (%) (95%CI)
Хронический гастрит Chronic gastritis	428	203 (47,4%) (42,7–52,2)	80 (39,4%) (32,9–46,3)
Язвенная болезнь Peptic ulcer disease	84	44 (52,4%) (41,8–62,7)	34 (77,3%) (63,0–87,2)
Рак желудка Gastric cancer	25	11 (44,0%) (26,7–62,9)	8 (72,7%) (43,4–90,3)
Всего Total	537	258 (48,0%) (43,8–52,3)	122 (47,3%) (41,3–53,4)

  

Ген vacA присутствует во всех штаммах H. pylori, поэтому в нашем исследовании он был маркером наличия патогена в образце. Ген cagA характерен только для части штаммов, поэтому была определена доля cagA-позитивных изолятов, которая, в целом, составила 47,3% (табл. 2). Доля cagA+ штаммов оказалась минимальной при хроническом гастрите — 39,4%, в отличие от долей при язвенной болезни — 77,3% (p < 0,001) и при раке желудка — 72,7% (p = 0,029). При других заболеваниях желудочно-кишечного тракта и отсутствии патологии генов vacA и cagA H. pylori не обнаружено.

Заключение

Таким образом, при исследовании биоптатов СОЖ и/или двенадцатиперстной кишки с помощью метода ПЦР частота обнаружения H. pylori составила 48,2%, что значимо выше, чем при бактериологическом исследовании этих же биоптатов (32,3%). При раке желудка частота обнаружения ДНК H. pylori была минимальной и составила 35,7%, что коррелировало с наименьшим процентом выделения микроорганизма культуральным методом при данной патологии (9,5%). Частота обнаружения гена vacA H. pylori в биоптатах составила 48,0%, при этом доля cagA-позитивных штаммов была 47,3%. Следует отметить, что использование бактериологического метода исследования при H. pylori-инфекции обосновано, главным образом, необходимостью определения резистентности микроорганизма к АБП и не рекомендуется для первичной диагностики ввиду его относительно низкой чувствительности. Более того, культивирование бактериальных штаммов требует много времени (до 7–14 дней), наличия квалифицированного персонала и значительных ресурсов, что делает метод дорогостоящим. Тем не менее бактериологический метод является одним из самых надежных, обеспечивая специфичность диагностики до 100%. Представленный алгоритм может быть использован в микробиологической практике для диагностики инфекции, ассоциированной с H. pylori, а также для эпидемиологического мониторинга и в научно-исследовательских целях.

About the authors

Alena V. Svarval

St. Petersburg Pasteur Institute

Author for correspondence.
Email: alenasvar@rambler.ru

PhD (Medicine), Senior Researcher, Head of the Pathogens Identification Laboratory

Russian Federation, St. Petersburg

D. A. Starkova

St. Petersburg Pasteur Institute

Email: alenasvar@rambler.ru

PhD (Biology), Senior Researcher of the Pathogens Identification Laboratory, Researcher of the Laboratory of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics

Russian Federation, St. Petersburg

L. A. Kaftyreva

St. Petersburg Pasteur Institute; North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: alenasvar@rambler.ru

DSc (Medicine), Leading Researcher, Typhoid Epidemiology Research Group, Professor, Department of Medical Microbiology

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

References

Supplementary files