Neutrophil extracellular traps as markers of infectious and aseptic inflammation

Full Text

Введение

В настоящее время одной из важных проблем медицины является поиск новых объективных и достоверных, но при этом легко выявляемых маркеров воспаления, которые бы позволили определить природу флогогенного фактора и тип воспалительного процесса для выбора правильной тактики лечения, оценки эффективности противовоспалительной терапии, обоснования необходимости хирургического вмешательства, определения прогноза заболевания.

Надежность обнаружения маркера воспаления может определяться его вовлеченностью в ключевые процессы запуска защитных реакций врожденного иммунитета. Таким наиболее ранним и принципиальным процессом является реакция нейтрофилов на поступающие в организм патогены или на повреждение собственных тканей.

Нейтрофилы формируют нейтрофильные экстраклеточные ловушки (НЭЛ, NETs) при поступлении в организм патогенов различной природы, в первую очередь инфекционных (бактерий, вирусов), а также в ответ на поврежденные структуры собственного организма.

Несмотря на большое количество исследований, посвященных НЭЛ, морфологические варианты этих внеклеточных структур нейтрофилов еще не охарактеризованы. В наших исследованиях описаны несколько вариантов НЭЛ, которые могут быть связаны с типом воспалительного процесса.

Цель — определение специфических маркеров инфекционного и асептического воспаления на основе анализа морфологических вариантов нейтрофильных экстраклеточных ловушек.

Материалы и методы

Пациенты

В исследование включены 26 больных, находящихся на лечении в 51 ГКБ г. Москвы с различными нозологическими формами воспалительного процесса в брюшной полости (12 больных с острым аппендицитом, 8 больных с острым холециститом, 6 больных с диагнозом «панкреатит/панкреонекроз») после проведенного хирургического вмешательства. В исследование были включены также 20 больных с пост ковидом и группа из 10 волонтеров, считавших себя здоровыми, но при этом имевших контакты с заболевшими гриппом.

Методы

Получение клеточных фракций нейтрофилов. Для взятия проб крови использовали вакутайнер с ЭДТА для предотвращения свертывания. Выделение нейтрофилов из венозной крови, обработанной ЭДТА, проводили традиционным методом с помощью градиентного центрифугирования. Для этого кровь разводили в 4 раза нат рий-фосфатным буферным раствором 50 мM, рН 7,4 и наслаивали на двойной градиент плотности фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,077 г/см³, а нижнего — 1,190 г/см³. После центрифугирования (1600 об/мин, 30 мин) на границе между градиентами возникает скопление нейтрофилов с чистотой 98–100%. Нейтрофилы дважды отмывали от примесей фиколла натрий-фосфатным буферным раствором (50 мМ, рН 7,4). Осаждение клеток крови проводили при центрифугировании (1200 об/мин, 15 мин). Выделенные нейтрофилы в среде RPMI-1640 использовали в экспериментах по кратковременному культивированию. Жизнеспособность выделенных нейтрофилов составляла не менее 95% (тест с 0,1%-ным раствором трипанового синего).

Иммунофлюоресцентное определение нейтрофильных экстраклеточных ловушек. Для обнаружения и подсчета нейтрофильных экстраклеточных ловушек использовали флюоресцентную микроскопию [2]. Выявление нейтрофильных экстраклеточных ловушек осуществляли с использованием флюоресцентного красителя SYBR Green (ЗАО «Евроген», Россия), специфично взаимодействующего с двухцепочечной ДНК. Микроскопирование, подсчет и фоторегистрацию клеток и экстраклеточных структур проводили при увеличении ×1000. Результаты выражали в процентах, в виде отношения количества экстраклеточных ловушек к общему числу клеток в поле зрения.

Статистическая обработка. Полученные результаты обрабатывали в программе Statistica 12.0 (StatSoft, Inc., США). Данные представлены в виде среднего значения (М) ± стандартная ошибка среднего (m). Сравнение количественных признаков проводили по ранговому U-критерию Манна–Уитни и данным дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при значениях p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Маркеры инфекционного воспаления

Качественный анализ НЭЛ у больных с воспалительными заболеваниями дает возможность выявить характерные морфологические признаки НЭЛ при воспалении инфекционного генеза.

В настоящее время морфологические формы нейтрофильных экстраклеточных ловушек и их функциональная активность при воспалительных заболеваниях практически не исследованы. В наших исследованиях мы определили 4 главные морфологические формы нейтрофильных ловушек — нейтрофильные сети, одиночные нити, волокна и вуали, из которых функционально активной, то есть способной захватывать и связывать патогены, обладает только одна экстраклеточная структура — сетевидная. Нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме нейтрофильных сетей нами были обнаружены в крови у хирургических больных с диагнозом «острый аппендицит», имеющих благоприятный характер течения заболевания и послеоперационного периода. Причем обследованные больные никаких других аномальных форм (нитей, волокон и вуалей) нейтрофильных экстраклеточных ловушек не имели.

В группе волонтеров, не имеющих никаких клинических проявлений заболевания гриппом, но находящихся в постоянном контакте с заболевшими, нами также были обнаружены нейтрофильные сети при полном отсутствии аномальных форм НЭЛ. Найденные морфологические формы НЭЛ у больных из отделения абдоминальной хирургии и у не заболевших гриппом волонтеров суммированы в табл. 1.

 

Таблица 1. Количество и морфологические формы нейтрофильных экстраклеточных ловушек (НЭЛ) у больных с острым аппендицитом с благоприятным течением и инфицированных вирусом гриппа волонтеров, но без клинической симптоматики

Table 1. Morphological forms of neutrophil extracellular traps (NETs) in patients with acute appendicitis with a favorable course and infected with influenza virus volunteers, but without obvious symptoms

Группы пациентов Groups of patients	Количество НЭЛ, % The number of NETs, %	Морфологические формы НЭЛ Morphological forms of NETs
		Сети Web-like structures	Одиночные нити Single filaments	Волокна Fibers	Вуали Clouds
Острый аппендицит, неосложненный Acute appendicitis, uncomplicated (n = 6)	10,19±0,73	++++	–	–	–
Инфицированные вирусом гриппа, но не заболевшие волонтеры Infected with the flu virus, but not sick volunteers (n = 10)	8,58±0,51	++++	–	–	–

Примечание. ++++ — значительное количество нейтрофильных экстраклеточных структур; + — минимальное (менее 10% от общего количества) нейтрофильных экстраклеточных структур.

Note. ++++ — a significant number of neutrophil extracellular structures; + — minimum (less than 10% of the total) neutrophil extracellular structures.

 

Необходимо отметить, что нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме нейтрофильных сетей, найденные у этих двух групп обследованных хирургических больных и инфицированных волонтеров, обладали чрезвычайно высокой функциональной активностью нейтрофильных сетей.

Сопоставление этих результатов показывает, что нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме нейтрофильных сетей могут быть маркерами инфекционного воспаления.

Данные других исследователей подтверждают наши наблюдения о том, что нейтрофильные сети характерны для острого инфекционного процесса в организме [6, 10].

Осложненные формы абдоминального воспаления — разнообразие морфологических типов НЭЛ

Исследование нейтрофильных экстраклеточных ловушек у больных с различными нозологическими формами воспалительного процесса показывает, что помимо нейтрофильных сетей у части хирургических больных обнаруживаются НЭЛ в морфологической форме одиночных нитей. Так, у всех больных с аппендицитом, осложненным абсцессом брюшной полости, помимо нейтрофильных сетей были найдены нейтрофильные экстраклеточные структуры в форме одиночных нитей. Такие нейтрофильные экстраклеточные структуры в форме одиночных нитей обнаруживались также и у части больных с холециститом и панкреатитом (табл. 2).

 

Таблица 2. Количество и морфологические формы НЭЛ у больных с различными нозологическими формами воспалительного процесса в брюшной полости и у больных с постковидным синдромом

Table 2. Morphological forms of NETs in patients with various nosological forms of the inflammatory process in the abdominal cavity and in patients with post-COVID syndrome

Группы больных Groups of patients	Количество НЭЛ, % The number of NETs, %	Морфологические формы НЭЛ Morphological forms of NETs
		Сети Web-like structures	Одиночные нити Single filaments	Волокна Fibers	Вуали Clouds
Острый аппендицит, осложненный абсцессом брюшной полости Acute appendicitis complicated by abdominal abscess (n = 6)	13,26±0,95	+++	+	+	+
Острый холецистит Acute cholecystitis (n = 8)	15,66±2,81	++	+	+	–
Острый панкреатит/панкреонекроз Acute pancreatitis/pancreonecrosis (n = 6)	12,64±2,73	+	+	+	+
Постковид Post-COVID (n = 20)	6,55±0,94	–	+	–	–

Примечание. См. примечание к табл. 1.

Note. As for Table 1.

 

Необходимо отметить, что у всех больных с абдоминальным воспалением, осложненным абсцессом брюшной полости, помимо нейтрофильных сетей регистрировали также и аномальные формы НЭЛ, в частности НЭЛ в морфологической форме одиночных нитей.

Группа больных с постковидным синдромом, выбранная в пределах настоящего исследования как группа сравнения, демонстрирует абсолютное отсутствие нейтрофильных сетей. У всех исследованных больных с постковидом обнаруживаются НЭЛ только в форме одиночных нитей [3].

Патогенез постковида связан с вирус-индуцированным повреждением сосудистого эндотелия, приводящим к развитию воспалительного процесса [5, 8, 10]. Контактные взаимодействия нейтрофилов с фибробластами могут поддерживать процесс активации нейтрофильных лейкоцитов крови и индуцировать формирование НЭЛ в форме одиночных нитей.

Маркеры асептического воспаления

Нитевидные нейтрофильные экстраклеточные ловушки — маркеры асептического воспаления. В экспериментах по клеточному культивированию нейтрофилов здоровых доноров с фибробластами мы обнаружили формирование НЭЛ в виде одиночных нитей, выходящих из ядра нейтрофилов. Результаты последующих экспериментов показали, что индукторами формирования НЭЛ в морфологической форме одиночных нитей являются пептиды коллагена (рис.).

 

Рисунок. Формирование нейтрофильных экстраклеточных ловушек в нитевидной форме нейтрофилами здоровых доноров под влиянием пептидов коллагена

Figure. Neutrophil extracellular traps formation in filamentous form by neutrophils of healthy donors under collagen peptides influence

Примечание. По вертикальной оси — нейтрофильные экстраклеточные ловушки (в %). По горизонтальной оси — концентрация пептидов коллагена (мкг/мл).

Note. On the vertical axis — neutrophil extracellular traps (in %). On the horizontal axis — the collagen peptides concentration (mg/mL).

 

Таким образом, наше предположение о том, что коллаген, локализованный на поверхности фибробластов, может индуцировать формирование НЭЛ в виде одиночных нитей, нашло свое экспериментальное подтверждение. Физиологическое значение этого эффекта пока нуждается в четкой интерпретации, но перспективы практического его применения уже достаточно ясны. Данные литературы показывают, что НЭЛ могут быть вовлечены не только в начальные этапы воспаления, но и в последующий фиброз [4]. У больных с опухолевыми заболеваниями было выявлено, что коллаген индуцирует формирование нейтрофильных экстраклеточных ловушек [7] и способствует инфильтрации активированных лимфоцитов в опухолевую ткань, однако морфологические формы НЭЛ при этом не были определены.

Заключение

Определение причины и вида воспаления имеет важное значение в медицине, так как этот принцип классификации необходим для постановки диагноза и определения тактики лечения.

Предложена система классификации видов воспаления, основанная на определении параметров адаптивного иммунитета. Эта классификация использует сочетания различных цитокинов [11]. Результаты проведенного нами исследования демонстрируют эффективность избранного подхода к поиску специфических маркеров воспаления. Обнаружение в крови больных нейтрофильных сетей — признак инфекционного воспалительного процесса. Этот вывод в некоторой степени подтверждается данными других исследований, в которых обнаружили подобные структуры (web-like structures) [9]. Вместе с тем нейтрофильные сети формируются и под влиянием апоптозирующихся клеток, инфицированных вирусами или внутриклеточными микроорганизмами [1].

Нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме одиночных нитей, согласно результатам наших исследований, являются маркерами асептического воспаления, а также признаком поражения эндотелия.

About the authors

Alexander N. Kazimirskii

Kazimirskii A.N., Salmasi J.M., Poryadin G.V., Panina M.I., Kim A.E., Rogozhina L.S.
Pirogov Russian National Research Medical University

Author for correspondence.
Email: alnica10@mail.ru

DSc (Biology), Leading Research Associate, Department of Molecular Technologies, Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Russian Federation, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

J. M. Salmasi

Kazimirskii A.N., Salmasi J.M., Poryadin G.V., Panina M.I., Kim A.E., Rogozhina L.S.
Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

DSc (Medicine), Professor, Head, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Russian Federation, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

G. V. Poryadin

Kazimirskii A.N., Salmasi J.M., Poryadin G.V., Panina M.I., Kim A.E., Rogozhina L.S.
Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

DSc (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Russian Federation, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

M. I. Panina

Kazimirskii A.N., Salmasi J.M., Poryadin G.V., Panina M.I., Kim A.E., Rogozhina L.S.
Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

DSc (Medicine), Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Russian Federation, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

A. E. Kim

Kazimirskii A.N., Salmasi J.M., Poryadin G.V., Panina M.I., Kim A.E., Rogozhina L.S.
Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

Assistant Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Russian Federation, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

L. S. Rogozhina

Kazimirskii A.N., Salmasi J.M., Poryadin G.V., Panina M.I., Kim A.E., Rogozhina L.S.
Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

Assistant Professor, Department of Hospital Surgery No. 1

Russian Federation, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

References

Supplementary files