The effect of the probiotic bacteria Akkermansia Muciniphila in intestinal homeostasis and dss-induced inflammation in mice

Full Text

Введение

Akkermansia muciniphila — грамотрицательная, анаэробная бактерия, входящая в состав комменсальной микробиоты кишечника, использует муцин в качестве источника углерода и азота. Известно, что A. muciniphila оказывает иммуномодулирующее воздействие в кишечнике. Так, показано, что A. muciniphila увеличивает экспрессию белков плотных контактов в ответ на нарушение целостности эпителия, увеличивает пролиферацию стволовых клеток кишечных крипт, дифференцировку клеток Панета и бокаловидных клеток, что приводит к повышенной продукции слизи [6].

В последние годы появляется все больше данных о защитной роли A. muciniphila при нарушении обмена веществ, а также злокачественных новообразованиях, что делает эту бактерию перспективной для использования в качестве пробиотика. Однако на данный момент существуют разногласия относительно влияния A. muciniphila на воспалительные заболевания кишечника. Было установлено, что пероральное введение данного микроорганизма как в низких, так и в высоких дозах снижало тяжесть колита [1, 5, 7]. В работе Siwen Qu и соавт., 2021 введение A. muciniphila уменьшало инфильтрацию воспалительных клеток и увеличивало количество бокаловидных клеток и экспрессию Muc2 и Muc3 [5]. Rui Zhai и соавт., 2021 сообщали о защитной роли A. muciniphila в модели колита, индуцированного DSS, их данные свидетельствуют о снижении уровня провоспалительных цитокинов, таких как TNF, IL-6 и IL-1b в толстом кишечнике у мышей, принимавших A. muciniphila [9]. Однако в ряде других работ A. muciniphila усугубляла симптомы колита. Например, Chil-sung Kang и соавт., 2013 объясняют более тяжелое течение колита при приеме A. muciniphila нарушением кишечного барьера вследствие ускоренного обновления слоя слизи, при этом микробиота приобретает возможность проникать вглубь тканей кишечника и провоцировать воспаление [3].

Ранее мы показали, что A. muciniphila по-разному влияет на продукцию муцинов в кишечнике в зависимости от формы перорально вводимой бактерии — живой или пастеризованной [2]. Анализ экспериментальных протоколов приведенных работ позволяет сделать предположение, что еще одним фактором, потенциально влияю щим на результат введения, является количество вводимой бактерии — введение A. muciniphila в высоких и низких концентрациях может по-разному воздействовать на барьерные функции кишечника и либо усугублять воспаление, либо ослаблять его. В нашем исследовании мы изучали влияние высоких и низких доз A. muciniphila как на наивных мышах, с целью выявить механизмы, при помощи которых данный микроорганизм способен влиять на иммунную систему кишечника в качестве пробиотика, так и в модели острого DSS-индуцированного колита.

Материалы и методы

Животные. Мышей линии C57BL/6 в возрасте 6–9 недель содержали на базе Автономного экспериментально-биологического комплекса для временного размещения и исследования генетически модифицированных линий лабораторных мышей категории SPF при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Соглашение № 075-15-2019-1660). Все манипуляции с животными были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным Комиссией по биоэтике ИМБ РАН (Протокол № 3 от 27.10.2022).

Введение A. muciniphila. A. muciniphila выращивали в анаэробных условиях на среде с добавлением свиного муцина («Sigma») и гемина («Sigma»). Бактериальный раствор собирали в концентрации 7–8 × 10⁹ CFU/мл, делили на аликвоты по 1 мл и замораживали при –80°С. Мышей C57Bl/6 случайным образом разделяли на три группы по 12 особей, а затем ежедневно перорально вводили PBS, 10⁸ CFU A. muciniphila или 10⁹ CFU A. muciniphila в течение 2-х недель. На 14-й день каждую группу делили на две равные подгруппы, состоящие из 6 мышей. Одну подгруппу терминировали на 14-й день, а остальным мышам индуцировали острый колит.

Процессирование кишечника. Группа, получавшая A. muciniphila в течение двух недель, была умерщвлена на 14-й день с помощью шейной дислокации. Далее проводили вскрытие брюшной полости и выделяли комплекс, включавший в себя толстый кишечник и слепую кишку. Толстый кишечник и слепую кишку по отдельности промывали PBS с помощью гаважной иглы, а затем отрезали тонкую полоску ткани из каждого отдела для последующего выделения РНК.

Модель острого DSS-индуцированного колита. Индукцию острого колита у мышей осуществляли путем замены питьевой воды на 7% раствор DSS (Thermo Scientific™ Dextran Sulfate Sodium Salt, 40–50 kDa) на пятидневный срок, после чего мышам возвращали питьевую воду на три дня.

На пике заболевания на 8 день мышей умерщвляли, извлекали комплекс, состоящий из толстого кишечника и слепой кишки, а также селезенку и переносили в 6-луночный планшет с раствором PBS на лед. Селезенки взвешивали. Комплекс толстого кишечника и слепой кишки подвергали морфометрической оценке и фотографировали.

Макроскопическая оценка тяжести заболевания. В ходе проведения морфометрической оценки измеряли следующие параметры: длину толстого отдела кишечника, длину слепой кишки и тяжесть индуцированного колита. Тяжесть индуцированного колита оценивали в условных единицах измерения по шкале от 0 до 13, согласно которой 0 баллов присваивали животному без видимых признаков заболевания, а 13 — мыши с наиболее высокой степенью повреждения кишечника. Данное значение включало в себя сумму трех параметров: выраженности ректального кровотечения, также консистенции и структурированности фекалий, а также оценку максимальной потери веса.

Измерение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени. Анализ экспрессии генов проводили для групп, получавших PBS и A. muciniphila в низкой и высокой концентрациях, у которых не был индуцирован острый колит. РНК образцов толстого кишечника и слепой кишки подвергали обратной транскрипции для синтеза кДНК с использованием набора для синтеза кДНК RevertAid First Strand (Thermo, США). Измерение экспрессии генов проводили с использованием qPCRmix-HS SYBR (Евроген). Анализ экспрессии генов проводили с использованием Thermo Quant studio 6 и набора праймеров, представленных в табл.

 

Таблица. Последовательности праймеров, использованных для qRT-PCR анализа

Table. Sequences of primers used for qRT-PCR analysis

Ген Gene	Прямая последовательность Forward primer sequence	Обратная последовательность Reverse primer sequence
Actb	CTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTG	TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC
Muc1	TCGTCTATTTCCTTGCCCTG	ATTACCTGCCGAAACCTCCT
Muc2	CCCAGAAGGGACTGTGTATG	TTGTGTTCGCTCTTGGTCAG
Muc3	TGGTCAACTGCGAGAATGGA	TACGCTCTCCACCAGTTCCT
Muc4	GTCTCCCATCACGGTTCAGT	TGTCATTCCACACTCCCAGA
IL-17a	GGACTCTCCACCGCAATGA	GGCACTGAGCTTCCCAGATC
IL-17f	CCTCCCCTGGAGGATAACAC	CATGGGGAACTGGAGCGGTT
IL-22	TCCGAGGAGTCAGTGCTAAA	AGAACGTCTTCCAGGGTGAA
IL-23	CGGGACATATGAATCTACTAAGAG	GTTGTCCTTGAGTCCTTGTG
Reg3g	ATGGCTCCTATTGCTATGCC	GATGTCCTGAGGGCCTCTT
Reg3b	ATGGCTCCTATTGCTATGCC	GATGTCCTGAGGGCCTCTT
IL-22ra	GAAGGTCCGATTTCAGTCCA	TGGTCAGGTCACAGAAGAGG
IL-10	CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG	TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA

 

Статистический анализ. Статическую обработку результатов проводили в программе GraphPad Prism 6.0 при помощи t-критерия Стью дента, однопараметрического или двупараметрического дисперсионного анализа (ANOVA) для данных, соответствующих нормальному распределению. Для статистического анализа непараметрических данных в случае двух групп был использован тест Манна–Уитни, а при большем количестве групп — тест Краскела–Уолеса. Статистически достоверными считали различия между группами при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Для того, чтобы выяснить, как доза вводимой бактерии влияет на чувствительность мышей к индукции острого воспаления кишечника, мышам дикого типа ежедневно в течение двух недель с помощью желудочного зонда вводили 10⁸ CFU или 10⁹ CFU живой A. muciniphila. Контрольной группе вводили PBS.

После этого часть животных подвергали индукции острого воспаления кишечника добавлением 7% DSS в питьевую воду в течение пяти дней, и через 8 дней после индукции колита проводили морфометрическую оценку тяжести развиваемого заболевания (рис. 1A, II обложка). Оценка тяжести индуцированного колита выявила разницу в восприимчивости к заболеванию у мышей из группы, получавших высокую дозу A. muciniphila (10⁹ CFU), по сравнению с группой, получавшей низкую дозу (10⁸ CFU), и с контрольной группой (PBS). Мыши, получавшие 10⁸ CFU A. muciniphila, как и мыши из контрольной группы, демонстрировали ярко выраженное разжижение стула и ректальное кровотечение по сравнению с группой, получавшей 10⁹ CFU A. muciniphila (рис. 1Б, В, II обложка).

 

Рисунок 1. Пероральное введение A. muciniphila в дозе 10⁹ CFU защищает мышей от индукции острого колита

Figure 1. Oral administration of A. muciniphila at a dose of 10⁹ CFU protects mice from the induction of acute colitis

Примечание. А. Схема эксперимента по определению влияния A. muciniphila на чувствительность к индукции острого колита. Мышей разделяли на три группы по 12 особей, а затем ежедневно перорально вводили PBS, 10⁸ CFU A. muciniphila или 10⁹ CFU A. muciniphila в течение 2-х недель. На 14-й день 6 особей из каждой группы терминировали, из комплекса толстой и слепой кишки выделяли РНК и проводили анализ экспрессии генов. Оставшихся мышей подвергали индукции острого колита добавлением 7% DSS в питьевую воду в течение пяти дней, на 8-й день после начала индукции колита животных терминировали и проводили морфометрическую оценку тяжести заболевания. Б. Репрезентативное фото комплекса толстого кишечника и слепой кишки. В. Оценка тяжести индуцированного колита (0-13), рассчитываемая как сумма выраженности ректального кровотечения и консистенции фекалий. Г. Отношение веса селезенки к весу мыши. Д. Длина толстого кишечника. Е. Длина слепой кишки у мышей, принимавших PBS, 10⁸ CFU A. muciniphila и 10⁹ CFU A. muciniphila на 8-й день после цикла DSS. *р < 0,05, **p < 0,01, n.s. (non-significant) — недостоверная разница. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения.

Note. A. Design of experiment to determine the effect of A. muciniphila on sensitivity of acute colitis. Mice were divided into three groups of 12 and then given PBS, 10⁸ CFU A. muciniphila, or 10⁹ CFU A. muciniphila orally daily for 2 weeks. On day 14, 6 individuals from each group were sacrificed, RNA was isolated from the colon tissues, and gene expression analysis was performed. The remaining mice were subjected to the induction of acute colitis by adding 7% DSS to drinking water for five days; on the 8th day after the onset of colitis induction, the animals were sacrificed and the disease score was performed. B. Representative photo of the colon and cecum complex. C. Disease score (0-13), calculated as the sum of the severity of rectal bleeding and the consistency of feces. D. Ratio of spleen weight to mouse weight. E. Length of the large intestine. F. Length of the cecum in mice treated with PBS, 10⁸ CFU A. muciniphila, and 10⁹ CFU A. muciniphila on day 8 after the DSS cycle. *p < 0.05, **p < 0.01, n.s. (non-significant) — unreliable difference. Data are presented as mean and standard deviation.

 

Морфометрия толстого отдела кишечника и слепой кишки также свидетельствуют о защитной роли высокой дозы A. muciniphila. Известно, что в модели острого колита длина как слепой кишки, так и тонкого и толстого отделов кишечника, уменьшается. Наши измерения показывают, что при приеме низкой дозы A. muciniphila, а также в контрольной группе, длина толстого отдела кишечника и слепой кишки значительно уменьшалась по сравнению с группой, получавшей A. muciniphila в высокой дозе (рис. 1Д, Е, II обложка). Еще одним маркером системного воспаления в организме служит отношение массы селезенки к весу животного, однако значимых отличий при измерении этого параметра в трех группах мышей обнаружено не было (рис. 1Г, II обложка), что, вероятнее всего, связано с непродолжительностью действия DSS в выбранной модели. Таким образом, данные, полученные в ходе морфометрического анализа, свидетельствуют о том, что прием 10⁹ CFU A. muciniphila оказывает защитное действие в модели острого DSS-индуцированного колита.

Результаты анализа экспрессии генов в толстом кишечнике в подгруппе наивных мышей, без индукции острого колита, также свидетельствуют о защитном эффекте высокой дозы A. muciniphila. Так как один из иммуномодулирующих механизмов A. muciniphila связан с дифференцировкой клеток Панета, нами были измерены уровни экспрессии антимикробных пептидов, продуцируемых главным образом этим типом клеток. Оказалось, что прием высокой дозы бактерии (10⁹ CFU) способствовал выработке пептидов Reg3γ и Reg3β в толстой и слепой кишках (рис. 2A, III обложка). Еще один механизм, поддерживающий барьерные функции кишечника — выработка муцинов — также может подвергаться изменениям под действием муцинредуцирующей A. muciniphila. Нами было установлено, что при непродолжительном введении в течение двух недель A. muciniphila не изменяет достоверно уровень экспрессии основных муцинов в кишечнике (рис. 2Б, III обложка).

 

Рисунок 2. У мышей, принимавших A. muciniphila в высокой дозе, повышается экспрессия генов, поддерживающих барьерную функцию кишечника

Figure 2. Mice given a high dose of A. muciniphila increase the expression of genes that support intestinal barrier function

Примечание. Уровень экспрессии A) Reg3b. Reg3g, Б) Muc1, Muc2. Muc3, Muc4, В) Il17a, Il17f, Il23, Il10, Tnf, Il22, Il22ra2 относительно Actbу мышей в группах, принимавших PBS, низкую (10⁸ CFU) и высокую (10⁹ CFU) дозы A. muciniphila. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. (non-significant) — недостоверная разница. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения.

Note. Expression level of A) Reg3b. Reg3g, B) Muc1, Muc2, Muc3. Muc4, C) Il 17a. Il 177, Il23. Il10, Tnf, Il22. Il22ra2 relative to Actb in mice

in groups treated with PBS, low (10⁸ CFU) and high (10⁹ CFU) dose of A. muciniphila. *p < 0.05, **p < 0.01, n.s. (non-significant) — unreliable difference. Data are presented as mean and standard deviation.

 

Результаты ряда исследований свидетельствуют о важной роли микробиоты в поддержании баланса в кишечнике между воспалением в ответ на патогенные сигналы и толерантностью к комменсальным микроорганизмам [4, 8]. Для определения влияния A. muciniphila на регуляцию воспаления нами был измерен уровень цитокинов, продуцируемых, преимущественно, RORyt⁺ клетками — IL-17A, IL-17F, IL-23 и IL-22 (рис. 2В, III обложка). Было показано, что уровень экспрессии генов Il17a, I17f, но не Il23 и Tnf, достоверно повышался у мышей, получавших A. muciniphila в высокой дозе по сравнению с контрольной группой и группой мышей, получавших A. muciniphila в низкой дозе. IL-17A необходим для индукции IL-22, который регулирует пролиферацию стволовых клеток эпителия кишечника, выработку слизи и антимикробных пептидов. Несмотря на то, что выявить достоверную разницу в относительной экспрессии Il22 нам не удалось, на уровне тенденции количество Il22 повышалось в группе, принимавшей A. muciniphila в высокой концентрации, по сравнению с остальными группами. В то же время экспрессия гена Il22ra2, кодирующего белок-гомолог растворимого рецептора IL-22, повышалась в группе мышей, получавшей высокую дозу бактерии. Данный механизм, с одной стороны, может способствовать снижению доступного IL-22 в этой группе мышей, а с другой, дополнительно свидетельствовать о влия нии A. muciniphila на поддержание гомеостаза кишечника.

Заключение

На сегодняшний день в литературе отсутствует консенсус по поводу роли A. muciniphila в модели острого колита: одни работы демонстрируют защитную роль муцинредуцирующей A. muciniphila, в то время как другие показывают усугубление течения заболевания, опосредованное приемом этой бактерии. Полученные нами данные позволяют предположить, что пероральное введение A. muciniphila в высокой (10⁹ CFU), но не в низкой (10⁸ CFU) дозе способно защищать мышей в модели острого DSS-индуцированного колита, влияя на повышение уровня экспрессии молекул, поддерживающих барьерную функцию кишечника. Таким образом, можно предположить, что снижение воспаления кишечника, опосредованное введением A. muciniphila, может способствовать защите от колоректального рака, ассоциированного с воспалением. Тем не менее точные механизмы действия A. muciniphila на иммунитет кишечника, в том числе, в контексте воспаления и колоректального рака только предстоит установить. Большинство работ, изучающих эффекты введения этой бактерии, сосредоточено на ее влиянии на барьерные функции кишечника, а также адаптивное звено иммунного ответа. Функции же A. muciniphila в модуляции миелоидного звена иммунного ответа, а также последствия этой модуляции в контексте воспаления кишечника только предстоит установить.

About the authors

Anna D. Sheynova

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: isinfo@eimb.ru

Senior Laboratory Assistant, Laboratory of Molecular Mechanisms of Immunity, Master's Student of the Department of Immunology

Russian Federation, 119991, Moscow, Vavilova str., 32; Moscow

O. A. Podosokorskaya

Winogradsky Institute of Microbiology, Research Centre of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences

Email: isinfo@eimb.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Extremophiles Metabolism Laboratory, Winogradsky Institute of Microbiology

Russian Federation, Moscow

E. O. Gubernatorova

Winogradsky Institute of Microbiology, Research Centre of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences

Email: isinfo@eimb.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Extremophiles Metabolism Laboratory, Winogradsky Institute of Microbiology

Russian Federation, Moscow

E. O. Gubernatorova

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine

Email: isinfo@eimb.ru

PhD (Biology), Senior Researcher

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files