Impact of Candida spp. metabolites on human skin fibroblasts

Cover Page

Cite item

Abstract

Micromycetes spp. have been increasingly involved in the etiology of infectious diseases guiding to consider them not as important as bacterial and viral pathogens. Nowadays, a lot of severe forms of candidiasis are caused by C. auris, C. albicans, whereas C. glabrata and C. krusei are of similar importance. Members of these species were selected to investigate related metabolite action on human skin fibroblasts. Candida spp. being continuously found on the epithelium and mucosal membranes resulting in to sustained interaction between microbiota and human cells. Potential to produce metabolites containing pathogenicity factors is one of the crucial events for transition to invasive candidiasis, wherein human epithelial cells build up the front line of defense barrier preventing Candida spp. invasion into deeper host tissues. The study was aimed at assessing data on metabolite effects derived from epidemiologically relevant Candida spp. on primary human skin fibroblast culture in vitro. In particular, there were analyzed Candida spp. metabolites acting on fibroblast monolayer integrity and viability in cell suspension. It was found that Candida spp. metabolites might directly cause fibroblast death so that biocidal activity was exhibited as a strain-specific feature. A direct biocidity against dermal cells was more typical for strains C. glabrata и C. krusei, less pronounced for C. albicans and very weak for C. auris. In addition, a mechanism for secretory product-related biocidal activity derived from various Candida spp. on dermal fibroblasts in vitro revealed that it resulted in fibroblasts death 1 hour after exposure that peaked at 3 hrs. Cell death was equally proceeded via apoptosis and necrosis. Of note, biocidal effect of fungal metabolites showed no correlation with Candida-related potential to cleave intercellular junctions. It was found that C. auris metabolites showing weak biocidity against some fibroblasts simultaneously resulted in more marked disruption of cell monolayer compared to other Candida spp. Perhaps, it is just a feature of C. auris that might account for its higher invasiveness potential allowing to destroy tight human tissues more effectively compared to other Candida spp.

Full Text

Введение

Микромицеты рода Candida являются основной причиной внутрибольничных микозов, в том числе инфекций кровотока. Значительный вклад в развитие тяжелых форм оппортунистических кандидозов вносят преимущественно C. albicans и C. glabrata [4, 5, 15]. С. krusei не так часто выделяют из клинического материала, как другие виды кандид, но они также способны вызывать тяжелые инфекции у иммунокомпрометированных лиц [4, 6]. Кроме того, в последние годы наблюдается рост системных микозов, связанных с относительно новым патогеном — C. auris [3, 7, 11, 12]. Инфекция, вызванная C. auris, может представлять глобальную угрозу здоровью населения из-за высокого уровня смертности, достигающей, по некоторым данным, 60% [9].

Эпителиальные клетки человека функционируют как первый барьер, препятствующий инвазии Candida spp. во внутренние ткани хозяина. Для преодоления этого барьера кандиды могут использовать различные механизмы: адгезины, секрецию ферментов, морфологическую трансформацию и др. Известно, что C. albicans синтезируют широкий спектр экзоферментов, в частности аспартилпротеазы и фосфолипазы, которые могут способствовать повреждению слизистых оболочек, кожи человека и инвазии в ткани [2, 14, 15]. Ферменты патогенности других видов кандид менее изучены. Полагают, что C. glabrata в основном используют аспарагиновые протеазы [5], C. krusei — фосфолипазы [6].

Высокая способность кандид колонизировать эпителиальные ткани часто формирует систему устойчивого взаимодействия микроорганизма и здорового человека — кандидоносительство. В то же время способность продуцировать метаболиты, содержащие факторы патогенности, является одним из важных факторов перехода от носительства к инвазивному кандидозу у пациентов со сниженным иммунитетом [15]. Таким образом, оценивая агрессивность фунгальных метаболитов в отношении клеток кожи или слизистых, можно оценить инвазивный потенциал различных видов кандид.

Цель настоящего исследования — характеристика результатов воздействия метаболитов эпидемиологически значимых видов кандид на нормальные фибробласты кожи человека.

Материалы и методы

В работе использовали клинические изоляты С. albicans (штаммы 195, 258, 290, 601), С. auris (штаммы 70, 78, 84, 95), С. krusei (штаммы 489, 583, 780) и С. glabrata (44-1, 294, 584). Продукты секреции кандид (метаболиты) получали после культивирования (37°С, 24 ч) микромицетов в жидкой среде Сабуро (HiMedia, Индия) путем сепарации от клеток при помощи фильтра (Corning, Германия) с диаметром пор 0,2 мкм. В каждом эксперименте использовали метаболиты только одного штамма кандид.

В качестве объекта воздействия метаболитов использовали нормальные (без патологии) фибробласты кожи человека как в виде суспензии изолированных клеток, так и в виде монослоя. Монослой фибробластов получали путем культивирования (48 ч, 37°С, 5% СО2) клеток в среде DMEM (Панэко, Москва) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки в пластиковых 12- и 96-луночных планшетах Corning (Германия).

Оценка прямого биоцидного действия метаболитов кандид. Готовили суспензию изолированных фибробластов (3 × 106/мл), предварительно обработанных 0,25% раствором трипсина. К 50 мкл взвеси клеток добавляли 300 мкл метаболитов, в контроле — среду Сабуро. Фибробласты термостатировали (37°С, 1–3 часа), затем отбирали 20 мкл суспензии клеток и окрашивали 0,4% водным раствором трипанового синего. Подсчет жизнеспособных (неокрашенных) клеток проводили на счетчике TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, США).

Оценка цитопатического действия метаболитов кандид. К монослою фибробластов, выращенных в 12-луночном планшете, добавляли 1 мл метаболитов кандид (в контроле — стерильную среду Сабуро), затем термостатировали (37°С, 24 ч). После инкубации монослой клеток микроскопировали с помощью Leica DM IL (Германия).

Оценка апоптоза и некроза фибробластов. Для определения механизма гибели фибробластов использовали окрашивание клеток по технологии Apoptosis/Necrosis Detection Kit (ab176950, США). Согласно протоколу, в случае некроза мембранный краситель DNA Nuclear Green окрашивает ядерные мембраны поврежденных фибробластов в зеленый цвет; при апоптозе накопление фосфатидилсерина в клетках отмечается флуоресцентым красителем красного цвета. К монослою фибробластов, выращенных в 96-луночном планшете, добавляли метаболиты кандид (200 мкл в одну лунку), инкубировали при 37°С. Контролем служила культура фибробластов в стерильной среде Сабуро. Через 1 и 3 часа от начала инкубации выявляли в монослое наличие клеток, имеющих признаки апоптоза или некроза/позднего апоптоза при помощи флуоресцентного микроскопа (Leica DM IL, Германия).

Все эксперименты ставили в трех повторах. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни в программе Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Через час после добавления метаболитов кандид к суспензии фибробластов в ряде случаев отмечалась гибель клеток, которая усиливалась к трем часам от начала эксперимента (табл.). При этом наблюдалась следующая тенденция: чаще всего агрессивность фунгальных метаболитов в отношении фибробластов была отмечена у штаммов C. glabrata и C. krusei, наименьший биоцидный эффект наблюдали у штаммов C. auris. Так, продукты секреции C. glabrata и C. krusei обладали существенным (p < 0,05) биоцидным действием в отношении фибробластов. Наиболее выражена биоцидность у штамма C. glabrata 44-1: его метаболиты в течение 3 часов увеличивали количество погибших фибробластов в 14,24±9,1 раза (p < 0,05). Метаболиты C. glabrata 294, C. glabrata 584, C. krusei 780 и C. albicans 601 через три часа инкубации вызывали гибель почти половины (42–49%) фибробластов в суспензии, а метаболиты C. auris 70 были способны индуцировать гибель около 13% фибробластов по окончании 3-часового эксперимента (табл.).

 

Таблица. Влияние метаболитов Candida spp. на жизнеспособность дермальных фибробластов человека

Table. Candida spp. metabolites influence on dermal human fibroblasts viability

Штаммы кандид

Candida strains

Процент жизнеспособных фибробластов после 1- и 3-часовой инкубации с метаболитами кандид

Percentage of viable fibroblasts 1- and 3-hour after incubation with Candida metabolites

Кратность снижения жизнеспособности фибробластов относительно контроля

Fold decrease in fibroblast viability compared to control

1 ч/1 h

3 ч/3 h

1 ч/1 h

3 ч/3 h

Контроль/Control

98,67±0,58

96,67±0,57

C. albicans 195

96,67±1,53

96,00±2,00

1,02±0,02

1,01±0,02

C. albicans 258

95,33±1,66

93,26±1,71

1,04±0,03

1,06±0,02

C. albicans 290

92,00±1,00

92,00±1,20

1,07±0,01

1,05±0,01

C. albicans 601

87,25±2,36*

41,50±5,25*

1,12±0,01*

2,27±0,26*

C. auris 70

92,75±0,58*

80,00±1,53*

1,05±0,01

1,19±0,02*

C. auris 78

97,82±0,79

96,22±2,03

1,02±0,02

1,04±0,02

C. auris 84

98,00±1,00

97,67±0,58

1,01±0,01

0,98±0,01

C. auris 95

97,33±0,57

96,33±2,08

1,01±0,01

1,01±0,03

C. glabrata 44-1

65,67±1,53*

7,50±5,57*

1,50±0,03*

14,24±9,10*

C. glabrata 294

89,00±6,56*

40,25±11,24*

1,11±0,08*

2,31±0,56*

C. glabrata 584

91,14±4,22*

56,71±7,35*

1,07±0,04

1,78±0,23*

С. krusei 489

93,35±2,33*

87,29±3,13*

1,04±0,03

1,12±0,04*

С. krusei 583

94,00±2,01*

84,67±3,21*

1,05±0,03

1,14±0,05*

С. krusei 780

90,67±4,04*

50,33±6,80*

1,09±0,04

1,94±0,25*

Примечание. * — статистически значимые различия c контролем (p < 0,05).

Note. * — significant differences with control group (p < 0,05).

 

Для последующих экспериментов с монослоем дермальных фибробластов были отобраны штаммы C. glabrata 44-1, C. albicans 601, С. krusei 780 и C. auris 70 как обладающие максимальным биоцидным потенциалом среди представителей вида. Монослой фибробластов инкубировали (37°С) с продуктами метаболизма каждого штамма кандид в течение 1, 3 или 24 часов.

Эксперименты показали, что кратковременное (до 3 часов) воздействие метаболитов всех исследуемых штаммов на культуру фибробластов не меняло ее морфологию. В то же время 24-часовое воздействие метаболитов C. auris 70 приводило к изменению структуры монослоя (рис., А, III обложка). Данный цитопатический эффект проявлялся в том, что фибробласты в значительной мере утрачивали межклеточные связи и отслаивались одиночно или небольшими группами от поверхности планшета; форма клеток существенно менялась.

Суточное воздействие метаболитов C. albicans 601 также способствовало нарушению структуры монослоя, но в меньшей степени: слой фибробластов разрыхлялся, клетки округлялись, однако сцепление с поверхностью планшета сохранялось (рис., А). В то же время инкубация культуры фибробластов с метаболитами С. krusei 780 или C. glabrata 44-1 не приводила к существенным изменениям в структуре монослоя клеток (рис., А). Стоит отметить, что проведение дополнительных экспериментов с другими штаммами C. auris подтвердило ведущие позиции данного вида в способности разрушать межклеточные связи фибробластов в культуре (цитопатический эффект) по сравнению с различными штаммами C. albicans, С. krusei и C. glabrata.

Для исследования динамики и механизмов гибели клеток в монослое после воздействия фунгальных метаболитов использовали окрашивание культуры с помощью технологии Apoptosis/Necrosis Detection Kit (рис., Б, В, III обложка). Было обнаружено, что через 3 часа после обработки слоя дермальных клеток фунгальными метаболитами наблюдалась гибель фибробластов, которая происходила в равной мере как путем апоптоза, так и некроза. При этом продукты секреции разных представителей кандид отличались по способности индуцировать гибель клеток в монослое: наибольший биоцидный эффект в культуре фибробластов проявляли метаболиты штаммов C. krusei, C. glabrata и C. albicans, в меньшей степени — C. auris (рис., Б, В).

Наши эксперименты выявили высокую биологическую активность продуктов секреции исследуемых видов кандид. Метаболиты ряда штаммов C. krusei, C. glabrata, C. albicans и C. auris были способны вызывать гибель фибробластов (биоцидный эффект). Кроме того, метаболиты C. auris и в меньшей степени — C. albicans могли разрушать межклеточные связи в монослое дермальных клеток. Исследование вариантов гибели фибробластов показало, что продукты метаболизма кандид не только способны вызывать деструкцию клеток, ведущую к некрозу, но и обладают более сложным контакт-зависимым механизмом, способным запускать апоптоз. Примечательно, что биоцидная активность была наиболее выражена у метаболитов C. glabrata и C. krusei, а не у наиболее патогенного вида кандид — C. albicans. По-видимому, это связано с тем, что C. albicans, кроме деструктивных ферментов, широко использует дополнительные стратегии и факторы патогенности, позволяющие данному виду до сих пор удерживать лидирующие позиции в списке основных возбудителей оппортунистических микозов [10, 13, 15].

Обнаружение у метаболитов C. auris сильно выраженной способности к расщеплению межклеточных контактов в монослое фибробластов указывало на более развитые инвазивные способности данного вида по сравнению с другими кандидами [1]. При анализе данных по биоцидной активности метаболитов C. auris было установлено, что большинство исследуемых штаммов не оказывали прямого повреждающего (биоцидного) действия на клетки человека. Это согласуется с исследованием J.L. Brown и соавт. [8], где было показано, что C. auris не вызывают воспаление в неповрежденной коже, хотя и способны индуцировать воспалительные реакции при раневых инфекциях и в кровотоке, что подчеркивает опасность этих микроорганизмов в условиях интенсивной терапии.

Заключение

Таким образом, эксперименты показали, что метаболиты кандид могут непосредственно вызывать гибель фибробластов кожи человека, при этом биоцидная активность является штамм-зависимым признаком. Прямая биоцидность в отношении дермальных клеток была наиболее характерна для штаммов C. glabrata и C. krusei, менее выражена у C. albicans и очень слабо — у штаммов C. auris. Длительное воздействие метаболитов кандид на клетки человека приводило к гибели фибробластов как через активацию апоптоза, так и путем некроза. Метаболиты некоторых кандид могли расщеплять монослой фибробластов на фрагменты, при этом не была отмечена корреляция между способностью штамма индуцировать гибель отдельных клеток и способностью к разрушению межклеточных связей в культуре. Наибольший деструктивный эффект в отношении монослоя дермальных клеток показали штаммы C. auris. Возможно, именно это качество C. auris, позволяющее данному виду эффективнее прочих кандид разрушать плотную структуру тканей в организме человека, может служить объяснением их высокой инвазивности.

×

About the authors

Nadezhda I. Ignatova

Privolzhsky Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: n.i.evteeva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4570-9342

PhD (Biology), Associate Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine

Russian Federation, 603005, Nizhny Novgorod, Gagarina pr., 70

M. I. Zaslavskaya

Privolzhsky Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: maya.zaslav@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1895-0699

PhD, MD (Biology), Associate Professor, Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine

Russian Federation, 603005, Nizhny Novgorod, Gagarina pr., 70

N. A. Alexandrova

Privolzhsky Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: natalyuskova@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-4845-8056

PhD (Biology), Senior Lecturer, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine

Russian Federation, 603005, Nizhny Novgorod, Gagarina pr., 70

O. E. Orlova

City Clinical Hospital No. 67 named after L.A. Vorokhobov

Email: o.e.orlova@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Microbiology

Russian Federation, Moscow

V. G. Melnikov

Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.N. Gabrichevsky of Rospotrebnadzor

Author for correspondence.
Email: goutch@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Leading Researcher

Russian Federation, Moscow

References

  1. Brown J.L., Delaney C., Short B., Butcher M.C., McKloud E., Williams C., Kean R., Ramage G. Candida auris phenotypic heterogeneity determines pathogenicity in vitro. mSphere, 2020, vol. 5, no. 3: E00371-20. doi: 10.1128/mSphere.00371-20
  2. Calderone R.A., Fonzi W.A. Virulence factors of Candida albicans. Trends Microbiol., 2001, vol. 9, no. 7, pp. 327–335. doi: 10.1016/s0966-842x(01)02094-7
  3. Du H., Bing J., Hu T., Ennis C.L., Nobile C.J., Huang G. Candida auris: Epidemiology, biology, antifungal resistance, and virulence. PLoS Pathog., 2020, vol. 16, no. 10: e1008921. doi: 10.1371/journal.ppat.1008921
  4. Eliakim-Raz N., Babaoff R., Yahav D., Yanai S., Shaked H., Bishara J. Epidemiology, microbiology, clinical characteristics, and outcomes of candidemia in internal medicine wards — a retrospective study. Int. J. Infect. Dis., 2016, vol. 52, pp. 49–54. doi: 10.1016/j.ijid.2016.09.018
  5. Galocha M., Pais P., Cavalheiro M., Pereira D., Viana R., Teixeira M.C. Divergent approaches to virulence in C. albicans and C. glabrata: two sides of the same coin. Int. J. Mol. Sci., 2019, vol. 20, no. 9: 2345. doi: 10.3390/ijms20092345
  6. Gómez-Gaviria M., Mora-Montes H.M. Current aspects in the biology, pathogeny, and treatment of Candida krusei, a neglected fungal pathogen. Infect. Drug Resist., 2020, vol. 13, pp. 1673–1689. doi: 10.2147/IDR.S247944
  7. Larkin E., Hager C., Chandra J., Mukherjee P.K., Retuerto M., Salem I., Long L., Isham N., Kovanda L., Borroto-Esoda K., Wring S., Angulo D., Ghannoum M. The emerging pathogen Candida auris: growth phenotype, virulence factors, activity of antifungals, and effect of SCY-078, a novel glucan synthesis inhibitor, on growth morphology and biofilm formation. Antimicrob. Agents Chemother., 2017, vol. 61: 02396-16. doi: 10.1128/ AAC.02396-16
  8. Lockhart S.R., Etienne K.A., Vallabhaneni S., Farooqi J., Chowdhary A., Govender N.P., Colombo A.L., Calvo B., Cuomo C.A., Desjardins C.A., Berkow E.L., Castanheira M., Magobo R.E., Jabeen K., Asghar R.J., Meis J.F., Jackson B., Chiller T., Litvintseva A.P. Simultaneous emergence of multidrug-resistant Candida auris on 3 continents confirmed by whole-genome sequencing and epidemiological analyses. Clin. Infect. Dis., 2017, vol. 64, no. 2, pp. 134–140. doi: 10.1093/cid/ciw691
  9. Nett J.E. Candid auris: аn emergingpathogen “incognito”? PLoS Pathog., 2019, vol. 15, no. 4: e1007638. doi: 10.1371/journal.ppat.1007638
  10. Pereira R., dos Santos Fontenelle R.O., de Brito EHS, de Morais S.M. Biofilm of Candida albicans: formation, regulation and resistance. J. Appl. Microbiol., 2021, vol. 131, no. 1, pp. 11–22. doi: 10.1111/jam.14949
  11. Rossato L., Colombo A.L. Candida auris: what have we learned about its mechanisms of pathogenicity? Front. Microbiol., 2018, vol. 9: 3081. doi: 10.3389/fmicb.2018.03081
  12. Schelenz S., Hagen F., Rhodes J.L., Abdolrasouli A., Chowdhary A., Hall A., Ryan L., Shackleton J., Trimlett R., Meis J.F., Armstrong-James D., Fisher M.C. First hospital outbreak of the globally emerging Candida auris in a European hospital. Antimicrob. Resist. Infect. Control., 2016, vol. 5: 35. doi: 10.1186/s13756-016-0132-5
  13. Staniszewska M. Virulence factors in Candida species. Curr. Protein Pept. Sci., 2020, vol. 21, no. 3, pp. 313–323. doi: 10.2174/1389203720666190722152415
  14. Staniszewska M., Bondaryk M., Zbigniew O. Contribution of aspartic proteases in Candida virulence. Protease inhibitors against Candida infections. Curr. Protein Pept. Sci., 2017, vol. 18, no. 10, pp. 1050–1062. doi: 10.2174/1389203717666160809155749
  15. Talapko J., Juzbašić M., Matijević T., Pustijanac E., Bekić S., Kotris I., Škrlec I. Candida albicans — the virulence factors and clinical manifestations of infection. J. Fungi (Basel)., vol. 7, no. 2: 79. doi: 10.3390/jof7020079

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) 2022 Ignatova N.I., Zaslavskaya M.I., Alexandrova N.A., Orlova O.E., Melnikov V.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies