Assessing a possibility of using atomic emission spectrometry for hypermucoid klebsiella differentiation

Full Text

Введение

Клебсиеллезные инфекции продолжают оставаться серьезной проблемой здравоохранения, особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии (орит) [2, 3, 4]. По данным российского многоцентрового исследования «Эмми» на долю K. pneumoniae, выделяемых из различных биолокусов пациентов орит, приходится 35,48%, при этом мультирезистентность этих возбудителей достигает 75% [1]. В связи с широким разнообразием штаммов клебсиелл [3, 7] продолжает совершенствоваться лабораторная диагностика клебсиеллезных инфекций, направленная на ускорение получения результатов с целью определения стратегии лечения конкретного пациента, в зависимости от биологических свойств возбудителя.

Перспективными и высокоспецифичными методами являются различные виды спектрометрии. В практике уже активно используется времяпролетная масс-спектрометрия (matrix-assisted lazer desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry; maldi-tof), активно разрабатывается и внедряется рамановская спектроскопия комбинационного рассеяния. При этом частотные характеристики штаммов высокоспецифичны, что позволяет использовать эти методы для идентификации бактерий. Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (АЭС-ИСП) — еще один вид спектрометрии, который часто используется в фармакологии для идентификации и количественного определения элементов в лекарственных средствах¹. Бактериальная клетка содержит большое количество элементов, необходимых для жизнедеятельности. Часть из них участвуют в формировании органоидов бактерий, другие элементы являются кофакторами ферментных систем, определяющих адаптационный потенциал микроорганизмов: трофические особенности [8], вирулентность [5, 6], резистентность к антимикробным препаратам и к факторам иммунной системы человека [9]. В связи с недостаточностью данных о связи элементного состава и биологических свойств клебсиелл, проведено поисковое исследование, направленное на оценку возможности использования метода АЭС-ИСП в лабораторной диагностике клебсиеллезных инфекций.

Цель исследования: определить особенности элементного состава гипермукоидных Klebsiella pneumoniae для выявления АЭС-маркеров, перспективных в дифференциации разных субпопуляций клебсиелл.

Материалы и методы

Проведено исследование элементного состава 30 клинических штаммов K. pneumoniae, выделенных из мокроты пациентов отделения реанимации гауз «Кузбасская клиническая больница скорой медицинской помощи имени М.А. Подгорбунского». Дизайн исследования — одномоментное, с формированием 2 групп K. pneumoniae: гипермукоидные (hmKp) (n = 12) и классические (cKp) (n = 18).

Все штаммы клебсиелл выделяли из мокроты пациентов в этиологически значимых количествах с последующей идентификацией в полимеразной цепной реакции по конечной точке и использованием коммерческой тест-системы «РеалБест ДНК Klebsiella pneumoniae/Pseudomonas aeruginosa (комплект 1)» (ао «Вектор-Бест», Россия). Гипермукоидный фенотип у штаммов, определяли, используя «string»-тест — длина тянущейся за бактериологической петлей нити от колонии на кровяном агаре составляла не менее 5 мм.

Для АЭС-ИСП использовали суточные культуры K. pneumoniae, из которых готовили взвесь на воде деионизированной мутностью 0,5 ед. Макфарленда. Для анализа использовали навеску массой 0,2 мг, которую доводили до объема 4 мл концентрированной азотной кислотой квалификации (superpure) cas 7697-37-2 и проводили автоматическую минерализацию в течение 2 мин при 160°C с помощью станции пробоподготовки «Topex+» (Preekem Ltd., КНР).

Содержание элементов в бактериальных образцах определяли на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой icp-aes 9820 (Shimadzu, Япония). В качестве контроля использовали 2% пептонную воду, в качестве стандарта — «Мультиэлементный стандарт 23 элементов, 1000 мг/л» (Merck kgaa, Германия). Обработку результатов вели с использованием ПО icpe-9820, version 1.11. С расчетом содержания отдельных элементов в бактериальных клетках в процентах по массе.

Для статистической обработки результатов использовали программу ibm spss Statistics («ibm/predictive solutions»). Нормальность распределения данных определяли графически. Данные, полученные на несвязанных совокупностях, отличались от нормального распределения, в работе они представлены в процентах по массе с 95% доверительным интервалом. Для сравнения данных использовали критерий χ². Различия считали достоверно значимыми при p < 0,05.

Результаты

В бактериальных образцах было обнаружено 18 химических элементов. Установлено, что общая масса элементов у hmKp составила 1236,137 мкг, у штаммов с классическим фенотипом колоний — 2598,575 мкг. Макроэлементы у hmKp и cKp были представлены серой, натрием, калием, фосфором, кальцием, медью. На них приходилось более 80% по массе всего элементного состава бактериальных образцов (табл. 1).

 

Таблица. Содержание элементов (в процентах по массе) у Klebsiella pneumoniae с гипермукоидным и классическим фенотипом колоний

Table. Elemental content (in percent by weight) in Klebsiella pneumoniae with hypermucoid and classical colony phenotypes

Элемент Element	hmKp, %	cKp, %	95% ДИ 95% CI	${\mathit{\chi }}_{\left(1\right)}^{\mathbf{2}}$	p
S	25,45	17,47	5,19–10,9	33,27	0,0001
Na	18,2	42,0	20,7–26,6	210,4	0,0001
K	17,89	8,98	5,70–8,40	67,39	0,0001
P	16,68	17,2	0–2,96	0,137	0,71
Cu	6,57	4,86	0,17–3,41	4,784	0,03
Ca	3,86	2,82	0–2,39	2,964	0,09
Cr	2,61	1,16	0,55–2,55	10,99	0,0009
Mg	2,25	1,98	0–1,36	0,302	0,58
Fe	1,82	0,69	0,4–2,07	10,25	0,0014
Al	1,17	0,80	0–1,19	1,259	0,26
Ni	0,97	0,13	0,37–1,56	14,80	0,0001
Mn	0,84	0,20	0,18–1,33	8,475	0,0036
Mo	0,73	0,47	0–0,94	1,028	0,3102
V	0,33	0,26	0–0,59	0,146	0,7
Co	0,23	0,23	0–0,31	0,000	1,0
Si	0,22	0,21	0–0,48	0,004	0,95
Zn	0,16	0,16	0–0,27	0,000	1,0
Se	0,03	0,04	0–0,19	0,023	0,88

 

Массовая доля никеля, марганца, молибдена, ванадия, кобальта, кремния, цинка и селена у слизеобразующих штаммов была меньше 1% для каждого из элементов, у cKp к этому перечню были еще отнесены железо и алюминий. Содержание от 1 до 3% по массе у hmKp отмечали для хрома, магния, железа и алюминия. В минерализованных образцах hmKp, по сравнению с cKp, получены достоверно более высокие показатели массовых долей таких химических элементов, как сера (p = 0,0001), калий (p = 0,0001), медь (p = 0,03), хром (p = 0,0009), железо (p = 0,0014), никель (p = 0,0001), марганец (p = 0,0036) (табл.).

Обсуждение

По результатам АЭС-ИСП установлено, что у hmKp отмечается достоверно более высокая массовая доля серы, чем у cKp. Это может с одной стороны отражать более высокое содержание белков у слизеобразующих штаммов, с дугой стороны свидетельствовать о более интенсивных процессах синтеза пирувата, как источника питания, под воздействием цистеиндесульфгидразы — специфического серосодержащего фермента K. pneumoniae. Также у hmKp отмечается достоверно высокая массовая доля железа, по сравнению с cKp. Железо входит в состав ферментов цитохромов, железо-серопротеидов и фермента антиоксидантной системы — каталазы. Но очень часто содержание железа ассоциируют с вирулентностью микроорганизмов [6]. У K. pneumoniae железо регулирует промотор хромосомных фимбрий 3 типа и образование биопленок [5].

У hmKp массовая доля марганца была в 4 раза выше, чем у cKp. Марганец обеспечивает активность дегидрогеназ и декарбоксилаз — основных ферментов цикла трикарбоновых кислот [8]. Калий у hmKp также имел высокую массовую долю. Известно, что калий выступает в качестве катализатора гидролиза атф. Немаловажную роль для микроорганизмов играет медь, которая связана с ферментами дыхания — цитохромоксидазами и оксигеназами. Содержание меди у гипермукоидных штаммов было в 1,4 раза выше, чем у cKp. Никель у клебсиелл ассоциирован с ферментом уреазой, которая используется бактериями для получения азота из мочевины и в некоторых случаях рассматривается как фактор вирулентности. Никеля у hmKp было в 7,5 раза выше в процентах по массе, чем у cKp. Таким образом, у штаммов клебсиелл, обладающих способностью к слизеобразованию установлены особенности состава и перспективные маркерные элементы, косвенно свидетельствующие об особенностях физиологии возбудителей — активном катаболизме углеводов и синтезе большого количества энергии. Полученные результаты раскрывают перспективы дальнейшей работы по определению референсных значений содержания маркерных элементов у клебсиелл с разными биологическими свойствами.

Заключение

У K. pneumoniae с гипермукоидным фенотипом колоний массовая доля никеля в 7,5 раз (p = 0,0001), марганца в 4 раза (p = 0,0036), железа в 2,6 раз (p = 0,0014), калия в 2 раза (p = 0,0001), серы в 1,5 (p = 0,0001), меди в 1,4 раза (p = 0,03) выше, чем у классических штаммов, что делает перспективными названные элементы для дифференциальной диагностики слизеобразующих штаммов с помощью АЭС-ИСП.

 

¹ ОФС.1.2.1.1.0017. Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой. М.: Министерство здравоохранения Российской Федерации. 11 с.

About the authors

Mariya G. Bikanova

Kemerovo State Medical University of Ministry of Health of Russia

Author for correspondence.
Email: bmg1321@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7482-4887

Senior Lecturer at the Department of Microbiology and Virology

Russian Federation, Kemerovo

Y. V. Zakharova

Kemerovo State Medical University of Ministry of Health of Russia

Email: yvz@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-3475-9125
SPIN-code: 5272-4787

DSc (Medicine), Associate Professor, Professor of the Department of Microbiology and Virology

Russian Federation, Kemerovo

A. S. Sukhikh

Kemerovo State University

Email: suhih_as@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-9300-5334
SPIN-code: 6427-5667

PhD (Pharmacy), Associate Professor, Head of the Laboratory of Physical and Chemical Research of Pharmacologically Active and Natural Compounds, Medical Institute

Russian Federation, Kemerovo

References

Supplementary files