Long non-coding RNAs — regulators of rubella virus infection and antiviral response

Full Text

Введение

Вирус краснухи — один из трех представителей рода Rubivirus семейства Matonavirus, включающего вирусы, содержащие РНК положительной полярности и способные вызывать инфекционные заболевания. Вирус краснухи является антропонозом, инфицирование вирусом краснухи вызывает заболевание с легкой симптоматикой. Однако заражение беременных женщин вирусом краснухи может привести к выкидышу или синдрому врожденной краснухи (СВК) — набору долговременных врожденных дефектов, включая неполное развитие органов и умственную отсталость. Международные кампании по вакцинации привели к значительному сокращению количества случаев инфицирования вирусом краснухи, тем не менее краснуха до сих пор остается важной проблемой в странах Африки и Юго-Восточной Азии с низким охватом вакцинацией. При этом в большинстве случаев вакцинация охватывает только женщин, в результате чего мужчины остаются восприимчивы к вирусу краснухи, что препятствует полной ликвидации вируса. Несмотря на то, что вирус краснухи был выделен относительно давно, и его аттенуированные варианты успешно используются в вакцинных препаратах, молекулярные механизмы взаимодействия вируса и клетки до конца неизвестны [14]. Таким образом, точное установление уникальных молекулярных стратегий, лежащих в основе взаимодействия вируса и клетки-хозяина, имеет решающее значение для лучшего понимания процесса инфицирования РНК-содержащими вирусами и идентификации новых терапевтических целей.

Некодирующие РНК (нкРНК) обладают небольшой способностью кодировать белок и функционируют как регуляторы эпигенетичес кой, транскрипционной и посттранскрипционной экспрессии генов. К некодирующим РНК относят длинные нкРНК (днРНК), транспортные РНК (тРНК), рибосомные РНК (рРНК), малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК и другие. ДнРНК представляют собой молекулы РНК длиной свыше 200 нуклеотидов, которые не транслируются в белки. При этом точная классификация и идентификация днРНК до сих пор недоступны. ДнРНК участвуют в нескольких биологических процессах, включая эпигенетическую регуляцию экспрессии генов, апоптоз, контроль клеточного цикла, а также в развитии, дифференцировке и старении клеток [4]. Кроме того, в настоящее время активно изучается регуляция противовирусного иммунного ответа и вирусной репродукции при помощи днРНК. Таким образом, цель данного исследования — оценить изменение экспрессионного профиля нкРНК в эпителиальных клетках А549, инфицированных вирусом краснухи.

Материалы и методы

Дикий вариант вируса краснухи, штамм С-77, полученный из коллекции НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (титр 5,9–6,1 log₁₀ ТЦД₅₀/мл), размножали в культуре клеток Vero (CCL-81, ATCC, США).

Эпителиальная клеточная линия карциномы легких A549 была любезно предоставлена кандидат биологических наук  Никоновой А.А. Клетки вели в культуральной среде DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, США), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS; Thermo Fisher Scientific), 1 мМ глютамином (Thermo Fisher Scientific) и 50 мкг/мл раствором гентамицина (Thermo Fisher Scientific) в атмосфере 5% CO₂ при 37°C. Культуру пассировали по достижении конфлюэнтности с помощью TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific). Для оценки жизнеспособности клеток в клеточной суспензии использовали 0,2% раствор трипанового синего (Thermo Fisher Scientific), подсчет проводили в камере Горяева.

Для анализа экспрессии днРНК, 1,0 × 10⁶ клеток А549 заражали вирусом краснухи со множественностью инфицирования (MOI) 1.0 инфекционных единиц на клетку. Зараженные клетки инкубировали в среде DMEM/F12, дополненной 2% FBS, в атмосфере, содержащей 5% CO₂, при 37±1°C в течение 72 ч. В качестве контроля использовали незараженные клетки. Для определения титра вируса ежедневно отбирали 200 мкл супернатанта, осветляли центрифугированием при 3370g в течение 10 мин для удаления дебриса и хранили при –70°C до анализа. Титры вируса определяли методом предельных разведений по ЦПД в чувствительной культуре клеток RK-13 (ATCC, США).

РНК выделяли из трех независимо инфицированных культур клеток через 48 ч после заражения. Тотальную РНК выделяли с помощью набора RNeasy (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Качество и количество РНК оценивали с помощью биоанализатора 2100-Bioanalyzer (Agilent Technologies, Германия). Индекс RIN (индекс целостности РНК) составлял 9,5–10.

Библиотеки для секвенирования готовили с помощью набора TruSeqRNA Library Preparation Kit v2 (Illumina, США). Для каждого образца использовали около 1–2 мкг общей выделенной РНК. Конечный размер фрагментов библиотеки кДНК составлял 400–500 п.н. Для точного определения концентрации полученной кДНК использовали количественную ПЦР, затем готовили смесь библиотек кДНК тестируемых образцов в равных пропорциях и проверяли смешанные библиотеки. Секвенирование проводили на платформе NextSeq500 (Illumina, США) в режиме парного чтения (2 × 150 п.н.). Было проведено два прогона NextSeq500. Для каждого образца было получено около 30–50 млн прочтений. Полученные чтения проверяли с помощью FastQC 0.11.5, обрезая с помощью Trimmomatic 0.39 и затем картировали с референсным геномом человека GRCh38 (аннотация Ensembl версии 102) с помощью STAR 2.7.5a. Количество прочтений на ген оценивали с помощью инструмента featureCounts из пакета Subread 1.6.0. Кроме того, отсутствие 3'-смещения проверяли с помощью скрипта geneBody_coverage из набора инструментов RSeQC 3.0.1. Дифференциальный анализ экспрессии генов проводили с использованием пакета edgeR 3.28.

 

Рисунок 1. Кривая накопления вируса краснухи в супернатантах

Figure 1. Rubella virus accumulation in supernatants

Примечание. По оси Х отложено время после инокуляции вируса в ч (hrs p.i.), по оси Y — титр вируса краснухи, выраженный в log₁₀ ТЦД₅₀/мл. Полосы погрешностей обозначают стандартное отклонение.

Note. The X axis represents the time after virus inoculation in hrs (hrs p.i.), the Y axis represents the rubella virus titre expressed in log₁₀ CCID₅₀ /mL. Data shown represents mean of three independent experiments. Error bands indicate SD.

 

Валидацию полученных данных РНК-секвенирования проводили с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени (qPCR-RT).

Линия клеток A549 была инфицирована диким вариантом лабораторного штамма вируса краснухи C-77 при MOI 1.0 инфекционных единиц на клетку. Титр вируса краснухи в культуре клеток вируса через 48 часов после инокуляции составил 5.56 log₁₀ ТЦД₅₀/мл (рис. 1). Таким образом, время 48 часов после заражения культуры клеток A549 было выбрано для РНК-секвенирования для анализа экспрессии генов, так как в этот момент времени не менее трети клеток в монослое инфицированы.

Результаты и обсуждение

Результаты секвенирования представлены на рис. 2 (III обложка).

 

Рисунок 2. Экспрессия наиболее значимых днРНК (IncRNA) в клетках, инфицированных вирусом краснухи (FDR < 0,005)

Figure 2. Expression of the most significant dnRNAs (IncRNAs) in rubella virus-infected cells (FDR < 0.005)

Примечание. Гены с наиболее повышенной и пониженной экспрессией в клетках А549, зараженных вирусом краснухи, по сравнению с незараженными. CPM (Counts per million) — единица измерения экспрессии генов, нормирующаяся на глубину секвенирования.

CPM rank (%) — позиция гена (0...100) в списке всех генов, отсортированных по уровню экспрессии (количество прочтений на миллион). LogFC — двоичный логарифм кратности изменения уровня экспрессии. FDR (false discovery rate) — коэффициент ложного обнаружения.

QLF — квазивероятностный F-тест. Mann-Wh. — непараметрический U-тест Манна-Уитни. Control — значения экспрессии гена для незараженной культуры клеток А549. Rubella — значения экспрессии гена для зараженной вирусом краснухи культуры клеток А549.

Note. The most upregulated and downregulated genes in rubella virus-infected A549 cells compared to uninfected cells. CPM (Counts per million) — gene expression unit that normalizes only for sequencing depth (depth-normalized counts). position of a gene (0...100) in a list of all genes sorted by expression level (read counts per million). LogFC — binary logarithm of expression level fold change. QLF — quasi-likelihood F-test. Mann-Wh. — non-parametric Mann-Whitney U-test. Control — expression level fold change for uninfected A549 cells.Rubella — expression level fold change for rubella virus-infected A549 cells.

 

Репликация вируса краснухи приводила как к up-, так и down-регуляции экспрессии днРНК. Среди наиболее up-регулированных днРНК (FDR < 0,005) были выявлены GAS5, NEAT1, LUCAT1, MIR210HG, MEG3, EPB41L4A-AS1, ZFAS1, а также SNHG (small nucleolar RNA host genes) 1, 7, 12, 29, 32. Наиболее down-регулиро ваны (FDR < 0,01) следующие днРНК: DANCR, IGFL2-AS1, MIR1915HG, а также SNHG14. Gene ontology (GO)-анализ показал вовлечение метаболических процессов в ответ на вирусное заражение, в частности, процессинга РНК и метаболизма нуклеиновых кислот.

Известно, что днРНК играют важную роль в модуляции вирусной инфекции посредством регуляции противовирусного ответа на разных уровнях, включая воздействия на рецепторы распознавания патогена, или посредством эпигенетических, транскрипционных и посттранскрипционных эффектов. Также некоторые днРНК могут оказывать противовирусное действие путем прямого подавления вирусной инфекции, в то время как другие днРНК играют провирусную роль за счет прямого стимулирования репликации вируса или за счет влияния на клеточный статус, например, путем подавления противовирусных механизмов [1].

Так, наиболее значимо экспрессированная днРНК GAS5 (growth arrest specific 5) необходима для остановки нормального роста и замедления клеточного цикла. Роль GAS5 была показана в репликации вируса гепатита С (HCV). Так, GAS5 связывается с белком NS3 и ингибирует репликацию HCV. С другой стороны, экспрессия GAS5 подавляется во время инфекции ВИЧ-1, так как GAS5 может ингибировать репликацию ВИЧ-1, посредством взаимодействия с miR-873 [15]. Также было показано, что GAS5 индуцирует ответ на повреждение ДНК и регулирует апоптоз в CD4 Т-клетках пациентов с ВИЧ посредством регуляции экспрессии miR-21 [10].

Другая значимо экспрессированная днРНК в ответ на репликацию вируса краснухи, NEAT1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1), играет критическую роль в противовирусном ответе интерферона I типа (IFNβ) посредством передачи сигналов RIG-I и пути cGAS-STING-IRF3. Известно, что вирусы гриппа A (IAV), ВИЧ (HIV) и простого герпеса 1 (HSV-1) up-регулируют экспрессию NEAT1 [7]. Кроме того, экспрессия NEAT1 усиливает продукцию IFNβ через путь RIG-I-IRF7 при хантавирусной инфекции [2]. Также показана ее роль в репликации вируса лихорадки Денге посредством модуляции экспрессии IFI27 [9].

С другой стороны известно, что DANCR и NEAT1 могут совместно вносить вклад в сеть нкРНК-мРНК, регулирующих воспаление в сочетании с другими кодирующими и некодирующими элементами при инфекции SARS-CoV-2 [5]. В других работах также показана индукция экспрессии NEAT1, наряду с EPB41L4A-AS1, MEG3 и MALAT1, в SARS-CoV-2-инфицированных клетках [6, 8].

В свою очередь, днРНК DANCR модулирует действие катенина бета-1 (CTNNB1), активно участвующего в респираторных инфекциях и сепсисе. Предыдущие исследования свидетельствуют о том, что DANCR может вызывать провоспалительную активацию белка STAT3 через путь IL-11-JAK2. STAT3, в свою очередь, активирует IL-1β, IL-6, NF-kB1, REL и RELB, а также транскрипционный фактор SPI-1, который далее взаимодействует с TNFα, NF-kB2, RELA, DANCR, и NEAT1-ассоциированным p54nrb параспецифическим белком [5]. Авторы проследили корреляцию уровней экспрессии DANCR в инфицированных SARS-CoV-2 клетках легкого с уровнями экспрессии таких медиаторов воспаления, как IL-1β, IL-6, TNFα, и пятью субъединицами NF-kB. Так, была выявлена статистически значимая отрицательная корреляция уровней экспрессии DANCR с транскрипцией факторов каноничес кого пути активации NF-kB, включая NF-kB1 и IL-1β. С другой стороны, экспрессия DANCR положительно коррелировала с экспрессией факторов NF-kB2 и RELB, составляющих неканонический путь активации NF-kB [5]. Таким образом, была установлена обратная связь между DANCR и воспалением, а значит, вероятно, снижение DANCR функционально связано с острой фазой инфекции и ее последствиями. Кроме того, DANCR и NEAT1 оказывают влияние на нервную ткань, приводя к когнитивным нарушениям.

Экспрессия днРНК MEG3 (maternally expres sed 3) способствует репликации не только коронавируса, но и респираторно-синцитиального вируса, подавляя сигналинг TLR4 [11]. Экспрессия днРНК LUCAT1 (lung cancer associated transcript 1) приводит к снижению воспаления, посредст вом регулирования сплайсинга и стабильности NR4A2 [12]. В миелоидных клетках человека увеличение экспрессии LUCAT1 через взаимодействие со STAT1 приводит к снижению транскрипции генов, стимулированных интерфероном в ответ на инфекцию [13].

Кроме того, репликация вирусов HBV, HPV, CHIKV способствует увеличению экспрессии днРНК MIR210HG (MIR210 host gene), а вирусы IAV, HBV — ZFAS1 (ZNFX1 antisense RNA 1), усиливая противовирусный врожденный иммунный ответ [3].

Таким образом, можно предположить, что репликация вируса краснухи влияет на экспрессионный профиль клетки-хозяина путем модуляции выработки днРНК. Впервые показана регуляция продукции днРНК вирусом краснухи. Кроме того, дифференциально экспрессированные днРНК могут быть использованы в качестве прогностических и диагностических биомаркеров вирусных заболеваний.

Благодарность

Авторы выражают благодарность сотрудникам Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Краснову Г.С. и Наседкиной Т.В.

About the authors

M. K. Gulimov

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: yulia.ammour@yahoo.fr

PhD Student

Russian Federation, 115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15

N. O. Kalyuzhnaya

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: yulia.ammour@yahoo.fr

PhD Student

Russian Federation, 115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15

Yulia I. Ammour

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: yulia.ammour@yahoo.fr

PhD (Biology), Head of the Laboratory of Experimental Immunology

Russian Federation, 115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15

V. V. Zverev

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: yulia.ammour@yahoo.fr

RAS Full Member, DSc (Biology), Professor, Scientific Director

Russian Federation, 115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15

O. A. Svitich

I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: yulia.ammour@yahoo.fr

DSc (Medicine), Professor of RAS, RAS Corresponding Member, Director

Russian Federation, 115088, Moscow, 1st Dubrovskaya str., 15

References

Supplementary files