Tuberculoma caseous necrosis-derived bacteria (Corynebacterium and Staphylococcus) enhance granuloma formation in vitro and stimulate mycobacterial biofilm development

Full Text

Введение

Биопленки Mycobacterium tuberculosis играют важную роль в устойчивости к антибиотикам, формировании гранулем, казеации некроза и деструкции легочной ткани [4]. Показана способность M. tuberculosis образовывать смешанные биопленки in vitro [6], однако взаимодействие патогенных микобактерий с микробиотой туберкулезных очагов остается неисследованным. Особый интерес представляет также влияние сопутствующей микробиоты на гранулематозное воспаление — центральное звено патогенеза туберкулеза.

Ранее нами были выделены и охарактеризованы как патобиота туберкулезных очагов клинические штаммы Corynebacterium kefirresidentii и Staphylococcus epidermidis [1, 9]. Штамм C. kefirresidentii индуцирует специфический гуморальный иммунный ответ у больных [2], что указывает на его потенциальную роль в патогенезе туберкулеза легких. Целью данной работы стало исследование влияния сателлитных бактерий, выделенных из туберкулезных очагов, на рост M. bovis и M. tuberculosis-индуцированный гранулемогенез in vitro как важных компонентов патологического процесса.

Материалы и методы

Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами (протокол № 4 локального комитета ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ от 16.11.2020). В работе использованы клинические изоляты C. kefirresidentii и S. epidermidis (штаммы 2206/1 и 2206/2), выделенные из казеозного некроза больных туберкулезом легких [1, 9], а также бактериальные лизаты штаммов в концентрациях 10 и 100 мкг/мл по общему белку [2].

Для исследования межвидовых взаимодействий проводили совместное культивирование аттенуированного вакцинного штамма Mycobacterium bovis var. BCG-1 (Россия) и C. kefirresidentii. Штамм M. bovis var. BCG-1 (Россия) получен из лиофилизированной туберкулезной вакцины (БЦЖ). M. bovis BCG предварительно выращивали на среде Левенштейна–Йенсена, C. kefirresidentii — на агаризованной среде BHI Broth (HiMedia, Индия) с добавлением 0,1% Tween-80 (Panreac AppliChem, Германия). Бактерии суспендировали в фосфатно-солевом буфере, суспензии стандартизировали до 0,2 единиц МакФарланда (McF). Совместное культивирование проводили в модифицированной среде Школьниковой, содержащей 0,1% Tween-80 и 2% эмбриональной телячьей сыворотки (Corning, США). Бактериальные суспензии смешивали в соотношении 1:1 и инкубировали при 37°C в течение 48 суток. В качестве контроля использовали монокультуры каждого микроорганизма. Для каждого варианта культивирования выполняли 5 биологических повторов. Динамику роста оценивали измерением оптической плотности при 565 нм на денситометре DEN-1 (Латвия) и выражали в единицах McF, а также расчетом площади под кривой роста (AUC). На 14-е сутки готовили мазки, окрашивали по Цилю–Нильсену и азуром I.

Для анализа влияния бактериальных компонентов C. kefirresidentii и S. epidermidis (штаммы 2206/1 и 2206/2) на рост микобактерий проводили их совместное культивирование с клиническим изолятом M. tuberculosis Beijing B0/W148 высокой степени патогенности, устойчивым ко всем противотуберкулезным препаратам 1-го ряда (лабораторный номер образца 2346-21), полученным из коллекции микобактериальных культур ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Минздрава России. Изолят 2346-21 был выделен в г. Новосибирск в 2022 г. из образца мокроты пациента с подтвержденным впервые выявленным туберкулезом легких (диагноз – инфильтративный туберкулез легких). Определение принадлежности штамма к генетической линии проводилось на базе микробиологической лаборатории ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Минздрава России методом гибридизации на чипах с использованием тест-системы «ТБ-БИОЧИП» производства Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта.Суспензию клинического изолята M. tuberculosis Beijing B0/W148 (10⁵ КОЕ/лунку) инкубировали с исследуемыми лизатами в культуральной среде RPMI-1640 (Панэко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и L-глютамина при 37°C и 5% CO₂ в течение 7 суток. Динамику роста микобактерий оценивали измерением оптической плотности при 450 нм на спектрофотометре INNO-S (LTEK, Республика Корея).

Для моделирования гранулемообразования применяли модифицированную методику in vitro [3]. Совместное культивирование перитонеальных макрофагов (2 × 10⁵/мл) и спленоцитов (8 × 10⁵/мл) мышей линии C57BL/6 с изолятом M. tuberculosis Beijing B0/W148 проводили в трехмерном матриксе Matrigengel с феноловым красным (ABW, Китай). В экспериментальные группы вносили бактериальные лизаты в указанных концентрациях. Культивирование проводили при 37°C и 5% CO₂ в течение 7 суток, после чего оценивали количество сформированных гранулемоподобных структур на конфокальном микроскопе Zeiss LSM700 при увеличении 200.

Статистическую обработку данных проводили в GraphPad Prism (версия 8.0.1). Нормальность распределения оценивали по W-критерию Шапиро–Уилка. Статистическую значимость различий дискретных данных в группах проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с post-hoc-тестами Тьюки или Даннетта, а номинальных — с использованием критерия χ² Пирсона, и принимали при уровне значимости p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Совместное культивирование M. bovis BCG и C. kefirresidentii привело к быстрому формированию биопленки на границе раздела фаз воздух-жидкость. Макроскопически биопленка проявлялась в виде пелликла, видимого уже на 7-е сутки и сформировавшего зрелую биопленку к 14-м суткам (рис., А). Клетки контрольной культуры M. bovis BCG образовывали мелкие флотирующие фрагменты пленки, в то время как контрольная культура C. kefirresidentii имела слабый рост, но сохраняла жизнеспособность при пересеве на среду BHI Broth. При окраске биопленки по Цилю–Нильсену (рис., Б) идентифицированы агрегаты кислотоустойчивых бактерий, организованные в корды — морфологический признак, ассоциированный с вирулентностью микобактерий и их способностью индуцировать гранулематозное воспаление [5]. При окрашивании азуром I была визуализирована плотная слизеподобная структура фиолетово-синего цвета, инкапсулирующая бактериальные клетки (рис., В), что свидетельствует о возможной мукополисахаридной природе данного внеклеточного матрикса.

 

Рисунок. Биопленка M. bovis BCG и C. kefirresidentii: макроскопия на 14 сутки (А); окраска по Цилю–Нильсену (Б) и азуром I (В), масштабная линейка — 10 мкм; динамика роста культур (Г), среднее значение McF±SD, n = 5

Figure. Biofilm of M. bovis BCG and C. kefirresidentii: macroscopic view on day 14 (A); Ziehl–Neelsen (B) and Azure I (C) staining, scale bar — 10 µm; growth dynamics (D), mean McF±SD, n = 5

 

Количественная оценка динамики роста культур показала значимые различия между экспериментальными группами (рис., Г). В совместной культуре наблюдалась пролонгированная экспоненциальная фаза роста, с достижением максимальной биомассы к 41-м суткам, тогда как монокультуры микобактерий и коринебактерий демонстрировали значительно более низкие показатели роста. Интегральная оценка биомассы достоверно подтвердила более интенсивный рост совместной биопленки (AUC = 101,3±2,34) над монокультурами M. bovis BCG (AUC = 19,38±0,55) и C. kefirresidentii (AUC = 26,8±1,29) (one-way ANOVA, p < 0,0001; post hoc-тест Тьюки p < 0,0001 для обоих сравнений). Полученные данные убедительно демонстрируют, что C. kefirresidentii может существенно усиливать рост микобактерий и стимулировать биопленкообразование. Решающее значение имеет именно метаболическая активность комменсалов, поскольку клеточные лизаты C. kefirresidentii и S. epidermidis (штаммы 2206/1 и 2206/2) оказывали минимальное ингибирующее действие на рост клинического изолята M. tuberculosis Beijing B0/W148 при совместном культивировании в течение 7 суток (табл. 1).

 

Таблица 1. Динамика роста M. tuberculosis Beijing B0/W148 с лизатами C. kefirresidentii и S. epidermidis (М±SD)

Table 1. Growth dynamics of M. tuberculosis Beijing B0/W148 with C. kefirresidentii and S. epidermidis lysates (М±SD)

Группа Group	Концентрация лизата, мкг/мл Lysate concentration, μg/ml	Оптическая плотность Optical density	p
Контроль/Control	–	0,26±0,02	–
C. kefirresidentii	10	0,24±0,008	p = 0,01
	100	0,26±0,02	p = 0,79
S. epidermidis 2206/1	10	0,22±0,01	p < 0,0001
	100	0,24±0,008	p = 0,01
S. epidermidis 2206/2	10	0,26±0,02	p > 0,9
	100	0,23±0,01	p = 0,0002

Примечание. Контроль — клетки без лизатов; p — уровень статистической значимости по критерию one-way ANOVA с post-hoc-тестом Даннетта.

Note. Control — cells without lysates; p — statistical significance level by one-way ANOVA with Dunnett’s post hoc test.

 

Установленные особенности изученных представителей микробиоты туберкулезных очагов позволили предположить их участие в модуляции иммунных реакций. Ключевым элементом иммунного ответа на туберкулезную инфекцию является формирование гранулемы [8], однако избыточная активация этого процесса может способствовать поддержанию персистирующего воспаления [7]. Использование экспериментальной модели гранулематозного воспаления in vitro, индуцированного клиническим штаммом M. tuberculosis Beijing B0/W148, позволило выявить значительное влияние C. kefirresidentii и S. epidermidis (штаммы 2206/1 и 2206/2) на развитие раннего иммунного ответа. Лизаты C. kefirresidentii и S. epidermidis существенно усиливали гранулемогенез, что подтверждалось значимым увеличением количества и размера клеточных агрегатов по сравнению с контролем (p < 0,01) (табл. 2). Особенно выраженный эффект наблюдался при использовании лизатов S. epidermidis (2206/1 в концентрации 10 мкг/мл, 2206/2 — 100 мкг/мл), что приводило к формированию крупных клеточных скоплений (> 50 клеток), отсутствующих в контроле (p ≤ 0,01). Аналогичный, но менее сильный эффект наблюдался для штамма C. kefirresidentii в концентрации 100 мкг/мл (p < 0,001). Следует учитывать тот факт, что данная модель с использованием иммуноцитов животных может не полностью воспроизводить особенности гранулемогенеза у человека, а применение цельных бактериальных лизатов, содержащих смесь бактериальных антигенов, не позволяет точно установить природу активного компонента, ответственного за наблюдаемый эффект, что требует дальнейших исследований.

 

Таблица 2. Количество гранулемоподобных клеточных скоплений разного размера при инкубации макрофагов и спленоцитов мыши с лизатами Corynebacterium и Staphylococcus

Table 2. Number of granuloma-like cell aggregates of different sizes after incubation of mouse macrophages and splenocytes with Corynebacterium and Staphylococcus lysates

Гранулемо-подобные структуры Granuloma-like structures	Контроль Control (1)	Бактериальный лизат, концентрация, мкг/мл Bacterial lysate, concentration, μg/ml						p
		C. kefirresidentii		S. epidermidis 2206/1		S. epidermidis 2206/2
		10 (2)	100 (3)	10 (4)	100 (5)	10 (6)	100 (7)
Малые Small	15 (88%)	0 (0%)	3 (11%)	11 (39%)	13 (43%)	4 (31%)	13 (45%)	p1–2 < 0,001 p1–3 < 0,001 p2–3 = 0,026 p1–4 = 0,003 p1–5 = 0,01 p4–5 = 0,015 p1–6 = 0,004 p1–7 = 0,01 p6–7 = 0,49
Средние Middle	2 (12%)	15 (100%)	17 (63%)	7 (25%)	15 (50%)	6 (46%)	8 (28%)
Крупные Large	0 (0%)	0 (0%)	7 (26%)	10 (36%)	2 (7%)	3 (23%)	8 (28%)
Всего Total	17	15	27	28	30	13	29

Примечание. Абсолютное количество гранулемоподобных структур разных типов (% от общего количества структур в каждой группе): малые (10–20 клеток), средние (20–40 клеток), крупные (более 50 клеток); контроль — клетки без лизатов; p — уровень значимости по критерию χ² Пирсона.

Note. Absolute numbers of granuloma-like structures of different types (% of the total number of structures in each group): small (10–20 cells), medium (20–40 cells), large (more than 50 cells); control — cells without lysates; p — statistical significance level by Pearson’s χ² test.

 

Заключение

Впервые выявлен феномен стимуляции формирования биопленки микобактериями и усиленного образования гранулемоподобных структур под действием штаммов сателлитной микробиоты (C. kefirresidentii и S. epidermidis), выделенных из туберкулезного очага. В сочетании с ранее выявленной способностью C. kefirresidentii индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ у больных туберкулезом легких [3] эти данные свидетельствуют о вероятной роли сопутствующей микробиоты в патогенезе туберкулезной инфекции, в том числе на этапе хронизации. Можно предполагать, что эти процессы протекают через модуляцию воспалительного ответа хозяина при туберкулезе за счет дополнительных взаимодействий между M. tuberculosis и сателлитными микроорганизмами.

About the authors

Elizaveta A. Orlova

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Author for correspondence.
Email: elizaveta.a.orlova@gmail.com

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Epidemic and Social Infections

Russian Federation, Irkutsk

O. B. Ogarkov

Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems

Email: elizaveta.a.orlova@gmail.com

DSc (Medicine), Director of the Institute of Epidemiology and Microbiology

Russian Federation, Irkutsk

Ya. Sh. Schwartz

Novosibirsk Tuberculosis Research Institute of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: elizaveta.a.orlova@gmail.com

DSc (Medicine), Deputy Director

Russian Federation, Novosibirsk

A. P. Lykov

Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology — Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: elizaveta.a.orlova@gmail.com

DSc (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Cellular Technologies, Research Institute of Clinical and Experimental Lymрhology

Russian Federation, Novosibirsk

E. K. Nemkova

Novosibirsk Tuberculosis Research Institute of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: elizaveta.a.orlova@gmail.com

Junior Researcher, Department of Applied Scientific Research

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files