Impact of Tritrichomonas spp. on the immune system of Muc2^–/– mice after antibiotic therapy

Full Text

Введение

В кишечнике млекопитающих обитает широкий консорциум микроорганизмов: различные типы вирусов, прокариотические бактерии и эукариотические микроорганизмы, включающих множество грибов, гельминтов и простейших. Трихомонады относятся к типу Parabasalia, классу Trichomonadea, отряду Trichomonadida [1]. Эти простейшие живут в анаэробно-микроаэрофильных, покрытых слизистой оболочкой, нестерильных полостях органов, таких как желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и репродуктивные пути. Как и у большинства анаэробных простейших, у трихомонад отсутствуют многие собственные пути биосинтеза, и для выживания они используют метаболиты, которые нарабатывают клетки хозяина. Инфекция, связанная с трихомонадами, является рецидивирующей, без стойкого иммунитета, часто бессимптомной. Трихомонады паразитируют путем адгезии к эпителиальным клеткам репродуктивных путей или ЖКТ. Известно, что некоторые представители Lactobacillus spp. препятствуют адгезии трихомонад к эпителиальным клеткам, а некоторые представители, наоборот, способствуют [6]. Однако влияние этих видов на организм хозяина и их потенциальный вклад в иммунный гомеостаз слизистой кишечника остаются малоизученными. Ранее было показано, что ближайшим человеческим ортологом трихомонады мышей (Tritrichomonas spp.) является трихомонада Dientamoeba fragilis, которая способна вызывать симптомы воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) [9]. В настоящее время нет достоверной информации являются ли Dientamoeba fragilis и другие виды протистов, такие как Enteromonas spp., Entamoeba dispar, патогенными возбудителями заболеваний кишечного тракта человека или комменсалами. Новые данные о влиянии Tritrichomonas spp. на микробиоту ЖКТ и иммунную систему у мышей могут быть использованы для понимания взаимоотношений хозяина и простейших у человека. Вовлечение в понимание этих взаимодействий представителей нормальной микробиоты Lactobaccilus johnsonii, которые известно, что препятствуют адгезии трихомонад к эпителиальным клеткам, поможет оценить их вклад в активацию иммунитета. В последующем влияние комменсалов простейших на формирование защитных механизмов в слизистой оболочке необходимо будет учитывать при определении терапевтических схем лечения ВЗК.

Материалы и методы

Восьминедельных мышей Muс2^–/– содержали в индивидуально вентилируемых клетках (Optimice, США) с постоянным доступом к пище и воде при 22–25°C с 14 ч:10 ч циклом свет-темнота (световая фаза с 1:00 до 15:00). Все животные получали нестерилизованный стандартный рацион для грызунов (Р-22, БиоПро, Новосибирск), питьевую воду. После недели акклиматизации мыши были разделены на 2 группы (в среднем по 5 животных в группе), каждая группа получала коктейль антибиотиков в течение 14 дней. Коктейль антибиотиков готовили в питьевой воде с концентрацией: гентамицин 0,5 г/л, амоксицилин 0,5 г/л, ванкомицин 1 г/л и метронидазол 0,5 г/л. После завершения курса антибиотикотерапии экспериментальная группа получала L. johnsonii (10⁸ КОЕ/мышь) внутрижелудочно три раза в неделю в течение трех недель. Группа мышей без подселения пробио тических микроорганизмов (самовосстановление), также получавшая коктейль антибиотиков, далее получала воду. Анализ фенотипа лимфоцитов проводили с помощью проточной цитометрии. Клетки выделяли из селезенки и лимфоузлов с помощью сита для клеток, промывали PBS, для анализа брали 1 × 10⁵ клеток. Клетки крови обрабатывали буфером, лизирующим эритроциты, промывали PBS. Макрофаги выделяли из перитонеальной полости животных. После этого клетки метили моноклональными антителами, конъюгированными с флуорохромами, к поверхностным антигенам (BioLegend, США) в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Для анализа клеток использовали антитела анти-CD45-Pacific Blue анти-CD3-PE анти-CD4-FITC анти-CD8-PE/Cyanine7 анти-CD19-FITC анти-CD45RB-PE анти-CD25-PerCP/Cyanine5.5 анти-Foxp3-APC анти-CD38-PE/Cyanine7 анти-CD209-PE анти-Arg-APC анти-INOS-PE. Клетки промывали PBS и анализировали на проточном цитометре FACS Canto II (Becton Dickinson, США).

Для выделения простейших из фекалий использовали следующий протокол: свежесоб ранные фекалии от мышей помещали в 5 мл холодного раствора PBS, тщательно фильтровали (70 мкм), затем центрифугировали в течение 5 минут при 1200 rpm +4°С и промывали холодным PBS. Далее образец наносили на градиент (Percoll 40%/80%) и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. После отбирали содержимое интерфазы, отмывали два раза холодным PBS, микроскопировали с помощью метода «живая капля».

Данные в тексте представлены в виде средних±SEM. Анализ выполняли с помощью статистики в Past 4.15. Выборки данных сравнивали между группами с помощью One-way PERMANOVA. Значение p < 0,05 считалось значимым.

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что антибиотико терапия приводит к увеличению количества Tri trichomonas spp. наряду с уменьшением бактерий в кишечнике мышей с мутацией в гене Muc2 [2]. При этом у таких животных снижался уровень Lactobacillus spp. в ЖКТ. В настоящей работе анализ фекалий интактных мышей линии Muс2^–/^– показал, что у 100% животных в фекалиях была обнаружена трихомонада Tritrichomonas spp. Для оценки иммунологического статуса мышей Muc2^–/–, в фекалиях которых была обнаружена Tritrichomonas spp., были сформированы две группы мышей (n = 4–5 голов). В течение двух недель мыши обеих групп получали коктейль из антибиотиков в питьевой воде. После проведения антибиотикотерапии мышам первой группы подселяли пробиотический штамм L. johnsonii (10⁸ КОЕ/мышь), который ранее был выделен и охарактеризован от мышей дикого типа (С57BL/6) без признаков воспаления и наличия у них Tritrichomonas spp. Мышам второй группы не подселяли пробиотические микроорганизмы (самовосстановление). Через две недели после отмены антибиотиков Tritrichomonas spp. была обнаружена у всех животных в группе самовосстановления микробиоты. Интересно, что у мышей, получавших L. johnsonii, протозойная инфекция при микроскопическом методе исследования не выявлялась на протяжении всего периода подселения пробиотиков. Полученные данные позволяют предположить, что пробиотические бактерии сдерживают развитие протозойных инфекций по сравнению с группой самовосстановления. Известно, что лактобактерии используют как молекулы широкого спектра действия (например, молочную кислоту), так и патоген-специфические молекулы, ингибирующие патогены [8]. Также ингибирующую активность штаммов Lactobacillus против Trichomonas vaginalis обнаружили Ниха Фукан с соавт. [7]. Было показано, что фактор, способствующий агрегации (APF-2) штамма Lactobacillus gasseri, в значительной степени способствует ингибированию адгезии Trichomonas vaginalis к эктоцервикальным клеткам человека. Также, известно, что лактобактерии снижают адгезию Trichomonas vaginalis, к эпителиальным клеткам хозяина на 60% [6]. Два штамма L. johnsonii снижали адгезивную способность Trichomonas vaginalis к эктоцервикальным клеткам. Пробиотические штаммы Lactobacillus могут влиять на патоген напрямую, препятствуя прикреплению или инвазии клетки-хозяина, либо косвенно, регулируя экспрессию цитокинов, синтез муцина в слизистой оболочке хозяина. Таким образом, наблюдение о том, что штаммы Lactobacillus способны ингибировать развитие протозойной инфекции подтверждает полученные нами данные.

 

Рисунок. А. Процент разных популяций лимфоцитов (CD45⁺CD19⁺, CD45⁺CD3⁺, CD45⁺CD3⁺CD8⁺, CD45⁺CD3⁺CD4⁺) крови, селезенки и мезентериальных лимфатических узлов мышей после самовосстановления микробиоты (AB) и при применении пробиотического штамма L. johnsonii (Lact). *, *** — p < 0,05, p < 0,001 межгрупповое сравнение One-way PERMANOVA test. Б. Tritrichomonas spp. в живой капле, выделенная из кишечника мышей Muc2^–/– (указана стрелками)

Figure. A. Percentage of different lymphocyte populations (CD45⁺CD19⁺, CD45⁺CD3⁺, CD45⁺CD3⁺CD8⁺, CD45⁺CD3⁺CD4⁺) in the blood, spleen and mesenteric lymph nodes of mice after microbiota self-healing (AB) and using the probiotic strain L. johnsonii (Lact). *, *** — p < 0.05, p < 0.001 intergroup comparison One-way PERMANOVA test. B. Tritrichomonas spp. in a live drop isolated from the intestines of Muc2^–/– mice (indicated by arrows)

 

Конститутивная микробиота протистов является неотъемлемой частью микробиома позвоночных. Влияние Tritrichomonas spp. на иммунную систему хозяина в настоящее время недостаточно изучено. В данной работе было проведено исследование влияния трихомонады Tritrichomonas spp. на иммунную систему мышей Muc2^–/–, получавших L. johnsonii (внутрижелудочно) и мышей без подселения пробиотических микроорганизмов (самовосстановление). После отмены антибиотиков у всех животных в группе самовосстановления микробиоты была обнаружена Tritrichomonas spp. Однако в этой группе мышей процент CD4⁺CD45RB^high Т-клеток, способных индуцировать хроническое воспаление кишечника [10] достоверно не отличался от процента таких же клеток у неинфицированных мышей в группе, получавших пробиотический штамм L. johnsonii. Процент перитонеальных макрофагов М1 типа (CD38⁺; iNOS⁺) и М² типа (CD209⁺; Arg⁺) также не отличался между исследуемыми группами. Этот факт свидетельствует об отсутствии развития острой воспалительной реакции в группе самовосстановления мышей Muc2^–/– в фекалиях, которых была обнаружена трихомонада. Таким образом, можно предположить, что Tritrichomonas spp. не вызывает развития воспалительной реакции и скорее всего является условно патогенной. Полученные нами данные совпадают с результатами, представленными в книге Baker [3].

Анализ содержания разных популяций лимфоцитов в крови, селезенке и мезентеральных лимфатических узлах у мышей в группах с подселением L. johnsonii после антибиотикотерапии и самовосстановления микробиоты представлен на рис. Процент Т-лимфоцитов в крови и селезенке был достоверно выше в группе, которая получала пробиотический штамм L. johnsonii в течение трех недель после антибиотикотерапии, по сравнению с группой мышей Muc2^–/–, с восстановлением микробиоты без применения пробиотиков. В крови процент B-клеток был достоверно ниже в группе с подселением пробиотического штамма L. johnsonii и отсутствием Tritrichomonas spp. относительно мышей, у которых на протяжении всего периода самовосстановления микробиоты в фекалиях детектировали Tritrichomo8nas spp. Таким образом, заселение лактобактерий, которые препятствуют развитию трихомонад в ЖКТ, способствует повышению процента Т-лимфоцитов и снижению B-лимфоцитов. Хорошо известно, что лимфоциты мигрируют из селезенки в региональные лимфатические узлы, где они активируются. Было проведено сравнение профиля иммунных клеток в мезентеральных лимфатических узлах у мышей Muc2^–/– двух групп. Мышей линии Muc2^–/–, которые получали пробиотический штамм L. johnsonii и не имели Tritrichomonas spp. в фекалиях, в лимфоузлах наблюдался больший процент Т-хелперов по сравнению с животными с самовосстановлением микробиоты. Несмотря на это, достоверных различий по проценту цитотоксических Т-клеток в лимфоузлах между группами мышей носителями Tritrichomonas spp. и без Tritrichomonas spp. обнаружено не было. Это подтверждает отсутствие активации провоспалительной реакции в ответ на восстановление микробиоты вместе с Tritrichomonas spp. у мышей с нарушением барьерного слоя кишечника (мышей Muc2^–/–). Ранее было показано, что Tritrichomonas musculus активируют эпителиальные клетки, которые, стимулируя посредством интерлейкина-18 дендритные клетки, способствуют развитию Т-хелперов 1 и 17 типа иммунного ответа. Такой механизм обеспечивает формирование эффективной защиты от бактериальных инфекций [5]. Ранее, в экспериментах in vitro мы показали, что L. johnsonii способна стимулировать активацию дендритных клеток [4]. Чтобы исключить эффект антибиотикотерапии и подтвердить влияние Tritrichomonas spp. на изменение процента Т-хелперов в мезентеральных лимфатических узлах, была проанализирована популяция клеток лимфоузлов интактных мышей Muc2^–/–, среди которых 75% особей имели Tritrichomonas spp. Процент цитотоксических клеток мышей этой группы составил 46,9±5,2, что достоверно не отличается от группы с самовосстанавливающейся микробиотой. Процент хелперных Т-клеток был 41,1±4,2 в группе интактных мышей и не отличался от процента клеток мышей из группы самовосстановления.

Итак, можно предположить, что выявляемая у мышей Tritrichomonas spp. может быть условно-патогенной. Восстановление микробиоты совместно с Tritrichomonas spp. не вызывает развитие острой воспалительной реакции и даже не влияет на другие популяции лимфоцитов. В свою очередь добавление пробиотического штамма L. johnsonii повышает процент Т-клеток в крови и селезенке и увеличивает процент Т-хелперов в региональных лимфатических узлах у мышей с нарушенной барьерной функцией из-за отсутствия муцина-2. Требуется проведение дополнительных экспериментов для изучения механизма действия условно-патогенных протозоа на иммунитет слизистого слоя кишечника человека. В последующем необходимо будет учитывать такое влияние простейших на иммунитет при определении терапевтических схем лечения ВЗК.

About the authors

E. P. Goncharova

Center for Technological Excellence, Novosibirsk State Technical University

Email: betsvd.bio@gmail.com

PhD (Biology), Junior Researcher, Center for Technological Excellence

Россия, 630073, Novosibirsk, K. Marx pr., 20

Victoria D. Bets

Center for Technological Excellence, Novosibirsk State Technical University

Author for correspondence.
Email: betsvd.bio@gmail.com

Junior Researcher, Center for Technological Excellence

Россия, 630073, Novosibirsk, K. Marx pr., 20

Yu. S. Makusheva

Center for Technological Excellence, Novosibirsk State Technical University

Email: betsvd.bio@gmail.com

Junior Researcher, Integration laboratory "Bioengineering"

Россия, 630073, Novosibirsk, K. Marx pr., 20

E. A. Litvinova

Center for Technological Excellence, Novosibirsk State Technical University

Email: betsvd.bio@gmail.com

PhD (Biology), Researcher, Center for Technological Excellence

Россия, 630073, Novosibirsk, K. Marx pr., 20

References

Supplementary files