Modeling respiratory viral infections actual in the first quarter of the XXI century: from primary epithelial cultures to organoids

Full Text

Введение

Вся новейшая история¹ человечества прошла под знаком интенсивной урбанизации, заметно ускорившейся в начале XXI века. Резкое повышение плотности населения, длительное нахождение в замкнутых помещениях и транспортных средствах, единые системы вентиляции воздуха и формирование в мегаполисах неблагоприятных мезоклиматических условий объективно способствуют распространению острых респираторных вирусных инфекции (ОРВИ), причиной возникновения которых могут быть более 200 известных в настоящее время возбудителей, обладающих выраженным тропизмом к эпителиальным клеткам слизистой оболочки респираторного тракта² (РТ) [27, 47, 54, 102]. Возбудители ОРВИ являются серьезной проблемой для здравоохранения, вызывая высокую заболеваемость и смертность, что приводит к значительным социально-экономическим потерям. В Российской Федерации ОРВИ ежегодно регистрируют более, чем у 30 млн человек [12 23].

В XXI веке человечество уже столкнулось с двумя масштабными пандемиями, вызванными вирусами гриппа A (IAV — Influenza A virus) (Articulavirales: Orthomyxoviridae, Alphainfluenzavirus) субтипа H1N1pdm09 [17, 52] и тяжелого острого респираторного синдрома 2-го типа (SARS-CoV-2 — Severe acute-respiratory coronavirus 2) (Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus) [26, 38]. Пандемия COVID-19, этиологически связанного с SARS-CoV-2, стала самой продолжительной документированной пандемией ОРВИ в истории человечества (1150 сут.: 11.03.2020–05.05.2023). Сохранять высокую степень настороженности следует по отношению и к другим бетакоронавирусам человека, имеющим высокий эпидемический потенциал: коронавирусам тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2 — Severe acute-respiratory coronavirus) (Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Sarbecovirus) [48] и Ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV — Middle East respiratory syndrome coronavirus) (Nidovirales: Coronaviridae, Betacoronavirus, подрод Merbecovirus) [39, 40]. Помимо IAV и SARS-CoV-2, превратившихся в постпандемический период в сезонные элементы подъема заболеваемости, наиболее распространенными возбудителями ОРВИ у человека являются вирус гриппа В (IBV — Influenza B virus) (Articulavirales: Orthomyxoviridae, Betainfluenzavirus), вирусы парагриппа 1-го и 3-го типов (HPIV-1, HPIV-3 — Human parainfluenza virus 1, 3) (Mononegavirales: Paramyxoviridae, Respirovirus), вирусы парагриппа 2-го и 4-го типов (HPIV-2, HPIV-4 — Human parainfluenza virus 2, 4) (Mononegavirales: Paramyxoviridae, Orthorubulavirus), метапневмовирус человека (HMPV — Human metapneumovirus) (Mononegavirales: Pneumoviridae, Metapneumovirus), респираторно-синцитиальный вирус человека (HRSV — Human respiratory syncytial virus) (Mononegavirales: Pneumoviridae, Orthopneumovirus), аденовирусы (HAdV — Human adenoviruses) (Rowavirales: Adenoviridae, Mastadenovirus), бокавирусы человека 1–4-го типов (HBoV 1, 2, 3, 4 — Human bocavirus 1, 2, 3, 4) (Piccovirales: Parvoviridae, Bocaparvovirus), риновирусы человека (HRV-A, B, C — Human rhinovirus A, B, C) (Picornavirales: Picornaviridae, Enterovirus) [10, 12, 23, 27, 47, 55].

Задачи обеспечения эпидемического благополучия диктуют необходимость изучения иммунопатогенеза респираторных вирусных инфекций, разработки эффективных вакцин и противовирусных препаратов (в первую очередь — этиотропных), а также научно-обоснованных подходов к совершенствованию мониторинга возбудителей ОРВИ. Одним из наиболее перспективных направлений исследований в этой области является создание и использование экспериментальных моделей, воспроизводящих ключевые аспекты физиологии РТ ex vivo.

Цель обзора — проанализировать современные методы моделирования респираторных вирусных инфекций ex vivo.

Возбудители острых респираторных вирусных инфекций, наиболее актуальные для человечества в первой четверти XXI века

Вирусы гриппа или ортомиксовирусы (Articulavirales: Orthomyxoviridae) человека принадлежат к трем видам: IAV, IBV и вирус гриппа С (IСV — Influenza C virus) (Gammainfluenzavirus) (табл. 1), являясь причиной свыше 80% всех ОРВИ в мире [12, 23], за исключением периода пандемии COVID-19 (2020–2023 гг.) [25, 59]. Уже в эпидсезоне 2023–2024 гг. удельный вес гриппа IAV/Н3N2 от общего числа положительных случаев ОРВИ в Евразии составил 93,7%, IBV — 5,7% случаев [58].

 

Таблица 1. Результаты изучения биологических свойств возбудителей ОРВИ на моделях первичных эпителиальных клеток и органоидов РТ

Table 1. Results of the study of biological properties of ARVI pathogens on models of primary epithelial cells and RT organoids

Таксономическое положение Taxonomy status				Название вируса Name of the virus		Взаимодействие с клетками Interaction with cells		Ведущий клинический симптом Key clinical symptom	Первичные клеточные культуры и органоиды Primary cell cultures and organoids
класс class	отряд order	семейство family	род genus	специальное special	бинарное binary	клетки-мишени target cells	клеточный рецептор cell receptor		клеточная модель ex vivo cell culture ex vivo	иммунный ответ на инфекцию immune response to infection
Insthoviricetes	Articulavirales	Orthomyxoviridae	Alphainfluenzavirus	вирус гриппа A influenza A virus (IAV)	A. influenzae	цилиарные эпителиальные, базальные, бокаловидные, альвеолярные ciliary epithelial, basal, goblet, alveolar	сиалозиды (α2'-6' — в верхних, α2'-3' — в нижних отделах респираторного тракта) sialosides (α2'-6' — in the upper, α2'-3' — in the lower respiratory tract)	ринит, фарингит, ларингит, бронхит, ринофарингит, трахеит, интоксикация, осложнения в форме крупа и пневмонии rhinitis, pharyngitis, laryngitis, bronchitis, rhinopharyngitis, tracheitis, intoxication, complications in the form of croup and pneumonia	дифПЭКК* [70, 103, 108, 121, 125], органоиды [69, 90, 92, 115] difPECC* [70, 103, 108, 121, 125], organoids [69, 90, 92, 115]	IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-1, IFN-3, СCL2, СCL5
			Betainfluenzavirus	вирус гриппа B influenza B virus (IBV)	B. influenzae
			Gammainfluenzavirus	вирус гриппа C influenza C virus (ICV)	G. influenzae
Monjiviricetes	Mononegavirales	Paramyxoviridae	Orthorubulavirus	вирусы парагриппа человека 2-го и 4-го типов human parainfluenza viruses 2 and 4 (HPIV2, 4)	O. laryngotracheitidis (HPIV2) O. hominis (HPIV4)	цилиарные эпителиальные ciliary epithelial	сиалозиды (главным образом, α2'-3') sialosides (mainly α2'3')	ларингит, ринофарингит, ложный круп, отек слизистой оболочки гортани laryngitis, rhinopharyngitis, false croup, swelling of the mucous membrane of the larynx	дифПЭКК [130, 156], органоиды [93, 94, 114] difPECC [130, 156], organoids [93, 94, 114]	СХCL10, СХCL11
			Respirovirus	вирусы парагриппа человека 1-го и 3-го типов human parainfluenza viruses 1 and 3 (HPIV1, 3)	R. laryngotracheitidis (HPIV1) R. pneumoniae (HPIV3)
		Pneumoviridae	Metapneumovirus	метапневмовирус человека human metapneumovirus (HMPV)	M. hominis	цилиарные эпителиальные, альвеолоциты II типа, базальные ciliary epithelial, alveolocytes II, basal	RGD-связывающие интегрины RGD-binding integrins	бронхиолит, осложнения в форме пневмонии bronchiolitis, complications in the form of pneumonia	дифПЭКК [84, 118], органоиды [126] difPECC [84, 118], organoids [126]	IFN-3, IL-6, IL-8, TNFα, СXCL1, СXCL8, RANTES
			Orthopneumovirus	респираторно-синцитиальный вирус человека human respiratory syncytial virus (HRSV)	O. hominis	эпителиальные на всем протяжении респираторного тракта epithelial cells throughout the respiratory tract	CX3CR1	фарингит, тонзиллит, бронхит, бронхиолит, осложнения в форме пневмонии pharyngitis, tonsillitis, bronchitis, bronchiolitis, complications in the form of pneumonia	дифПЭКК [67, 118, 122, 126, 158], органоиды [84, 93, 94, 123] difPECC [67, 118, 122, 126, 158], organoids [84, 93, 94, 123]
Pisoniviricetes	Nidovirales	Coronaviridae	Alphacoronavirus	коронавирус человека 229E human coronavirus 229E (HCoV229E)	A. chicagoense	цилиарные и нецилиарные эпителиальные клетки, альвеолоциты II типа, кубовидные ciliary and non-ciliary epithelial, alveolocytes II, cuboid	N-аминопептидаза (CD13) Aminopeptidase N (CD13)	ринит, ларингит, осложнения в форме пневмонии rhinitis, laryngitis, complications in the form of pneumonia	органоиды [88] organoids [88]	_
				коронавирус человека NL63 human coronavirus NL63 (HCoVNL63)	A. amsterdamense		ангиотензин-превращающий фермент 2-го типа (ACE2) angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)	ринит, ларингит, осложнения в форме пневмонии rhinitis, laryngitis, complications in the form of pneumonia	_	_
			Betacoronavirus	бетакоронавирус 1-го типа, или коронавирус человека OC43 betacoronavirus 1, or human coronavirus OC43	B. gravedinis		N-ацетил-9-O-ацетилнейраминовая кислота, CEACAM1 (CD66a) N-acetyl-9-O-acetylneuramic acid, CEACAM1 (CD66a)	ринит, ларингит, осложнения в форме пневмонии rhinitis, laryngitis, complications in the form of pneumonia	органоиды [68] organoids [68]	_
				коронавирус Ближневосточного респираторного синдрома Middle East respiratory syndrome coronavirus	B. cameli		дипептидилпептидаза 4-го типа (CD26) dipeptidyl peptidase 4 (CD26)	ринит, ларингит, осложнения в форме пневмонии rhinitis, laryngitis, complications in the form of pneumonia	_	_
				коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома severe acute respiratory syndrome coronavirus	B. pandemicum		ангиотензин-превращающий фермент 2-го типа (ACE2), CD147 angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), CD147	ринофарингит, бронхит, бронхиолит, «атипичная» пневмония rhinopharyngitis, bronchitis, bronchiolitis, pneumonia	дифПЭКК [135], органоиды [98] difPECC [135], organoids [98]	IFN-1, IFN-3, IL-1β, IL-6, IL-17, IL-18, IL-33, MIP1β, СCL20, СXCL2, СXCL3, СXCL5, СXCL6, СXCL8, СXCL10, СXCL11, СXCL20
				коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2-го типа severe acute respiratory syndrome coronavirus 2				ринофарингит, бронхит, бронхиолит, «атипичная» пневмония, респираторный дистресс-синдром rhinopharyngitis, bronchitis, bronchiolitis, pneumonia, respiratory distress syndrome	дифПЭКК [60, 80, 85, 107, 148], органоиды [72, 75, 89, 157] difPECC [60, 80, 85, 107, 148], organoids [72, 75, 89, 157]
Pisoniviricetes	Picornavirales	Picornaviridae	Enterovirus	риновирусы человека AC human rhinovirus AC (HRV AC)	E. alphacoxsackie (HRV A, B) E. alpharhino (HRV A) E. betacoxsackie (HRV A, B) E. betarhino (HRV B) E. cerhino (HRV C) E. coxsackiepol (HRV C) E. deconjuncti (HRV A, B)	плоские и цилиарные эпителиальные flat and ciliary epithelial	ICAM-1, CXC3R1, NCL, LDLR	ринит, фарингит rhinitis, pharyngitis	дифПЭКК [86, 113, 137], органоиды [65, 73, 117] difPECC [86, 113, 137], organoids [65, 73, 117]	TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17, IFN-1, IFN-3
Quintoviricetes	Piccovirales	Parvoviridae	Bocaparvovirus	бокавирусы человека 14-го типов human bocavirus 14 (HBoV-14)	B. primate1 (HboV-1, 2) B. primate2 (HboV-3) B. primate3 (HboV-4)	макрофаги и В-клетки (в первую очередь — небных миндалин) macrophages and B cells (first of all — in the tonsils)	FcγRII	ларингит, фарингит, тонзиллит (часто хронизирующийся), осложнения в форме пневмонии laryngitis, pharyngitis, tonsillitis (often chronic), complications in the form of pneumonia	дифПЭКК [78, 101], органоиды [73, 149] difPECC [78, 101], оrganoids [73 149]	IL-1β, TNFα, CCL24, RANTES
Tectiliviricetes	Rowavirales	Adenoviridae	Mastadenovirus	аденовирусы человека AG human adenoviruses AG (HAdV AG)	M. adami (HAdV A) M. blackbeardi (HAdV B) M. caesari (HAdV C) M. dominans (HAdV D) M. exoticum (HAdV E) M. faecale (HAdV F) M. russelli (HAdV G)	эпителиальные на всем протяжении респираторного тракта, легочной паренхимы epithelial cells throughout the respiratory tract, pulmonary parenchyma	десмоглеин 2-го типа desmoglein 2	фарингит, тонзиллит, бронхит, бронхиолит, осложнения в форме пневмонии pharyngitis, tonsillitis, bronchitis, bronchiolitis, complications in the form of pneumonia	дифПЭКК [151], органоиды [93, 94] difPECC [151], organoids [93, 94]	IL-1RA, IL-8, IL-21, GM-CSF, GROα, SDF1α

Примечание. * дифПЭКК — культура дифференцированных первичных эпителиальных клеток. « — » — данных не обнаружено.

Note. * difPECC — differentiated primary epithelial cell culture. « — » — no data found.

 

IAV был впервые изолирован от свиней (Sus scrofa) известным американским вирусологом R. Shope в 1931 г. [134]. В последующих публикациях этого автора была сформулирована теория природной очаговости IAV в системе «вирус — легочные нематоды Metastrongylus spp. — дождевые черви Lumbricus spp.» (описание в современных терминах см. в [18, 45, 56]). IAV у людей был впервые выявлен в 1933 г. группой английских исследователей: C.H. Andrewes, P.P. Laidlaw, W. Smith [62]. Вирионы ортомиксовирусов имеют округлую (80–120 нм) или бациллярную (100–120 × 200–250 нм) форму; геном включает 8 сегментов однонитевой РНК отрицательной полярности [27, 45, 47, 57]. С точки зрения разработки этиотропных противовирусных [11, 29] и вакцинных [6, 23] препаратов первостепенное значение имеют поверхностные белки IAV: гемагглютинин (HA — hemagglutinin), который содержит рецептор-связывающий сайт (РСС), взаимодействующий с сиалозидами (полисахаридами, терминированными остатком сиаловой кислоты) на поверхности клеток-мишеней; нейраминидаза (NA — neuraminidase) — фермент, катализирующий отщепление терминального остатка сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты); M2, тетрамеры которого формируют ионные каналы, играющие важную роль при выходе вирусного нуклеокапсида из цитоплазматической эндосомы на этапе проникновения в клетку-мишень [53, 57]. На сегодняшний день известно 18 подтипов НА (H1, H2, …, H18) и 11 подтипов NA (N1, N2, …, N11), комбинации которых определяют субтип IAV [27, 50, 147]. Например, пандемия «испанского гриппа» (1918–1919 гг.) была вызвана IAV/H1N1, «азиатского гриппа» (1957–1959 гг.) — IAV/H2N2, «гонконгского гриппа» (1968–1970 гг.) — IAV/H3N2, «свиного гриппа» (2009–2010 гг.) — IAV/H1N1 [12, 23, 27, 47]. Эпидемически актуальными субтипами продолжают оставаться IAV/H3N2 и H1N1 (при этом IAV/H1N1pdm09 продолжает циркулировать в качестве рутинного компонента сезонного подъема заболеваемости) [4]. В популяциях летучих мышей Центральной Америки с помощью NGS-секвенирования обнаружены субтипы H17N10 и H18N11, однако соответствующие штаммы до сих пор не изолированы, что связано с уникальной структурой их РСС [51, 140, 151].

В настоящее время достоверно установлено, что IAV имеет широкий спектр хозяев среди позвоночных (Vertebrata) [9, 18, 27]. Его природным резервуаром являются дикие птицы водно-околоводного экологического комплекса, в первую очередь гусеобразные (Anseriformes) и ржанкообразные (Charadriiformes), среди которых, в подавляющем большинстве случаев, циркулируют слабовирулентные варианты (LPAI — low pathogenic avian influenza) [22, 27, 47]. При возникновении мутаций и обогащении сайта протеолитического разрезания гемагглютинина положительно заряженными аминокислотами, IAV приобретает высоковирулентный фенотип (HPAI — highly pathogenic avian influenza) [18, 21, 27, 42]. РСС вариантов IAV, адаптированных к птицам, имеет выраженную аффинность по отношению к α2'-3'-сиалозидам, в то время как эпидемические штаммы имеют специфичность к α2'-6'-сиалозидам, содержащимся на поверхности эпителиоцитов верхних отделов РТ человека. Ситуация осложняется тем, что нижние отделы РТ человека содержат α2'-3'-сиалозиды, поэтому возрастание α2'-3'-аффинности у клинических изолятов повышает вероятность развития смертельно опасных первичных вирусных пневмоний [13, 19].

IBV был открыт в 1940 г. T. Francis Jr.: изолированный им штамм IBV/Lee/1940 [82] до сих по является прототипным [18, 45]. Среди штаммов этого вируса, изолируемых в первой четверти XXI века, различают две группы: «Викторианскую» (IBV/Victoria/2/1987-подобные) и «Ямагатскую» (IBV/Yamagata/16/1988-подобные) [8, 12, 23, 27, 47]. IBV считается антропонозным, однако он был выделен от обыкновенных тюленей (Phoca vitulina) и оказался филогенетически чрезвычайно близок к человеческим штаммам, циркулировавшим в начале 1990-х гг. [119].

Первый штамм ICV был изолирован в 1947 г. американским вирусологом R.M. Taylor [138]. Этот вирус — в отличие от IAV и IBV — содержит единый (не разделяемый посттрансляционно на две субъединицы) поверхностный трансмембранный гемагглютинин-эстеразный фузионный белок (HEF — hemagglutinin-esterase fusion), который содержит РСС и удаляет один из остатков уксусной кислоты в молекуле диацетил-нейраминовой кислоты [57]. ICV может вызывать локальные вспышки в детских коллективах. Наиболее тяжело ОРВИ, связанная с этим вирусом, протекает у новорожденных [12, 23, 27, 47].

По-видимому, ICV является зооантропонозным вирусом, поскольку изолируется из трахеальных смывов домашних свиней (S. scrofa) без клинических проявлений заболевания (прототипный штамм ICV/pig/Beijing/32/1981), причем штаммы свиного происхождения близки, но не идентичны эпидемическим [87].

Коронавирусы (Nidovirales: Coronaviridae), известные с 1931 г., когда американские вирусологи A.F. Schalk и M.C. Hawn описали вирус инфекционного бронхита (IBV — Infectious bronchitis virus) кур (Gammacoronavirus, Igacovirus)[3] [131], долгое время считались серьезной ветеринарной проблемой [54], но их эпидемический потенциал оставался недооцененным вплоть до начала XXI века, когда эпидемия SARS-CoV остановилась буквально в шаге от перерастания в пандемию [23, 48]. В настоящее время, известны 7 коронавирусов человека (табл. 1): 229E (HCoV-229E — human coronavirus 229E) (Alphacoronavirus, Duvinacovirus) был впервые описан D. Hamre и J.J. Procknow (1966); OC43 (HCoV-OC43 — human coronavirus OC43) (Betacoronavirus, Embecovirus) — K. McIntosh и соавт. (1967); коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV — severe acute respiratory syndrome coronavirus) (Betacoronavirus, Sarbecovirus) — Peiris J.S.M. и соавт. (2003); NL63 (HCoV-NL63 — human coronavirus NL63) (Alphacoronavirus, Setracovirus) — R.A. Fouchier и соавт. (2004); HKU1 (HCoV-HKU1 — human coronavirus HKU1) (Betacoronavirus, Embecovirus) — P.C. Woo, и соавт. (2005); коронавирус Ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV — Middle East respiratory syndrome coronavirus) (Betacoronavirus, Merbecovirus) — A.M. Zaki и соавт. (2012); коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2-го типа (SARS-CoV-2 — severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) (Betacoronavirus, Sarbecovirus) — F. Wu и соавт. (2020) [1]. SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS-CoV относятся к числу особо опасных [12]. Согласно релизу Международного Комитета по таксономии вирусов (www.ictv.global) 2024 г. SARS-CoV и SARS-CoV-2 предложено рассматривать как варианты одного и того же вируса.

Оболочечные вирусные частицы коронавирусов имеют округлую (120–160 нм) плеоморфную форму. Булавовидные поверхностные пепломеры, напоминающие зубцы короны (откуда происходит и название семейства) длиной 10–25 нм, представляют собой тримеры спайкового гликопротеина S, первая субъединица которого содержит РСС. Поверхностный гликопротеин гемагглютинин-эстераза (HE) имеется лишь у некоторых бетакоронавирусов (из поражающих человека — у HCoV-HKU1). Белок М является трансмембранным с трехзаходной NexoCendo-топологией. Пентамеры белка Е способны формировать ионные каналы и представляют собой важный фактор вирулентности коронавирусов. Нуклеокапсид (60–70 нм) спиральной симметрии формируется фосфорилированным белком N в комплексе с односегментной одноцепочечной РНК⁴ позитивной полярности, которая m7G-кэпирован на 5'- и полиаденилирован на 3'-конце [24, 46, 54].

Вирусы парагриппа (Human parainfluenza virus) относятся к семейству парамиксовирусов (Mononegavirales: Paramyxoviridae) человека и представлены четырьмя известными видами: HPIV-1, HPIV-3 (Respirovirus) и HPIV-2, HPIV-4 (Orthorubulavirus); последний дополнительно подразделяется на два субтипа — 4a и 4b (табл. 1) [3, 5, 6]. Среди HPIV чаще всего встречается 3-й тип. Считается, что HPIV-инфекция (особенно у взрослых) имеет легкое течение, однако следует обратить внимание на то, что эти вирусы могут являться причиной порядка 8% случаев внебольничных пневмоний [120]. Дети в возрасте 2–5 лет наиболее восприимчивы к инфекции HPIV, который является у них причиной около 75% случаев ложного крупа и до 40% госпитализаций с поражениями нижних отделов РТ [9].

Полноценная серологическая идентификация HPIV была осуществлена в 1958–1961 гг. группой американских вирусологов под руководством R.M. Chanock с использованием клинических изолятов, полученных в начале 1950-х гг., главным образом, от детей с симптомами ОРВИ: с помощью реакции связывания комплемента было показано, что гемадсорбирующиеся (HA — hemadsorption) — как их тогда называли — вирусы различных типов близки друг к другу и к вирусу Сендай⁵, но отличны от IAV, IBV, ICV [53, 54]. В 1959 г. советский вирусолог В.М. Жданов ввел в научный обиход термин «вирусы парагриппа» [9, 27].

Оболочечный вирион парамиксовирусов имеет плейоморфную округлую (130–150 нм), реже нитевидную (140–160 × 300–350 нм) форму и содержит 2 поверхностных трансмембранных гликопротеина, образующих шипообразные пепломеры (8–12 нм) — тетрамеры гемагглютинин-нейраминидазы (HN — hemagglutinin-neuraminidase), которые содержат РСС (специфичный к остаткам сиаловой кислоты), и тримеры белка фузии (F — fusion) для оболочки вириона и клеточной мембраны. Нуклеокапсид спиральной симметрии формируется фосфорилированным нуклеопротеином (NP — nucleoprotein), образующим нековалентный комплекс с односегментной одноцепочечной РНК негативной полярности [12, 23, 27].

Пневмовирусы (Mononegavirales: Pneumoviridae) человека включают два вида: респираторно-синцитиальный⁶ вирус человека (HRSV — Human respiratory syncytial virus) (Orthopneumovirus), впервые идентифицированный в 1957 г. американскими вирусологами R. Chanock, B. Roizman, R. Myers [71], и метапневмовирус человека (HMPV — Human metapneumovirus) (Metapneumovirus) (табл. 1), описанный в 2001 г. нидерландскими учеными B.G. Van den Hoogen с соавт. [145]. К HMPV-инфекции особенно восприимчивы дети: антитела против этого вируса к трем годам появляются примерно у 60%, а к пяти — практически у всех жителей крупных населенных пунктов. HMPV является причиной госпитализации 10–20% детей с ОРВИ. У лиц со сниженным иммунитетом описаны случаи реинфекции. HRSV вызывает ОРВИ, в основном, у детей до 5 лет, но в семейных очагах болеют порядка 30% взрослых. HMPV наиболее опасен для детей до 1 года и для взрослых старше 70 лет с хронической патологией сердечно-сосудистой системы [12, 23, 64]. Предшественником HMPV является метапневмовирус птиц (AMPV — avian metapneumovirus) (Metapneumovirus) [27]. По-видимому, AMPV и HMPV следует в будущем объединить в единый вид, рассматривая их как варианты с различным эпидемическим потенциалом (аналогично LPAI/HPAI и эпидемическим штаммам IAV).

Оболочечные вирионы пневмовирусов имеют округлую плейоморфную (180–210 нм) или вытянутую (200–210 × 300–350 нм) форму и содержат три поверхностных трансмембранных белка: гликопротеин (G — glycoprotein), включающий РСС (специфичный к хемокиновому рецептору CX3CR1 в случае HRSV или к RGD-связывающим интегринам в случае HMPV), белок фузии (F — fusion) и малый гидрофобный белок (SH — small hydrophobic), являющийся виропорином, способным формировать ионные каналы. Геном представлен однонитевой односегментной РНК негативной полярности, которая в составе нуклеокапсида спиральной симметрии связана с NP и фосфопротеином (P — phosphoprotein) [9, 27].

Аденовирусы (Rowavirales: Adenoviridae) человека (HAdV — Human adenoviruses) входят в состав рода Mastadenovirus и в настоящее время представлены 7 видами: HAdV-A, HAdV-B, …, HAdV-G (табл. 1) [99, 100] (схема редукции ранее использованных 88 серотипов [27] в современную видовую систему HAdV представлена в табл. 2). Наибольшее эпидемиологическое значение имеют HAdV-B (серотипы 14, 21), HAdV-C, HAdV-Е (4), HAdV-G (7), которые вызывают вспышки ОРВИ; HAdV-B (3, 14), HAdV-Е (4), HAdV-G (7) — конъюнктивиты; HAdV-D — кератоконъюнктивиты; HAdV-D (37) — венерические заболевания; HAdV-F, HAdV-G — гастроэнтериты; HAdV-B (34, 35), HAdV-B (7, 11, 21, 35) — персистирующие инфекции почек и геморрагические циститы [27, 129].

 

Таблица 2. Соответствия между прежней (цифровой) системой обозначения серотипов и современными названиями аденовирусов человека [27, 99, 100]

Table 2. Correspondences between the previous (numeric) serotype designation system and modern names of human adenoviruses [27, 99, 100]

Современные названия Modern names	Прежние (цифровые) обозначения Previous (numeric) designations
HAdV-A	HAdV-12, 18, 31
HAdV-B	HAdV-3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55
HAdV-C	HAdV-1, 2, 5, 6, 57
HAdV-D	HAdV-8–10, 13, 15, 17, 19, 20, 22–30, 32, 33, 36–39, 42–49, 51, 53, 54, 56, 58–60, 62–65, 67, 69, 70–75
HAdV-E	HAdV-4
HAdV-F	HAdV-40, 41
HAdV-G	HAdV-52

 

HAdV были впервые изолированы в 1953 г. в США W.P. Rowe с соавт. с использованием первичных клеточных культур миндалин и аденоидов часто болеющих детей [128]. Год спустя в публикации этого же научного коллектива (R.J. Huebner с соавт.) впервые появился термин «аденовирус» [97]. Безоболочечный вирион аденовирусов имеет икосаэдрическую симметрию (70–90 нм) и состоит из 252 капсомеров, из которых 240 гексонов образуют 20 триангулярных граней, а 12 пентонов располагаются в вершинах икосаэдра и снабжены фибриллами различной длины в зависимости от вида (8–80 нм) (HAdV-F имеет фибриллы двух различных размеров). Каждый гексон соседствует с шестью себе подобными субъединицами и состоит из трех одинаковых молекул белка II. Пентон, или В-антиген, обладает эндонуклеазной активностью и состоит из пяти молекул белка III. Пентон окружен комплексом из пяти перипентонных гексонов, которые нарушают строгую икосаэдрическую симметрию капсида — для стабилизации белковых взаимодействий при каждой вершине граней имеется по 2 мономера белка IIIa и «подкладка» из нескольких копий белка VI. С внутренней стороны капсид импрегнирован белком VIII, а белок IX ассоциирован с центральной частью триангулярной грани икосаэдра. Фибрилла состоит из тримера белка IV, который нековалентно связан с пентоном. Белок V взаимодействует с основанием пентонов, определяя правильную ориентацию нуклеосомоподобных структур, формируемых белками VII и X. Белок IV, принимающий участие в правильной укладке нуклеокапсида, также встречается в составе вириона. Геном аденовируса представлен линейной односегментной двухцепочечной ДНК, которая фланкирована инвертированными концевыми последовательностями, позволяющими одноцепочечным ДНК формировать кольца типа «сковородки с ручкой» за счет образования водородных связей между концами одной и той же цепи [27].

Бокавирусы (Piccovirales: Parvoviridae, Bocaparvovirus) человека представлены 4 видами: HBoV-1, 2, 3, 4 (табл. 1). Согласно результатам молекулярно-генетического анализа, видообразование от общего предка произошло в 1980-х гг., что указывает на быструю эволюцию бокавирусов в человеческой популяции [154]. Возможно, природным резервуаром HBoV являются бокавирусы диких высших приматов [133]. Основная группа риска — дети до 5 лет: в этот период жизни антитела против HBoV появляются у 90%, и этот вирус становится причиной порядка 5% ОРВИ, в том числе — с поражением нижних отделов РТ — хотя чаще всего завершается хроническим тонзиллитом; HBoV-2 и HBoV-4 могут вызывать инфекции желудочно-кишечного тракта [9, 12].

HBoV был впервые выделен группой шведских специалистов: T. Allander с соавт. в 2005 г. из назофарингеальных аспиратов (проб отделяемого слизистой с задней стенки носа и горла) у детей с ОРВИ [61]. HBoV поражают макрофаги и В-клетки аденотонзиллярных тканей, проникая в клетку-мишень посредством антителозависимого механизма с использованием клеточного γ-рецептора Fc-фрагментов антител (FcγRII) [149].

Вирионы бокавирусов представляют собой безоболочечные частицы (18–26 нм) икосаэдрической симметрии, составленные из 60 капсомеров, которые формируются белками VP1-VP6. Геном состоит из линейной одноцепочечной ДНК [27].

Риновирусы (Picornavirales: Picornaviridae, Enterovirus) человека представлены тремя видами: HRV-A, B, C (табл. 1). Первый HRV, получивший обозначение JH, был описан американским вирусологом W.H. Price в 1956 г. [124]. К началу XXI века было известно более сотни серотипов риновирусов человека, выделенных в отдельный род Rhinovirus, обладающих уникальными вируснейтрализующими и комплемент-связывающими антигенами, и потому рассматривавшихся в качестве самостоятельных видов. В процессе имплементации молекулярно-генетических методов эта таксономическая схема претерпела существенные изменения (табл. 3): Rhinovirus был упразднен, а риновирусы перемещены в современный род Enterovirus [27, 55, 105]. HRV распространены повсеместно, особенно в средних и высоких широтах с двухволновой эпидемической динамикой (пики заболеваемости ранней осенью и поздней весной); в тропических странах пик заболеваемости приходится на сезон дождей. ОРВИ, этиологически связанные с HRV, протекают легко, но в связи с присоединением бактериальной флоры могут осложняться бронхитами, синуситами, отитами, ринитами [9, 10, 12, 23].

 

Таблица 3. Соответствия между прежней (цифровой) системой обозначения серотипов и современными названиями риновирусов человека [27, 124, 105]

Table 3. Correspondences between the previous (numeric) system of serotype designation and modern names of human rhinoviruses [27, 124, 105].

Современные названия Modern names	Прежние (цифровые) обозначения Previous (numeric) designations
HRV-A	HRV-1, 2, 7, 8–13, 15, 16, 18–25, 28–34, 36, 38, 39, 40, 41, 43–47, 49, 50, 51, 53–68, 71, 73–78, 80–82, 85, 88–90, 94–96, 98, 100–103
HRV-B	HRV-3–6, 14, 17, 26, 27, 35, 37, 42, 48, 52, 69, 70, 72, 79, 83, 84, 86, 91–93, 97, 99
HRV-C	Впервые описана группой американских вирусологов: D. Lamson и соавт. (2006) [109] The first descriptions of a group of american scientists: D. Lawson et al. (2006) [109]

 

Вирионы HRV (22–30 нм), подобно всем представителям Picornaviridae, лишены липидной оболочки и имеют додекаэдрическую симметрию. Капсид сформирован белками VP1, VP2, VP3 и VP4. Геном состоит из односегментной одноцепочечной РНК позитивной полярности, 5'-конец которой фланкирован ковалентно-связанным с ним вирус-специфическим белком (VPg — viral protein genome-linked) [9, 27].

Морфологические и функциональные особенности респираторного тракта человека в контексте развития острой респираторной вирусной инфекции

На основе сравнительного анализа морфологических и функциональных характеристик РТ человека подразделяется на верхний и нижний отделы: первый из них включает ротовую и носовую полость, гортань и глотку (горло), начало трахеи; второй — трахею, главные бронхи, легкие, включая бронхиолы и альвеолы. Слизистая оболочка РТ сформирована эпителием, состоящим из нескольких типов клеток, который является барьером против вторжения патогенных микроорганизмов и других ксенобиотических факторов. Вирусы разных таксономических групп, а иногда даже штаммы, отличающиеся уровнем патогенности, различным образом взаимодействуют с клетками РТ (табл. 1).

Наиболее тяжело протекающий и наиболее опасный вариант ОРВИ — это пневмония, когда в инфекционный процесс вовлекается непосредственно ткани легких. Принято выделять три типа пневмонии: первичная вирусная (вызванная прямым вирусным поражением), вторичная вирусно-бактериальная (когда в течение первых 2 недель присоединяется бактериальная инфекция) и «пневмония 14-го дня», считая от начала заболевания (как правило, связанная с последующим заражением грамотрицательной микрофлорой) [16, 18].

Респираторный эпителий полости носа представляет собой цилиндрический мерцательный эпителий, который состоит из реснитчатых, бокаловидных и базальных клеток [3, 132]. На уровне гортани выступающие в ее просвет складки слизистой оболочки образуют голосовые связки: ложные, состоящие из рыхлой соединительной и лимфоидной ткани со слизистыми железами, и истинные, включающие поперечнополосатые мышцы и покрытые многослойным плоским эпителием [3, 136]. Эпителий слизистой оболочки трахеи состоит из столбчатых реснитчатых (их 200–250 ресничек на клетку участвуют в процессе мукоцилиарного очищения вдыхаемого воздуха), базальных (невысоких) и вставочных (высоких) эпителиоцитов, бокаловидных экзокриноцитов и эндокриноцитов [3, 76].

«Входными воротами» для возбудителей ОРВИ является верхний отдел РТ. Некоторые вирусы так и продолжают здесь реплицироваться, сохраняя прекрасную возможность распространяться в человеческой популяции (высокий уровень контагиозности) и ограничиваясь относительно легкой клинической симптоматикой. Отличным примером такой жизненной стратегии являются HRV. В некотором смысле, широкое распространение ОРВИ в человеческой популяции представляет собой «расплату за обретение речи»: как только наши далекие предки стали использовать звуковые сигналы для коммуникации, вместе с ними их голосовые связки стали производить и мелкодисперсный аэрозоль — таким образом, вирусы, обладающие тропизмом к эпителию верхних отделов РТ, получили селективное преимущество.

Ниже трахеи РТ выстлан реснитчатым псевдостратифицированным столбчатым эпителием. В бронхиолах эпителий меняется на кубический, или кубовидный, а в альвеолярных протоках и альвеолах представлен в основном альвеолоцитами (АЦ) двух типов: клетки I типа (АЦ-I) — тонкие и плоские — составляют более 90% поверхности легких и обеспечивают эффективный барьер для воздухообмена. Порядка 10% составляют клетки II типа (АЦ-II), которые имеют кубовидную форму и в основном выполняют функцию выработки и поглощения легочного сурфактанта, который снижает поверхностное натяжение, предотвращая коллапс альвеол. АЦ-II могут дифференцироваться в АЦ-I. В альвеолах также присутствуют иммунные клетки (альвеолярные макрофаги, дендритные клетки, лимфоциты, нейтрофилы) [141, 142].

Некоторые вирусы — например, HRSV и HAdV — достаточно медленно и чувствительным для пациента образом спускаются от верхних до нижних отделов РТ. Для IAV описан молекулярный механизм, лежащий в основе развития тяжелых и смертельно опасных пневмоний: эпидемический штамм, включающий множество вирусных вариантов, как правило, обогащен теми из них, которые имеют повышенную специфичность к α2'-6'-сиалозидам (что и обеспечивает им высокую способность поражать эпителиоциты верхних отделов РТ); затем начинается селекция вариантов IAV с аффинностью по отношению к α2'-3'-сиалозидам, которые присутствуют на поверхности эпителиоцитов нижних отделов РТ; если процесс такой селекции произойдет достаточно быстро (вследствие изначально повышенного содержания α2'-3'-специфичных вариантов в составе штамма или вследствие индивидуальных особенностей пациента), то развивается первичная вирусная пневмония [13, 27]. Этот же механизм объясняет, почему HPAI/H5N1 приводит к высокому уровню летальности: штаммы HPAI/H5N1 адаптированы к птицам и содержат α2'-3'-специфичные варианты IAV — такие варианты не имеют возможности поражать верхние отделы РТ человека и эффективно распространяться воздушно-капельным путем, поэтому инфицирование людей HPAI/H5N1 ограничивается спорадическими случаями; но если такой вариант попадет непосредственно в кровоток (например, при сыроедении, через порезы при ощипывании, при контактах с выделениями зараженных птиц и т. п.), то α2'-3'-специфичные варианты IAV с током крови попадают в нижние отделы РТ, вызывая смертельно опасную первичную пневмонию [18, 45].

Важной особенностью эпителия РТ является двухполюсная полярность: один полюс обращен к базальной мембране, а апикальный, или верхушечный, отдел обращен в выстилаемую эпителием полость [141, 142, 127]. Цилиарные или реснитчатые клетки составляют 50–80% эпителиальных клеток РТ, на апикальной поверхности которых находятся реснички. Реснички, представляющие собой выросты цитоплазмы, похожи на волоски, покрытые мембраной и содержащие микротрубочки, и выполняют функцию очистки воздуха от слизи и пыли [149]. Цилиарной активностью реснитчатых клеток и реологическими свойствами слизистого секрета определяется работа мукоцилиарной транспортной системы (МЦС) — механизма защиты РТ и организма от неблагоприятных факторов внешней среды, аллергенов и патогенных микроорганизмов. МЦС состоит из функционально связанных компонентов: реснитчатого или мерцательного эпителия, перицилиарного слоя секрета и собственно слизи [30]. Взаимодействие вирусов с реснитчатым эпителием — процесс гораздо более сложный, чем взаимодействие с поверхностью других эпителиальных клеток, и поэтому не может быть смоделирован на наиболее распространенных клеточных линиях [14, 15].

Около 9% респираторных эпителиальных клеток составляют бокаловидные клетки, продуцирующие слизь. 31% от популяции эпителиальных клеток РТ составляют базальные клетки, располагающиеся у основания эпителиального слоя. Базальные клетки представляют собой популяцию плюрипотентных клеток (ППК), способных дифференцироваться в реснитчатые клетки или кубовидные и бокаловидные клетки. Кубовидные клетки секретируют компоненты внеклеточного матрикса и могут служить клетками-предшественниками как для себя, так и для реснитчатых клеток. Их содержание в терминальных бронхиолах составляет 10–20%. Кубовидные клетки в альвеолах — это АЦ-II [155].

Моделирование острых респираторных вирусных инфекций с использованием первичных эпителиальных клеток человека

Иммортализованные (перевиваемые) клеточные линии имеют важное значение для вирусологических исследований, поскольку позволяют культивировать вирусы в воспроизводимых однородных условиях. Вместе с тем, такие клеточные культуры имеют ряд недостатков, главными из которых является невозможность воспроизведения и изучения процессов, происходящих на тканевом уровне, включая врожденный иммунный ответ [14, 15, 79]. Для преодоления этих недостатков осуществляется постоянное совершенствование существующих и работа над новыми моделями. В частности, для исследования ОРВИ получены модели на основе первичных эпителиальных клеточных культур (ПЭКК) из различных анатомических участков РТ человека.

Культуры недифференцированных первичных эпителиальные клеток (ндПЭКК) хорошо нарастают в виде монослоя, однако количество успешных пассажей ограничено и, как правило, не превосходит пяти, что ограничивает продолжительность экспериментальных исследований с их использованием. Источником выделения ндПЭКК служит биологический материал, получаемый в результате инвазивных процедур по забору мазков из носа и бронхов, при трахеобронхоскопии, во время хирургических вмешательств: из резецированных у онкологических больных тканей, трансплантатов легких, биопсии, из трупных эксплантатов. Полученную ткань измельчают и подвергают действию протеаз (в первую очередь — коллагеназ) для разрушения межклеточного матрикса и получения суспензии клеток, которые затем выращивают либо на плоских подложках, либо в пористых средах, покрытых коллагеном для предотвращения контактов эпителиоцитов с воздухом (чтобы предотвратить их поляризацию). Характерно, что ндПЭКК не поляризованы, не содержат реснитчатых или бокаловидных клеток и потому недостаточно полно воспроизводят условия РТ человека [81, 85, 146].

R.W. Chan с соавт. (2010) успешно использовали ндПЭКК из ранее хорошо дифференцированных (еще до отбора биологического материала для выделения) нормальных бронхиальных эпителиоцитов для сравнения репликативного потенциала (с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР)), уровня патогенности (с помощью оценки 50%-й инфекционной дозы (ИД₅₀)), а также продукции хемокинов и цитокинов (с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА)) двух штаммов IAV: эпидемического A/Hong Kong/54/1998 (H1N1) и HPAI A/Vietnam/3046/2004 (H5N1) [70]. Такой подход позволяет прогнозировать способность HPAI преодолевать межвидовой барьер и заражать эпителиоциты человека (и тогда эпидемический штамм можно рассматривать как референс-образец). Культура нормальных бронхиальных эпителиоцитов была использована и T. Kogure с соавт. (2006) для выяснения уровней представленности на их поверхности α2'-6'- и α2'-3'-сиалозидов, а также способности IAV инфицировать эти клетки [103]. Это исследование можно рассматривать как точку роста нового экспериментального направления — картирования различных анатомических отделов РТ по соотношению α2'-3'/α2'-6'-сиалозидов на поверхности эпителиоцитов. Эффективность такого подхода можно было бы дополнительно повысить путем его сочетания с измерением коэффициента специфичности, предложенного отечественными специалистами для определения α2'-3'/α2'-6'-аффинности с помощью набора сиалозидов различной химической структуры [19, 27].

На модели ндПЭКК из бронхов и трахеи было установлено, что IAV и HPIV-3 способны непосредственно инфицировать клетки мерцательного (цилиарного) эпителия [155]. Этот результат следовало бы дополнить влиянием лекарственных препаратов на цилиарный эпителий [5] и выяснению эффектов их сочетанного влияния с ОРВИ.

J.A. Aguiar с соавт. (2020) использовали ндПЭКК эпителиальных клеток дыхательных путей, собранных из носовых или бронхиальных соскобов здоровых некурящих людей для их профилирования на предмет наличия потенциальных рецепторов для SARS-CoV-2 [60]. Позже, в работе C.T. Wu с соавт. (2023), была представлена схема использования этим вирусом различных клеток-мишеней: в течение первых 24 ч после контакта SARS-CoV-2 с ндПЭКК происходит связывание с ресничками мерцательного эпителия; затем происходит выход дочерних вирусных частиц из микроворсинок обратно в слой слизи, и мукоцилиарный транспорт обеспечивает распространение вируса по РТ. При этом варианты линии Омикрон, обладающие выраженной контагиозностью, демонстрировали и наиболее высокую специфичность по отношению к реснитчатому эпителию [148]. Аналогичные результаты получены и в других исследованиях с применением ндПЭКК [80, 85, 107].

Сегодня ндПЭКК широко применяются для восстановления эпителиального слоя после трансплантации или реконструкции элементов верхних дыхательных путей, после операционных вмешательств в связи с травмами или при лечении злокачественных новообразований, а также по эстетическим показаниям [2, 28]. Это направление развития технологии клеточных материалов позволяет выйти на новый уровень моделирования процесса ОРВИ путем сочетания покрытий из ндПЭКК на внутренней поверхности распечатанных на 3D-принтере макетов РТ с принудительным созданием потоков воздуха, имитирующих дыхание [31, 34, 35, 36]. Количественные оценки репродуктивного числа, в зависимости от условий обстановки, и усреднение этих значений для наиболее характерных сценариев могли бы привести к разработке детализированных числовых моделей распространения ОРВИ в человеческой популяции [37, 77].

Культуры дифференцированных первичных эпителиальных клеток (дифПЭКК) получают в так называемых transwell-системах — пористых средах, на базолатеральную поверхность которых поступает культуральная среда, а апикальная поверхность взаимодействует с воздухом, что позволяет клеткам поляризоваться и дифференцироваться (при наличии соответствующих факторов роста). В такой системе дифференцировка клеток происходит в течение 3–4 недель [106]. В конечном итоге формируется поляризованный, псевдостратифицированный респираторный эпителий, содержащий базальные, реснитчатые, бокаловидные или кубовидные клетки (в зависимости от анатомического расположения) [67]. Такие клетки воспроизводят естественную структуру респираторного эпителия человека и подходят для эффективного исследования иммунопатогенеза респираторных вирусных инфекций, особенно таких аспектов, как тропизм и рецепторные взаимодействия (но не содержат иммунных клеток) [74].

В частности, A.C. Sims с соавт. (2008) с помощью дифПЭКК из легких человека показали, что ACE2 — основной рецептор для SARS-CoV и SARS-CoV-2 (табл. 1) — содержится на апикальной стороне дифференцированной поляризованной клетки, и именно на этой стороне реснитчатого эпителиоцита, обращенной в просвет РТ, разворачиваются ранние этапы его заражения SARS-CoV. Предобработка дифПЭКК антисывороткой против ACE2 резко снижает эффективность заражения. Для визуализации процесса заражения авторы создали рекомбинантный SARS-CoV/GFP путем делеции открытой рамки считывания 7a/7b и вставки зеленого флуоресцентного белка (GFP — green fluorescent protein). SARS-CoV/GFP обладал способностью заражать дифПЭКК, сопоставимой с исходным вирусом [135]. Такой рекомбинантный вирус при совместном использовании с дифПЭКК других животных может позволить создать экспериментальную систему для определения спектра потенциальных хозяев вируса, что необходимо для разработки научно-обоснованных программ эколого-вирусологического мониторинга природных очагов [22, 41].

Y.T. Lin с соавт. (2020) использовали диф-ПЭКК для изучения реакции эпителиоцитов на заражение IAV и выявили, что в ответ на инфекцию клетки продуцируют, главным образом, провоспалительные цитокины IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-1, IFN-3, а также хемокины СCL2, СCL5 [108]. Использование трахеобронхиальной дифПЭКК позволило установить, что в качестве клеточных рецепторов HPIV-1 выступают α2'-3'-сиалозиды, а иммунный ответ против этого вируса реализуется через хемокины СХCL10, СХCL11, регулирующие хемотаксис лимфоцитов [156].

Для идентификации клеточного тропизма HRSV и HMPV также использовались дифПЭК носовой полости и бронхов, свидетельствующие, что реснитчатые эпителиальные клетки и АЦ-II являются основной мишенью этих вирусов [84, 126]. Только применение культуры дифПЭКК позволило идентифицировать в качестве клеточных рецепторов для HRSV хемокиновый рецептор CX3CR1, поскольку этот рецептор отсутствует на иммортализованных клеточных линиях [84]. Аналогичным образом RGD-связывающие интегрины были описаны как клеточные рецепторы HMPV [126]. При этом HRSV и HMPV стимулировали в дифПЭКК продукцию схожих цитокинов: IFN-3, IL-6, IL-8, TNF-α, СXCL1, СXCL8, RANTES [84, 118, 153].

E. Lam с соавт. (2015), используя дифПЭКК, смогли установить, что HAdV проявляют тропность к клеткам легочной паренхимы, десмоглеин 2-го типа (DSG2 — desmoglein 2) является рецептором для этого вируса, а заражение HAdV вызывает продукцию эпителиоцитами IL-1, IL-8, IL-21 и факторов роста GM-CSF, GRO-α, SDF-1α [104].

HBoV успешно реплицируются в дифПЭКК, представляющих собой псевдоструктурированный эпителий дыхательных путей человека, который образуется после контакта эпителиальных клеток трахеи человека с воздухом. С помощью этой модели показано, что проникновение вирусных частиц и почкование дочерних вирусных частиц происходит в апикальной части клетки-мишени [78]. При этом отмечена продукция IL-1β, TNFα, CCL24, RANTES [101].

Бронхиальные дифПЭКК позволили уточнить тропизм HRV: оказалось, что HRV-A и HRV-B инфицируют базальные клетки, а HRV-C — реснитчатые эпителиальные клетки [122]. На первичных моделях дыхательных путей также воспроизведены и клинические характеристики риновирусов человека: известно, что HRV-B связан с менее тяжелыми проявлениями инфекции, а исследования дифПЭКК из носовой полости и бронхов показали, что HRV-B медленнее реплицируется и обладает меньшей цитотоксичностью по сравнению с HRV-A и HRV-C [117].

Дальнейшее развитие технологии дифПЭКК предусматривает выращивание смешанных культур с клетками неэпителиального происхождения — стромальными, эндотелиальными и иммунными — для разработки сложных 2D-моделей «мини-легких», отражающих истинное разнообразие клеточного состава этого органа [142].

Разработка органотипических 3D-моделей (3D-ОТМ) — трехмерных клеточных культур, способных к самоорганизации и обновлению пространственной структуры, представляет важный этап в исследовании ОРВИ: это органоиды (мини-органы), сфероиды, «органы на чипе». Получены 3D-ОТМ из эпителиальных клеток РТ, например полости носа или бронхов [63, 66, 109], а также легочные органоиды [139, 157].

Для разработки 3D-ОТМ используются различные типы ППК: эмбриональные (ЭППК), индуцированные (ИППК), органоспецифические (ОППК) клетки [111]. Для запуска процесса дифференцировки ИППК необходимо воздействие ряда растворимых экзогенных клеточных медиаторов (в первую очередь — факторов роста и цитокинов), которые, во-первых, обладают высокой стоимостью, во-вторых, алгоритмы их применения требуют длительной стандартизации [96]. Гораздо более перспективным представляется использование ОППК взрослого человека, которые могут дифференцироваться в клетки соответствующего органа. Такие ППК более доступны по сравнению с ЭППК и имеют меньше этических ограничений [72, 123]. Разработаны протоколы по использованию ИППК как из проксимальных, так и из дистальных отделов легких для получения любых типов клеток, связанных с респираторными заболеваниями. Такие ИППК могут дифференцироваться в эпителий легких, клетки врожденного иммунитета, эндотелиальные клетки и фибробласты, воспроизводя их функции in vivo в условиях in vitro [79, 116].

Наиболее совершенной является 3D-ОТМ легочных органоидов человека из фрагментов неповрежденной ткани с использованием transwell-систем на границе раздела воздух–жидкость [75]. В таких моделях сохранена эпителиальная и стромальная структуры наряду с эндогенными резидентными иммунными клеточными субпопуляциями легких (T-, B-, NK- и миелоидные клетки с сохранением их рецепторов). Это позволяет моделировать респираторные инфекции, развитие легочной недостаточности, а также воспроизводить не только врожденный, но и адаптивный иммунный ответ. Например, инфицирование таких органоидов SARS-CoV-2 индуцировало продукцию цитокинов, которая ингибировалась противовирусными средствами [72]. С помощью 3D-ОТМ в ответ на SARS-CoV-2-инфекцию была выявлена продукция широкого спектра цитокинов и хемокинов: IL-6, TNFα, GCSF, IFNG, CXCL10, CCL2 [89].

HRV-A и HRV-B успешно культивируются на иммортализованных клеточных линиях. В то же время HRV-C не поддается такому культивированию, однако может размножаться на 3D-ОТМ с использованием коммерческого Matrigel (BD Biosciences, США), воспроизводящего внеклеточную среду базальной мембраны, богатую ламинином и коллагеном IV, в качестве подложки для клеток [73]. Такой подход позволил установить клеточные рецепторы для HRV-C (ICAM-1, CX3CR1) [65] и продукцию провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-1, IFN-3) [113].

M. Xu с соавт. (2021) использовали органоиды-фрагменты миндалин для культивирования HBoV-1 и с помощью количественной ПЦР продемонстрировали, что этот вирус реплицируется в макрофагах и В-клетках. Кроме того, в такой модели ex vivo было показано, что вирионы HBoV-1 проникают в клетки-мишени, взаимодействуя с γ-рецептором FcγRII в рамках известного антителозависимого механизма инфицирования, что приводит к синтезу двухцепочечной ДНК и транскрипции мРНК [149].

Современное понимание 3D-ОТМ подразумевает контролируемое создание запланированной трехмерной клеточной структуры. Однако следует помнить (не только в историческом, но и в конструктивном плане) о том, 3D-ОТМ известны с 1960-х гг. как классические органные (органотипические) культуры, представляющие собой фрагменты органов, жизнеспособность тканей которых поддерживается в искусственных условиях ex vivo. В 1965 г. D.A. Tyrrell и M.L. Bynoe впервые использовали органную культуру трахеи 14–22-недельных человеческих эмбрионов (HETOC — human embryonic tracheal organ culture), полученных при гистеротомии, при отсутствии клинических подозрений на инфекции у матери или плода, для выделения вирусов из назальных смывов больных ОРВИ. Фрагменты трахеи (4–6 отдельностей) помещали в чашку Петри вверх поверхностью с реснитчатым эпителием, вносили среду 199 с 0,035 г/л бикарбоната натрия и инкубировали при 33°C в увлажненном контейнере, ежедневно меняя среду культивирования. С использованием такой модели был получен первый коронавирус человека HCoV-B814 [143], который, однако, не сохранился до сегодняшнего дня в официальных микробиологических коллекциях. Годом позже D. Hamre и J.J. Procknow представили информацию об изоляции HCoV-229E с помощью 3D-ОТМ/HETOC [88]. А в 1967 г. эта же 3D-ОТМ была использована K. McIntosh с соавт. для получения серии штаммов, которые они обозначали OC1, OC2 и т. д. [110] — к данной серии принадлежит и HCoV-OC43 (табл. 1) [68], который впоследствии был признан самостоятельным вирусом [54].

В 1965–1969 гг. B. Hoorn и D.A. Tyrrell показали применимость 3D-ОТМ/HETOC для эффективного культивирования IAV, IBV, IBC, HPIV-1, 2, 3, 4, HAdV-D, HRV-A, HRSV [144, 93, 94, 95]. В последующие годы — несмотря на то, что с 1970-х гг. клеточные линии стали вытеснять органные культуры — 3D-ОТМ/HETOC продолжала применяться для изучения возбудителей ОРВИ человека [90, 92, 114, 115], однако к началу XXI века постепенно вышла из широкого употребления. Но 3D-ОТМ/HETOC может оказаться востребованной как основа для создания более сложных и дифференцированных органотипических моделей.

В лаборатории респираторных вирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова Роспотребнадзора успешно используются сфероиды на основе клеток HEK 293T, экспрессирующих рецептор ACE2, который играет важную роль в прикреплении коронавируса SARS-CoV-2. Это позволяет воспроизводить более естественную трехмерную структуру тканей по сравнению с традиционными 2D-монослойными культурами клеток in vitro. В институте развивается модель интерфазного культивирования клеточной линии А-549 на transwell-мембранах, что позволяет моделировать межфазовый интерфейс дыхательных путей. Такой подход особенно актуален для исследования возбудителей ОРВИ, поскольку лучше имитирует физиологические условия альвеолярного эпителия. Комбинированное использование этих двух моделей предоставляет возможность проведения комплексных исследований механизмов вирусной инфекции и оценки эффективности потенциальных противовирусных композиций в условиях, приближенных к условиям in vivo.

Заключение

В первой четверти XXI века вполне отчетливо проявились основные тренды формирования эпидемической ситуации в отношении ОРВИ: последовательная урбанизация и экспоненциальный рост численности населения. Последнее приводит не только к увеличению плотности населения (что, естественно, облегчает распространение возбудителей ОРВИ среди людей), но и к разрастанию сельскохозяйственных и антропогенных ландшафтов, что приводит к интенсификации популяционных взаимодействий и повышает вероятность проникновения природно-очаговых вирусов из их природного резервуара в человеческую популяцию [7, 41, 49]. В результате не только сохраняются прежние пандемические угрозы, связанные с возможностью преодоления вирусом гриппа А птиц межвидового барьера и формирования штаммов с пандемическим потенциалом [20, 43, 47], но и возникают новые, связанные, в первую очередь, с коронавирусами летучих мышей, обладающими значительным эпидемическим потенциалом [33, 44, 54]. Высокий уровень настороженности следует сохранять и по отношению к парамиксовирусам грызунов [27, 112] и вирусам Океана, данные о которых совершенно недостаточны [27, 102].

Пандемия COVID-19 (2020–2023 гг.) наглядно продемонстрировала, что колоссальная технологическая оснащенность не в состоянии уберечь человечество от очередных пандемий, которые не только не становятся поводом к консолидации, но – напротив — используются в качестве инструмента политического противостояния. В сложившейся ситуации следует готовится к новым, еще более масштабным биологическим катастрофам. Обязательными элементами такой подготовки является развитие молекулярно-генетических технологий и классических вирусологических методов. И если первые развиваются опережающими темпами, вторые не просто отстают, но часто вытесняются или даже подменяются первыми. Одним из направлений развития подходов к работе с живыми вирусами может стать конструирование 3D-клеточных моделей, позволяющих с высокой степенью надежности прогнозировать биологические свойства возбудителей ОРВИ.

Несмотря на усилия отдельных развитых стран наладить полноценное международное сотрудничество в области общественного здравоохранения, приходится с сожалением констатировать, что к концу первой четверти XXI века человечество в целом допустило существенное ослабление роли международных институтов и, в частности, Всемирной организации здравоохранения. В этих условиях основные усилия по стандартизации использования 3D-клеточных моделей для широкомасштабного мониторинга и изучения актуальных возбудителей ОРВИ должны быть направлены на создание национальных Банков биологических материалов и научно-методических центров (с возможностью расширения их функционала до международного уровня при наступлении подходящих условий). Одним из примеров реализации такой стратегии является создание в Российской Федерации собственной национальной платформы молекулярно-генетических данных VGARus (Virus genome aggregator of Russia), разработанной Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека [1, 38, 52]. Необходимы разработка единой линейки отечественного оборудования для биопринтинга и унификация алгоритмов печати 3D-ОТМ. Следует рассмотреть вопрос о восстановлении широкого использования 3D-ОТМ/HETOC.

Aut non tentaris, aut perfice.⁷ Поскольку моделирование респираторных вирусных инфекций в широком спектре методических подходов — от первичных эпителиальных культур до органоидов — доказало свою эффективность, то Rubicon iam supra est⁸.

 

¹ Новейшая история — период Всемирной истории с 1918 г. по настоящее время.

² В 1955 г. C.H. Andrewes предложил термин «миксовирусы», этимологически восходящий к древнегреческому μύξα (слизь). Сегодня эта группа вирусов рассматривается как внетаксономическая и устаревшая, разделившись на несколько семейств: Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Coronaviridae, Pneumoviridae, Picornaviridae (см. подробности в [54, 102]).

³ Здесь и далее для представителей семейства Coronaviridae таксономическое положение приводится в формате: род, подрод.

⁴ Коронавирусы обладают самым протяженным геномом (порядка 30 тыс. нуклеотидов) среди всех известных на сегодняшний день РНК-содержащих вирусов [102].

⁵ Современное название вируса Сендай — вирус парагриппа мышей (MuRV — Murine respirovirus) (Mononegavirales: Paramyxoviridae, Respirovirus). Следует обратить внимание, что в работах третьей четверти прошлого века этот вирус часто назывался «вирус гриппа D», хотя никакого отношения к семейству Orthomyxoviridae он не имеет. Ситуация может вызвать еще большую путаницу в связи с тем, что в 2011 г. B.M. Hause и соавт. был описан новый представитель ортомиксовирусов — вирус гриппа D (IDV — Influenza D virus) (Articulavirales: Orthomyxoviridae, Deltainfluenzavirus), который циркулирует среди крупного рогатого скота и свиней и не вызывает инфекцию у людей [91].

⁶ Название вируса связано с тем, что в культуре клеток HRSV вызывает слияние клеток в гигантские многоядерные синцитии, что, впрочем, не является уникальным и свойственно также другим вирусам — например, MuRV и вирусу иммунодефицита человека (HIV — Human immunodeficiency virus) (Ortervirales: Retroviridae, Lentivirus) [27].

⁷ Или не берись, или доводи до конца. (лат.)

⁸ Рубикон уже позади. (лат.

About the authors

Tatyana A. Kuznetsova

G.P. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Author for correspondence.
Email: takuznets@mail.ru

DSc (Medicine), Head Researcher, Laboratory of Immunobiological Preparates

Russian Federation, Vladivostok

A. A. Mikhalko

G.P. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; Far Eastern Federal University

Email: takuznets@mail.ru

Research Laboratory Assistant, Laboratory of Biopreparations, Student, School of Medicine and Life Sciences

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok

E. M. Shchelkanov

State University of Education

Email: takuznets@mail.ru

Student of the Faculty of Natural Sciences

Russian Federation, Mytishchi, Moscow Region

S. P. Kryzhanovsky

Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences

Email: takuznets@mail.ru

RAS Corresponding Member, DSc (Medicine), Deputy Chairman 

Russian Federation, Vladivostok

M. Yu. Shchelkanov

G.P. Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing; Far Eastern Federal University

Email: takuznets@mail.ru

RAS Corresponding Member, DSc (Biology), Director, Head of the Department of Epidemiology, Microbiology and Parasitology, School of Medicine and Life Sciences

Russian Federation, Vladivostok; Vladivostok

References

Supplementary files