PD-1 AND Tim-3 Expression on different subpopulations of monocytes in chronic often recurrent herpesvirus infection

Full Text

Введение

Инфекции, вызываемые вирусом простого герпеса (herpes simplex) I и II типов (HSV-I и HSV-II), являются широко распространенными. Более половины населения Земли инфицированы вирусом простого герпеса [11]. У большинства людей, носителей вируса, инфицирование не сопровождается симптомами герпетической инфекции. Однако у 2–10% заболевание протекает в хронической форме с частыми рецидивами и выраженными симптомами [9]. Причиной этого может являться нарушение иммунного ответа. Основой терапии рецидивирующего герпеса являются противовирусные препараты, блокирующие репликацию вируса герпеса — ациклические нуклеозиды (ацикловир, валакцикловир и др.). Полной элиминации вируса, впрочем, не происходит, вследствие чего рецидивы могут повторяться, чаще после отмены противовирусной терапии, но иногда и на фоне ее. Кроме того, в некоторых случаях противовирусная терапия и вовсе не приводит к положительным эффектам: тяжесть и частота рецидивов остаются прежними. В связи с этим активно разрабатываются новые методы терапии герпесвирусной инфекции, способные более отчетливо повлиять на течение заболевания. В иммунологическом отделении НИИФКИ разработан протокол лечения хронической часто рецидивирующей герпесвирусной инфекции, сочетающий вируссупрессивную и иммуномодулирующую терапию. Данная схема показала хорошую эффективность: у большинства пациентов, получивших лечение, уменьшались тяжесть и частота рецидивов и увеличивался межрецидивный период, у некоторых больных до нескольких лет. Однако некоторые пациенты, получившие лечение по описанной схеме, не отмечали положительного эффекта, заболевание у них продолжало часто и тяжело рецидивировать. В связи с неоднородностью ответа на терапию различных пациентов представляется актуальным изучение потенциальных прогностических биомаркеров эффективности терапии герпесвирусной инфекции.

Различный ответ пациентов на курс иммуномодулирующей и противовирусной терапии может быть связан с индивидуальными особенностями иммунной системы и иммунного ответа. Важную роль в регуляции иммунных реакций, в частности, имеют чек-пойнт молекулы, наиболее изученными из которых являются PD-1 и Tim-3. Первоначально PD-1 и Tim-3 были обнаружены на Т-лимфоцитах, однако впоследствие выяснилось, что спектр клеток, экспрессирующих PD-1 и Tim-3, шире, в частности, эти молекулы экспрессируют и моноциты. Показано, что активация чек-пойнт молекул приводит к подавлению активности клеток и, как следствие, к подавлению Т-клеточного иммунного ответа [3, 4]. Оверэкспрессия PD-1 на лимфоцитах и моноцитах/макрофагах ассоциируется с повышенной частотой нозокомиальных инфекций, более высокой смертностью от сепсиса, что может быть связано с избыточной иммуносупрессивной активностью [1, 6]. Показано увеличение количества моноцитов, секретирующих IL-10 и TNFα, при блокаде PD-1 и Tim-3 [10]. Таким образом, PD-1 и Tim-3 участвуют в регуляции функций иммунных клеток, в частности, моноцитов, и их роль в настоящее время активно исследуется. Анализ экспрессии данных молекул на моноцитах при хронических вирусных инфекциях, однако, ранее не проводился.

Целью настоящего исследования явился анализ экспрессии PD-1 и Tim-3 различными субпопуляциями моноцитов у пациентов с хронической часто рецидивирующей герпетической инфекцией.

Материалы и методы

В исследование были рекрутированы 26 пациентов (26 женщин, в возрасте от 27 до 76 лет, медиана 42 года) с хронической часто рецидивирующей герпесвирусной инфекцией (частота обострений 4–36 в год, медиана 12), включая 15 с генитальной локализацией герпеса и 11 с лабиальной. Длительность заболевания варьировала от 2 до 50 лет (медиана 13 лет). В группу сравнения вошли 15 условно здоровых доноров (5 мужчин, 10 женщин, возраст 21–58 лет, медиана 35 лет). У всех пациентов и доноров, включенных в исследование, было получено письменное информированное согласие. Все пациенты получили стандартный курс терапии в условиях иммунологического отделения НИИФКИ продолжительностью в среднем 10 дней, включавший в себя противовирусные (валацикловир) и иммуномодулирующие (галавит, натрия нуклеинат, имунофан, полиоксидоний, тималин, ликопид, ронколейкин) препараты. Иммуномодулирующая терапия подбиралась индивидуально, с учетом показаний и противопоказаний на основе тяжести и длительности заболевания, иммунного статуса, сопутствующих заболеваний. После выписки из стационара пациенты продолжали принимать противовирусные препараты. Для оценки эффективности проведенной терапии проводился опрос пациентов спустя 3 месяца после выписки из стационара. Пациенты, у которых за 3 месяца не регистрировалось ни одного рецидива заболевания, считались ответившими на терапию, а те, у кого был хотя бы один рецидив — не ответившими.

Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина. Методом проточной цитофлюориметрии оценивали количество классических (CD14⁺⁺/CD16⁻; кМо), промежуточных (CD14⁺⁺/CD16⁺; пМо) и неклассических (CD14⁺/CD16⁺⁺; нМо) моноцитов, уровень экспрессии и среднюю интенсивность флюоресценции PD-1 и Tim-3 в каждой из субпопуляций моноцитов.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft Inc). Данные представлены в виде медианного значения и интерквартильного диапазона (IQR, 25–75% квартили). Для выявления достоверности различий сравниваемых показателей применяли непараметрический критерий Манна–Уитни и параметрический критерий Вилкоксона (для связанных выборок); различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Содержание моноцитов в периферической крови больных герпесвирусной инфекцией было снижено в сравнении со здоровыми донорами (0,37 [0, 3–0, 45] × 10⁹/мл против 0,49 [0, 43–0, 53], p = 0,003), оставаясь, однако, у всех пациентов в пределах стандартных референсных значений. Абсолютное количество моноцитов всех трех исследованных субпопуляций также было значимо ниже в группе пациентов (p < 0,05). При этом относительное количество классических (кМо) и промежуточных (пМо) моноцитов между группами не различалось, в то время как процентное содержание неклассических (нМо) моноцитов в группе пациентов было снижено более, чем в 2 раза: 0,9% [0, 5–1, 5] против 2% [1, 1–4] у доноров (p = 0,004) (табл.).

 

Таблица. Экспрессия PD-1 и Tim-3 на различных субпопуляциях моноцитов у пациентов с часто рецидивирующей герпетической инфекцией

Table. Expression of PD-1 and Tim-3 on different monocyte subpopulations in patients with recurrent herpes infection

			Доноры (n = 15) Donors (n = 15)	Пациенты (n = 26) Patients (n = 26)	pu
кМо (CD14⁺⁺/CD16⁻)		%	93,7 [86–95, 6]	95,1 [92, 5–96]	0,13
кМо	PD-1	%	24 [18–30]	12,1 [7, 7–19, 1]	0,001
		MFI	632 [607–694]	400 [292–454]	< 0,001
	Tim-3	%	73,9 [55–88]	68,2 [48, 2–87, 9]	0,44
		MFI	1158 [1077–1433]	890 [280–1210]	0,09
пМо (CD14⁺⁺/CD16⁺)		%	3,4 [2, 1–4]	2,4 [1, 5–3, 5]	0,31
пМо	PD-1	%	56 [40–71]	28 [15–43, 1]	< 0,001
		MFI	1138 [994–1591]	484 [357–740]	0,003
	Tim-3	%	95 [90–97, 4]	92,7 [83, 3–97, 9]	0,31
		MFI	1911 [1537–2481]	1298 [321–1687]	0,004
нМо (CD14⁺/CD16⁺⁺)		%	2 [1, 1–4]	0,9 [0, 5–1, 5]	0,004
нМо	PD-1	%	56 [41–64]	27,7 [13, 4–36]	< 0,001
		MFI	987 [787–1312]	562 [452–837]	0,01
	Tim-3	%	87,8 [83–95]	83,5 [56, 7–96, 4]	0,31
		MFI	1649 [1492–1796]	1038 [376–1519]	0,006

Примечание. данные представлены в виде медианного значения и интерквартильного диапазона (IQR, 25–75%). p_u — достоверность различий между группами пациентов и доноров по U-критерию Манна–Уитни.

Note. data are presented as median and interquartile range (IQR, 25–75%). p_u — significance of differences between groups of patients and donors according to the Mann–Whitney U-test.

 

Как у доноров, так и у пациентов процент PD-1-позитивных клеток был выше в субпопуляциях пМо и нМо в сравнении с кМо, аналогичные различия выявлялись и по средней интенсивности флюоресценции (MFI) (p < 0,05). В то же время популяции пМо и нМо по указанным показателям между собой не различались. В группе доноров все субпопуляции моноцитов различались между собой как по относительному содержанию Tim-3-позитивных клеток, так и по средней интенсивности флюоресценции Tim-3 (p < 0,05). При этом наибольший процент Tim-3⁺-клеток и MFI регистрировался в пМо, а наименьший — в кМо. У пациентов различия между субпопуляциями моноцитов по Tim-3 оказались аналогичными таковым в донорской группе, за исключением отсутствия различий между пМо и нМо по MFI.

Анализ экспрессии PD-1 моноцитами показал снижение относительного содержания PD-1⁺- клеток и средней интенсивности флюоресценции PD-1 во всех трех субпопуляциях моноцитов больных с герпесвирусной инфекцией (p < 0,05) (табл.) в сравнении с донорской группой. В то же время относительное содержание Tim-3-позитивных клеток у больных не снижалось ни в одной из популяций моноцитов. Средняя интенсивность флюоресценции Tim-3, однако, была снижена во всех популяциях: в пМо и нМо регистрировалось достоверное снижение (p = 0,003 и p = 0,006 соответственно), в кМо изменения были выражены на уровне тренда (p = 0,09) (табл.). Помимо этого, у больных во всех трех субпопуляциях моноцитов было выявлено значимое снижение доли дубль-позитивных PD-1⁺/ Tim-3⁺-моноцитов в сравнении с донорской группой.

Описанные различия выявлялись у пациентов как с лабиальной (n = 11), так и с генитальной (n = 15) формой инфекции, в то же время группы пациентов с различной локализацией герпеса не различались между собой ни по одному из исследованных параметров.

Все пациенты, рекрутированные в исследование, получили курс противовирусной и иммуномодулирующей терапии в условиях стационара. Субпопуляционный состав моноцитов и уровень экспрессии PD-1 и Tim-3 оценивали также сразу после проведенной терапии. Было показано, что содержание PD-1⁺-моноцитов и MFI PD-1 после терапии не изменяется ни в одной из субпопуляций. Вместе с тем относительное содержание Tim-3⁺-клеток после терапии значимо снижалось в субпопуляциях пМо (82,6% [54, 3–94, 3] в сравнении с 92,7% [83, 3–97, 9] до терапии, p < 0,001) и нМо (65,9% [37, 5–81, 8] в сравнении с 83,5% [56, 7–96, 4] до терапии, p = 0,018), оставаясь при этом на прежнем уровне в кМо. Снижения MFI Tim-3 после курса лечения зарегистрировано не было.

Спустя 3 месяца после полученного курса терапии пациенты были опрошены с целью оценки ответа на терапию. Положительно ответившими считались пациенты, у которых не было ни одного рецидива за 3 месяца, прошедшие после окончания курса терапии, количество таких пациентов в настоящем исследовании составляло 47% от общего числа опрошенных. Исходное (до терапии) количество как PD-1-, так и Tim-3-позитивных моноцитов всех трех популяций у ответивших и не ответивших на терапию больных не различалось. В то же время ответившие пациенты отличались существенно более низким (более, чем в 3 раза в сравнении с неответчиками) исходным содержанием дубль-позитивных клеток в субпопуляциях пМо и нМо, различие в обеих субпопуляциях носило характер тренда (p = 0,06 и p = 0,09 соответственно).

Популяция циркулирующих моноцитов человека является гетерогенной. Традиционно по соотношению экспрессии CD14 и CD16 выделяются три субпопуляции — классические, промежуточные и неклассические моноциты. Эти субпопуляции рассматриваются как стадии дифференцировки (от классических к неклассическим) и обладают различными свойствами. Так, кМо традиционно рассматриваются как клетки с преимущественно провоспалительными свойствами, обладающие высокой способностью к фагоцитозу, продукции активных форм кислорода и миграции в очаг воспаления [7]. ПМо также ранее рассматривались как провоспалительные клетки, поскольку они активно продуцируют провоспалительные цитокины и способны дифференцироваться в М1-макрофаги в тканях, однако в последнее время считается, что свойства пМо зависят от поступающих сигналов и могут быть как преимущественно про-, так и противовоспалительными [8]. НМо, в свою очередь, обычно рассматриваются как клетки с преобладанием регуляторной и противовоспалительной активности [5]. Все популяции моноцитов экспрессируют ингибиторные сигнальные молекулы PD-1 и Tim-3 (также обозначаемые как чек-пойнт молекулы). Экспрессия PD-1 и Tim-3 CD16⁺-моноцитами с преобладанием регуляторной и противовоспалительной активности выше, чем провоспалительными кМо, что согласуется с данными об иммуносупрессивной роли чек-пойнт молекул.

Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о возможной вовлеченности чек-пойнт молекул, экспрессируемых на моноцитах, в патогенез хронической герпесвирусной инфекции. Так, сниженный уровень экспрессии PD-1 и Tim-3 на моноцитах может обусловить их избыточную провоспалительную активность. Ранее было показано, что вирус герпеса секретирует вещества, обладающие хемоаттрактантной активностью в отношении моноцитов и нейтрофилов, индуцирующие высвобождение активных форм кислорода из этих клеток, активирующие фагоцитоз [2]. Таким образом, при персистирующем вирусе формируется локальный участок хронического воспаления. Дефицитные по чек-пойнт молекулам моноциты могут способствовать иммунной дисрегуляции и поддержанию очага, формируется своеобразный порочный круг, участниками которого являются персистирующий вирус герпеса и иммунные клетки с избыточной провоспалительной активностью.

Как было сказано выше, уровень экспрессии PD-1 и Tim-3 на всех субпопуляциях моноцитов у больных герпесом значительно ниже, чем у доноров. В связи с этим интерес представляют данные о лучшем ответе на терапию пациентов с исходно наиболее низким количеством дубль-позитивных по PD-1 и Tim-3 пМо и нМо. Кроме того, повышения количества как экспрессии PD-1 и Tim-3, так и дубль-позитивных PD-1⁺/Tim-3⁺-моноцитов у пациентов после курса проведенной терапии зарегистрировано не было. Возможно, изменения экспрессии могут носить отсроченный характер и не проявляться непосредственно после окончания курса терапии, в связи с этим актуальным представляется исследование экспрессии ингибиторных сигнальных молекул на более поздних сроках после терапии. Выявленная нами зависимость ответа на терапию и количества дубль-позитивных PD-1⁺/Tim-3⁺ пМо и нМо носит характер тренда и требует дальнейшего подтверждения и объяснения возможной связи между экспрессией сигнальных молекул и ответом на терапию. Вместе с тем экспрессия PD-1 и Tim-3 различными субпопуляция ми моноцитов может стать одним из прогностических критериев для характера течения герпетической инфекции и ответа пациентов на терапию.

About the authors

Ivan M. Rashchupkin

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Novosibirsk

Author for correspondence.
Email: iwwwanbets@mail.ru

Research Laboratory Assistant, Laboratory of Cellular Immunotherapy

Россия, 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14

I. V. Meledina

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: iwwwanbets@mail.ru

PhD (Medicine), Allergist-Immunologist, Head of the Immunology Department, Clinic of Immunopathology

Россия, 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14

M. A. Kotova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: iwwwanbets@mail.ru

Allergist-Immunologist, Immunology Department, Clinic of Immunopathology

Россия, 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14

O. I. Zheltova

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology

Email: iwwwanbets@mail.ru

PhD (Medicine), Allergist-Immunologist, Immunology Department, Clinic of Immunopathology

Россия, 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14

References

Supplementary files