The course of tuberculosis infection in hyper-susceptible mice carrying the H2ᵛ haplotype

Full Text

Введение

Туберкулез (ТБ) остается важной проблемой здравоохранения. По последним опубликованным данным ВОЗ около 25% населения планеты инфицированы Mycobacterium tuberculosis (Мtb). У 5–10% инфицированных в течение жизни может развиться активная форма ТБ [10]. Восприимчивость хозяина к Mtb и тяжесть течения инфекции — это признаки со сложной и недостаточно изученной генетической регуляцией. Ответ организма хозяина на Mtb регулирует множество генов со сложными фенотипическими проявлениями [5]. Поиск конкретных генов и зависимых от них иммунных реакций, влияющих на восприимчивость к ТБ, необходим для понимания механизмов патогенеза туберкулеза и определения мишеней для терапии инфекции, а также рационального конструирования новых вакцин.

Модели туберкулезной инфекции на мышах важны для изучения генетического контроля восприимчивости к инфекции, поскольку позволяют обойти многие сложности исследования механизмов патогенеза болезни у человека. В частности, на животных гораздо проще применять прямой генетический подход, основанный на определении локализации генов, аллельные варианты которых определяют контрастные фенотипы проявлений заболевания. Носителей разных фенотипов скрещивают, и в расщепляющихся поколениях F2 или BC1 проверяют проявление интересующего фенотипа и сцепление с выбранными генетическими маркерами. Последующее получение набора рекомбинантных инбредных линий дает возможность охарактеризовать их фенотипы и определить, какая именно область генома связана с проявлением фенотипа.

Мыши линии B10.SM (H2ᵛ) проявляют очень высокую чувствительность к туберкулезной инфекции. Данная линия очень мало изучена, в частности из-за того, что в настоящее время она разводится только в виварии ФГБНУ «ЦНИИТ». Линия B10.SM имеет общую генетическую основу с линией B10 (H2ᵇ), гораздо более устойчивой к ТБ. Линии отличаются только большим участком 17-й хромосомы, включающим область МНС мыши, комплекс H2. Область H2 содержит множество генов, регулирующих иммунный ответ, важнейшими из которых можно считать классические гены класса I и II. Большое количество иммунологически активных и высокополиморфных генов в составе MHC сильно затрудняет поиск значимых аллельных вариантов, влияющих на течение ТБ.

Кроме того, в 17-й хромосоме вызывает интерес и плохо изученный Т-комплекс. Некоторые мутации в генах T-комплекса приводят к летальности эмбрионов, нарушениям эмбрионального развития хвостовой части позвоночника и стерильности самцов. Этот участок охватывает примерно треть 17-й хромосомы (35 Mb) и фланкирует область H2 с дистального участка. Из-за инверсий в Т-области возникают сложности с выведением мышей, рекомбинантных по этой части генома [3].

В области MHC вполне могут располагаться несколько генов, влияющих на течение ТБ. Во многих работах, выполненных на конгенных по области H2 линиях мышей и на разных популяциях человека, было показано участие генов МНС мыши и человека в определении уровня восприимчивости к ТБ и иммунного ответа на инфекцию [2]. Целью данной работы стала характеристика параметров иммунного ответа на инфекцию у мышей конгенных линий генотипов H2ᵛ и H2ᵇ, а также определение точных границ интервала хромосомы 17, по которому они отличаются

Материалы и методы

Экспериментальные животные. Для работы использовались инбредные линии мышей B10.SM/SnEgYCit (B10.SM, H2ᵛ) и B10/SnEgYCit (B10, H2ᵇ). Линии поддерживаются братско-сестринскими скрещиваниями в питомнике ФГБНУ «ЦНИИТ» в обычных условиях с доступом к корму и воде ad libitum. Использовались самки весом 20–22 г в начале эксперимента.

Генетическое типирование. Определение генетических полиморфизмов внутри сегмента хромосомы 17, включающего комплекс H2 и прилежащие области, проводили методом ПЦР. Определяли либо замены одного нуклеотида (SNP), либо простые полиморфизмы длин некодирующих последовательностей (SSLP, или маркеры Mit). Праймеры для определения Mit были взяты из открытой базы данных (www.jax.org). Проводилось пробное типирование мышей B10 и B10.SМ и для последующей работы отбирались те маркеры, которые давали четкие отличия между линиями по длине пробега ПЦР-продуктов в электрофорезе в 4% агарозном геле.

Культуры микобактерий, вакцинация и заражение. В работе использовали штаммы Mtb H37Rv и M. bovis BCG (Pasteur) из коллекции лаборатории иммуногенетики ФГБНУ «ЦНИИТ». Микобактерии размножали в жидкой среде Дюбо и хранили аликвотами по 10⁸ КОЕ/мл при –70°С. Подготовка культур и заражение мышей в аэрозольной камере «GlasCol» (США) описаны ранее [7, 8]. Вакцину BCG вводили однократно в дозе 5 × 10⁷ КОЕ в 0,2 мл физиологического раствора с 0,05% Tween 20, подкожно в холку.

Определение количества Mtb и BCG в органах. Cтерильно выделяли легкие и селезенки зараженных и/или вакцинированных животных, гомогенизировали в 2 мл физиологического раствора, а затем готовили серийные десятикратные разведения гомогенатов органов и высевали на чашки Петри с агаром Дюбо (Difco, США) по 50 мкл на чашку. Чашки инкубировали при 37°С, через 21 дней подсчитывали количество колоний на чашке и пересчитывали их количество на орган (КОЕ/орган).

Приготовление суспензий клеток селезенки, лимфоузлов и легких. Методика приготовления суспензий клеток детально описаны в более ранних работах из нашей лаборатории [6]. Для работы с первичными культурами клеток легкого, лимфоузлов или селезенки выделенные клетки помещали в среду для культивирования (RPMI-1640, содержащая 5% FCS, 1 mM пируват, 4 mM L-глутамат, 50 мкг/мл смеси антибиотиков стрептомицина и пеницилина, 5 × 10^–5 M β-меркаптоэтанола, 10 mM HEPES, все компоненты производства HiClone, Logan, UT, США).

Проточная цитофлуориметрия. Клеточную суспензию из легких индивидуальных мышей (1–2 × 10⁶ клеток) инкубировали 10 минут при 4°С с моноклональными антителами анти-CD16/CD32 (клон CT-17·1,17·2) для блокирования Fc-рецепторов, после чего 20 минут окрашивали моноклональными антителами анти-CD3e-FITC (BD Biosciences, клон 145-2С11), анти-CD44-PE (BioLegend, клон IM7), анти-CD8a-PerCp (BioLegend, клон 53-6.7), анти-CD62L-APC (BioLegend, клон MEL-14) и анти-CD4-Bv421 (BioLegend, клон GK1.5). Окрашенные клетки отмывали дважды и фиксировали 1% параформальдегидом, после чего анализировали на приборе BD FACSCanto II с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star). Выявляли следующие фенотипы Т-клеток: CD3⁺CD4⁺, активированные — CD3⁺ CD4⁺CD44^highCD62L^low, неактивированые — CD3⁺CD4⁺CD44^lowCD62L^high [6].

Внутриклеточное окрашивание цитокинов антителами. 1,5 × 10⁶ клеток легких инкубировали в присутствии убитых ультрафиолетом Mtb 72 часа, а затем на последние 12 часов добавляли блокатор аппарата Гольджи GolgiPlug (1 μg/ml; BD Biosciences). После отмывки у клеток легкого окрашивали поверхностные антигены антителами анти-CD4- и анти-CD8a-PerCp. Окрашивание цитокинов в клетках проводили с использованием набора Cytofix/Cytoperm kit (BD Biosciences) антителами анти-IFNγ-APC (BD Biosciences, клон XMG1.2) с соблюдением рекомендаций фирмы производителя.

Анализ продукции IFNγ проводили в супернатантах культур клеток селезенки, лимфоузлов или легких после 72-часовой инкубации при 37°С и 5% СО₂ методом ELISA с использованием набора DuoSet ELISA Development kit (R&D, DY485) с соблюдением рекомендаций фирмы производителя.

Приготовление гистологических срезов и окрашивание препаратов. Для определения степени воспаления и других патологических изменений в легких у исследуемых мышей среднюю долю правого легкого замораживали в режиме температурного градиента от –60°C до –20°C в течение 10 минут в электронном криотоме (ThermoShandon, Великобритания). Получали срезы толщиной 8–10 мкм. Срезы высушивали на воздухе, фиксировали в этаноле и окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc.) по методам корреляционного и вариационного анализа (ANOVA) и критерия Манна–Уитни. Достоверными считали различия при p < 0,05.

Результаты

По старым данным, приведенным в монографиях по биологии МНС, мыши B10.SM отличаются от мышей B10 только участком 17-й хромосомы, несущим комплекс H2. Однако эта линия была выведена во времена, когда генетическое картирование проводилось по отторжению трансплантатов кожи и было очень неточным [9]. Поэтому для выполнения задач исследования необходимо было в первую очередь точно определить границы перенесенного на генетическую основу B10 участка генома в миллионах пар оснований (Mbp) с помощью методов современного генетического типирования.

 

Таблица. Список маркеров Mit, которые давали продукт, имеющий отличие у линий B10 и B10.SM по весу, а значит отличающийся по набору последовательности нуклеотидов

Table. Mit markers list with different weights of PCR products between strains of mice B10 and B10.SM

Маркеры Mit markers	Геномная позиция на 17  хромосоме в миллионах  пар оснований/ Genomic position on 17  chromosome in millions of base pairs
D17Mit164	3,97
D17Brg125	4,33
D17Mit172	6,14
D17Mit195	7,24
D17Mit133	24,99
D17Mit198	27,79
D17Mit16	33,6
D17Dcr4	33,737
D17Mit62	33,874
D17Mit82	33,81
D17Dcr6	34,75
D17Mit28	34
D17Mit13	35,298
D17Mit47	36,35
D17Mit148	36,94
D17Mit234	38,66
D17Mit263	41,22
D17Mit11	22 сМ*
D17Mit49	44,77
D17Mit177	48,02
D17Mit87	54,88
D17Mit152	65,24
D17Mit141	73,8
D17Mit244	91,16

 

Размер участка H2ᵛ был определен с помощью маркеров Mit, отличающих аллельные варианты H2ᵇ и H2ᵛ (см. табл.). Было показано, что линии B10 и B10.SM отличаются по очень большому, содержащему сотни генов участку 17-й хромосомы размером более 70 млн пар оснований, включающему область H2 (рис. 1А).

 

Рисунок 1. Отличия между линиями мышей B10 и B10.SM

Figure 1. Differences between the B10 and B10.SM mouse strains

Примечание. (А) Участок гаплотипа H2ᵛ (серый) на генетической основе гаплотипа Н2 ^b (черный) 17-й хромосомы, определенный с помощью метода ПЦР-анализа с набором маркеров Mit. Кривые выживания мышей двух линий после заражения Mtb в дозе 600 (Б) и 100 (В) КОЕ через респираторный тракт. Размножение Mtb в легких после заражения высокой (Г) и низкой (Е) дозой. Продукция IFNγ клетками легкого мышей, зараженных высокой (Д) и низкой (Ж) дозой возбудителя, после стимуляции in vitro полиантигеном Mtb. *, **, **** = p < 0.05, p < 0.01 и p < 0.0001 соответственно.

Note. (A) Mice B10.SM carry region of H2ᵛ (gray color) haplotype on H2ᵇ background (black color) of 17 chromosome determined using PCR analysis with Mit markers. Survival curves of strains B10.SM and B10 after aerosol Mtb infection with dose of 600 (B) and 100 (C) CFU. Reproduction of Mtb in the lungs after high (D) and low (F) dose infection. Production of IFNγ by lung cells of mice infected with a high (E) and low (G) dose of the pathogen after stimulation in vitro with Mtb poly-antigen. *, **, **** = p < 0.05, p < 0.01 and p < 0.0001, respectively.

 

Высокий уровень восприимчивости к ТБ мышей B10.SM проявляется в сильно сокращенном сроке выживания после заражения двумя разными дозами Mtb по сравнению с мышами B10 (рис. 2Б, В) и достоверно более высоком уровне размножения микобактерий в легких (рис. 2Г, Е). Примечательно, что специфическая (стимулированная антигенами возбудителя) продукция клетками легкого зараженных мышей двух линий IFNγ, то есть основного цитокина обеспечивающего активацию зараженных макрофагов и уничтожение внутриклеточных микобактерий [4], оказалась достоверно выше у более резистентных мышей B10, несмотря на меньшее количество микобактерий в их легких (рис. 2Д, Ж)

 

Рисунок 2. Количество и уровень активации Т-клеток CD4⁺ у мышей двух линий после заражения и ответ на вакцинацию BCG мышей B10.SM

Figure 2. Communication between the number and level of activation of CD4⁺ T cells with the susceptibility of mice strain B10.SM, and response to BCG vaccination

Примечание. Общий процент (А), доля активированных (Б) количество продуцентов IFNγ среди Т-клеток CD4⁺ (В) и общая секреция всеми клетками легких IFNγ in vitro (Г) после заражения туберкулезом. (Д) — количество Mtb в легких у мышей после вакцинации и последующего заражения H37Rv в дозе 600 КОЕ/мышь; (Е) — кривая выживаемости мышей после вакцинации и последующего заражения; (Ж) — патология легких у вакцинированных и невакцинированных животных после заражения, окрашивание гематоксилином-эозином, увеличение ×25.

Note. Total percentage CD4⁺ by all lung cells (A), proportion activated T-cells (B), number of IFNγ producers among CD4⁺ T cells (C) and total secretion of IFNγ by all lung cells in vitro (D) after tuberculosis infection. (E) — the number of Mtb in the lungs of mice after vaccination and subsequent infection with H37Rv at a dose of 600 CFU/mouse; (F) — survival curve of mice after vaccination and subsequent infection; (G) — pathology of the lungs in vaccinated and unvaccinated animals after infection, staining with hematoxylin-eosin, magnification ×25.

 

Рисунок 3. Промежуточная восприимчивость к инфекции гибридов (B10.SM x B10) F1 и F2

Figure 3. Intermediate susceptibility to infection of hybrids (B10.SM x B10) F1 and F2

Примечание. (А) — кривые выживания после заражения дозой 600 КОЕ/мышь. (Б) — Размножение Mtb в легких. (В) — Специфическая продукция IFNγ клетками легких. (Г) — картина неполного доминирования при сегрегационном генетическом анализе гибридов F2.

Note. (A) — survival curves after infection with a dose of 600 CFU/mouse. (B) — reproduction of Mtb in the lungs. (C) — Specific production of IFNγ by lung cells. (D) — segregation genetic analysis of F2 hybrids.

 

Анализ клеточного состава легкого после заражения показал, что общая инфильтрация органа Т-клетками CD4⁺ была выше у мышей B10.SM, но процент активированных клеток с фенотипом CD44⁺CD62L^– в этой популяции оказался достоверно ниже, чем у мышей линии B10 (рис. 2А, Б). Такая же разница выявилась по количеству Т-клеток CD4⁺, продуцирующих IFNγ (внутриклеточное окрашивание, рис. 2В), что соответствует картине общей продукции этого цитокина (рис. 2Г). Разницы по количеству и уровню активации других типов клеток иммунной системы (Т-лимфоцитов CD8⁺, В-лимфоцитов CD19⁺, нейтрофилов Ly-6G⁺ и макрофагов F4/80⁺) нами найдено не было.

Мыши конгенных по H2 линий отличаются не только по тяжести течения первичного ТБ, но и по эффективности вакцинации BCG, причем между этими параметрами не всегда наблюдается корреляция [1]. Для более полного описания фенотипа мышей B10.SM мы провели вакцинацию этих мышей и через 5 недель заразили вакцинированных и невакцинированных животных. По кривой выживаемости, количеству микобактерий в легких и картине патологии оказалось, что вакцинация BCG вполне эффективна (рис. 2Д-Ж). У предварительно вакцинированных животных достоверно снизилось размножение микобактерий в легких (рис. 2Д) и повысилось время выживания (рис. 2Е). У невакцинированных мышей наблюдалось диффузное воспаление легочной ткани, тогда как у вакцинированных мышей очаги воспаления были более четко отделены от здоровой ткани (рис. 2Ж). Таким образом, сверхвысокая чувствительность мышей B10.SM к Mtb не мешает эффективности иммунного ответа на вакцину BCG.

Для последующей работы по сужению генетического интервала, определяющего высокую восприимчивость к инфекции, и началу поиска генов-кандидатов, важно было выяснить тип наследования высокой чувствительности к ТБ. С этой целью мы получили гибридов, между двумя линиями. У гибридов (B10 x B10.SM) F1 наблюдается промежуточный фенотип по выживаемости (рис. 2А), размножению Mtb в легких (рис. 2Б) и продукции IFNγ (рис. 2В), что соответствует наследованию по типу неполного, или промежуточного, доминирования. Такая картина наследования не характерна для генов МНС класса I и II, для которых чаще всего наблюдается кодоминирование.

Более надежным источником данных о типе наследования являются гибриды F2. Получив таких гибридов, мы провели генетическое типирование на носительство генотипов H2ᵛ^/ᵛ, H2ᵛ^/ᵇ и H2ᵇ^/ᵇ и заразили животных Mtb. Среднее время выживания мышей с генотипом H2ᵛ^/ᵛ не отличалось от мышей родительской линии B10.SM, гибриды с гетерозиготным вариантом имели промежуточный фенотип, а носители генотипа H2ᵇ^/ᵇ не отличались от мышей B10 (рис. 2Г). Таким образом, наследование резистентности по типу промежуточного доминирования было подтверждено сегрегационным анализом (рис. 2Г).

Обсуждение

Мы получили подробную картину фенотипов мышей линии B10.SM ,с мало изученным, гаплотипом H-2ᵛ в отношении тяжести течения ТБ. Помимо фенотипов мы смогли уточнить размер участка гаплотипа H-2ᵛ, который был перенесен на генетическую основу линии мышей B10 в период выведения линии B10.SM. Область поиска гена-кандидата составляет чуть больше 70 млн пар оснований. Новые рекомбинантные линии, выведением которых мы занимаемся в настоящее время, дадут нам возможность сократить участок поиска генов на 17-й хромосоме и соотнести их с фенотипическими проявления ми. Следующим этапом станет поиск генов-кандидатов и определение того, какие регуляторные пути нарушены у сверхчувствительных к ТБ рекомбинантных конгенных мышей.

About the authors

P. G. Baikuzina

Central TB Research Institute; Skolkovo Institute of Science and Technology

Email: mkorotetskaya@gmail.com

Research Assistant, Laboratory for Immunogenetics, Department of Immunology, Technician

Россия, 107564, Moscow, Yauzskaya avenue, 2; Moscow

D. V. Gorbacheva

Central TB Research Institute; Skolkovo Institute of Science and Technology

Email: mkorotetskaya@gmail.com

Research Assistant, Laboratory for Immunogenetics, Department of Immunology, Moscow Undergraduate Student, Faculty of Bioengineering and Bioinformatics

Россия, 107564, Moscow, Yauzskaya avenue, 2; Moscow

A. S. Apt

Central TB Research Institute

Email: mkorotetskaya@gmail.com

DSc (Biology), Professor, Head of the Laboratory of Immunogenetics, Immunology Department

Россия, 107564, Moscow, Yauzskaya avenue, 2

Mariya V. Korotetskaya

Central TB Research Institute; M.V. Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: mkorotetskaya@gmail.com

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Immunogenetics, Department of Immunology, Lecturer, Department of Bioengineering and Bioinformatics

Россия, 107564, Moscow, Yauzskaya avenue, 2; Moscow

References

Supplementary files