Neutrophil extracellular traps as markers of infectious and aseptic inflammation

Full Text

Введение

В настоящее время одной из важных проблем медицины является поиск новых объективных и достоверных, но при этом легко выявляемых маркеров воспаления, которые бы позволили определить природу флогогенного фактора и тип воспалительного процесса для выбора правильной тактики лечения, оценки эффективности противовоспалительной терапии, обоснования необходимости хирургического вмешательства, определения прогноза заболевания.

Надежность обнаружения маркера воспаления может определяться его вовлеченностью в ключевые процессы запуска защитных реакций врожденного иммунитета. Таким наиболее ранним и принципиальным процессом является реакция нейтрофилов на поступающие в организм патогены или на повреждение собственных тканей.

Нейтрофилы формируют нейтрофильные экстраклеточные ловушки (НЭЛ, NETs) при поступлении в организм патогенов различной природы, в первую очередь инфекционных (бактерий, вирусов), а также в ответ на поврежденные структуры собственного организма.

Несмотря на большое количество исследований, посвященных НЭЛ, морфологические варианты этих внеклеточных структур нейтрофилов еще не охарактеризованы. В наших исследованиях описаны несколько вариантов НЭЛ, которые могут быть связаны с типом воспалительного процесса.

Цель — определение специфических маркеров инфекционного и асептического воспаления на основе анализа морфологических вариантов нейтрофильных экстраклеточных ловушек.

Материалы и методы

Пациенты

В исследование включены 26 больных, находящихся на лечении в 51 ГКБ г. Москвы с различными нозологическими формами воспалительного процесса в брюшной полости (12 больных с острым аппендицитом, 8 больных с острым холециститом, 6 больных с диагнозом «панкреатит/панкреонекроз») после проведенного хирургического вмешательства. В исследование были включены также 20 больных с пост ковидом и группа из 10 волонтеров, считавших себя здоровыми, но при этом имевших контакты с заболевшими гриппом.

Методы

Получение клеточных фракций нейтрофилов. Для взятия проб крови использовали вакутайнер с ЭДТА для предотвращения свертывания. Выделение нейтрофилов из венозной крови, обработанной ЭДТА, проводили традиционным методом с помощью градиентного центрифугирования. Для этого кровь разводили в 4 раза нат рий-фосфатным буферным раствором 50 мM, рН 7,4 и наслаивали на двойной градиент плотности фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,077 г/см³, а нижнего — 1,190 г/см³. После центрифугирования (1600 об/мин, 30 мин) на границе между градиентами возникает скопление нейтрофилов с чистотой 98–100%. Нейтрофилы дважды отмывали от примесей фиколла натрий-фосфатным буферным раствором (50 мМ, рН 7,4). Осаждение клеток крови проводили при центрифугировании (1200 об/мин, 15 мин). Выделенные нейтрофилы в среде RPMI-1640 использовали в экспериментах по кратковременному культивированию. Жизнеспособность выделенных нейтрофилов составляла не менее 95% (тест с 0,1%-ным раствором трипанового синего).

Иммунофлюоресцентное определение нейтрофильных экстраклеточных ловушек. Для обнаружения и подсчета нейтрофильных экстраклеточных ловушек использовали флюоресцентную микроскопию [2]. Выявление нейтрофильных экстраклеточных ловушек осуществляли с использованием флюоресцентного красителя SYBR Green (ЗАО «Евроген», Россия), специфично взаимодействующего с двухцепочечной ДНК. Микроскопирование, подсчет и фоторегистрацию клеток и экстраклеточных структур проводили при увеличении ×1000. Результаты выражали в процентах, в виде отношения количества экстраклеточных ловушек к общему числу клеток в поле зрения.

Статистическая обработка. Полученные результаты обрабатывали в программе Statistica 12.0 (StatSoft, Inc., США). Данные представлены в виде среднего значения (М) ± стандартная ошибка среднего (m). Сравнение количественных признаков проводили по ранговому U-критерию Манна–Уитни и данным дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при значениях p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Маркеры инфекционного воспаления

Качественный анализ НЭЛ у больных с воспалительными заболеваниями дает возможность выявить характерные морфологические признаки НЭЛ при воспалении инфекционного генеза.

В настоящее время морфологические формы нейтрофильных экстраклеточных ловушек и их функциональная активность при воспалительных заболеваниях практически не исследованы. В наших исследованиях мы определили 4 главные морфологические формы нейтрофильных ловушек — нейтрофильные сети, одиночные нити, волокна и вуали, из которых функционально активной, то есть способной захватывать и связывать патогены, обладает только одна экстраклеточная структура — сетевидная. Нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме нейтрофильных сетей нами были обнаружены в крови у хирургических больных с диагнозом «острый аппендицит», имеющих благоприятный характер течения заболевания и послеоперационного периода. Причем обследованные больные никаких других аномальных форм (нитей, волокон и вуалей) нейтрофильных экстраклеточных ловушек не имели.

В группе волонтеров, не имеющих никаких клинических проявлений заболевания гриппом, но находящихся в постоянном контакте с заболевшими, нами также были обнаружены нейтрофильные сети при полном отсутствии аномальных форм НЭЛ. Найденные морфологические формы НЭЛ у больных из отделения абдоминальной хирургии и у не заболевших гриппом волонтеров суммированы в табл. 1.

 

Таблица 1. Количество и морфологические формы нейтрофильных экстраклеточных ловушек (НЭЛ) у больных с острым аппендицитом с благоприятным течением и инфицированных вирусом гриппа волонтеров, но без клинической симптоматики

Table 1. Morphological forms of neutrophil extracellular traps (NETs) in patients with acute appendicitis with a favorable course and infected with influenza virus volunteers, but without obvious symptoms

Группы пациентов Groups of patients	Количество НЭЛ, % The number of NETs, %	Морфологические формы НЭЛ Morphological forms of NETs
		Сети Web-like structures	Одиночные нити Single filaments	Волокна Fibers	Вуали Clouds
Острый аппендицит, неосложненный Acute appendicitis, uncomplicated (n = 6)	10,19±0,73	++++	–	–	–
Инфицированные вирусом гриппа, но не заболевшие волонтеры Infected with the flu virus, but not sick volunteers (n = 10)	8,58±0,51	++++	–	–	–

Примечание. ++++ — значительное количество нейтрофильных экстраклеточных структур; + — минимальное (менее 10% от общего количества) нейтрофильных экстраклеточных структур.

Note. ++++ — a significant number of neutrophil extracellular structures; + — minimum (less than 10% of the total) neutrophil extracellular structures.

 

Необходимо отметить, что нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме нейтрофильных сетей, найденные у этих двух групп обследованных хирургических больных и инфицированных волонтеров, обладали чрезвычайно высокой функциональной активностью нейтрофильных сетей.

Сопоставление этих результатов показывает, что нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме нейтрофильных сетей могут быть маркерами инфекционного воспаления.

Данные других исследователей подтверждают наши наблюдения о том, что нейтрофильные сети характерны для острого инфекционного процесса в организме [6, 10].

Осложненные формы абдоминального воспаления — разнообразие морфологических типов НЭЛ

Исследование нейтрофильных экстраклеточных ловушек у больных с различными нозологическими формами воспалительного процесса показывает, что помимо нейтрофильных сетей у части хирургических больных обнаруживаются НЭЛ в морфологической форме одиночных нитей. Так, у всех больных с аппендицитом, осложненным абсцессом брюшной полости, помимо нейтрофильных сетей были найдены нейтрофильные экстраклеточные структуры в форме одиночных нитей. Такие нейтрофильные экстраклеточные структуры в форме одиночных нитей обнаруживались также и у части больных с холециститом и панкреатитом (табл. 2).

 

Таблица 2. Количество и морфологические формы НЭЛ у больных с различными нозологическими формами воспалительного процесса в брюшной полости и у больных с постковидным синдромом

Table 2. Morphological forms of NETs in patients with various nosological forms of the inflammatory process in the abdominal cavity and in patients with post-COVID syndrome

Группы больных Groups of patients	Количество НЭЛ, % The number of NETs, %	Морфологические формы НЭЛ Morphological forms of NETs
		Сети Web-like structures	Одиночные нити Single filaments	Волокна Fibers	Вуали Clouds
Острый аппендицит, осложненный абсцессом брюшной полости Acute appendicitis complicated by abdominal abscess (n = 6)	13,26±0,95	+++	+	+	+
Острый холецистит Acute cholecystitis (n = 8)	15,66±2,81	++	+	+	–
Острый панкреатит/панкреонекроз Acute pancreatitis/pancreonecrosis (n = 6)	12,64±2,73	+	+	+	+
Постковид Post-COVID (n = 20)	6,55±0,94	–	+	–	–

Примечание. См. примечание к табл. 1.

Note. As for Table 1.

 

Необходимо отметить, что у всех больных с абдоминальным воспалением, осложненным абсцессом брюшной полости, помимо нейтрофильных сетей регистрировали также и аномальные формы НЭЛ, в частности НЭЛ в морфологической форме одиночных нитей.

Группа больных с постковидным синдромом, выбранная в пределах настоящего исследования как группа сравнения, демонстрирует абсолютное отсутствие нейтрофильных сетей. У всех исследованных больных с постковидом обнаруживаются НЭЛ только в форме одиночных нитей [3].

Патогенез постковида связан с вирус-индуцированным повреждением сосудистого эндотелия, приводящим к развитию воспалительного процесса [5, 8, 10]. Контактные взаимодействия нейтрофилов с фибробластами могут поддерживать процесс активации нейтрофильных лейкоцитов крови и индуцировать формирование НЭЛ в форме одиночных нитей.

Маркеры асептического воспаления

Нитевидные нейтрофильные экстраклеточные ловушки — маркеры асептического воспаления. В экспериментах по клеточному культивированию нейтрофилов здоровых доноров с фибробластами мы обнаружили формирование НЭЛ в виде одиночных нитей, выходящих из ядра нейтрофилов. Результаты последующих экспериментов показали, что индукторами формирования НЭЛ в морфологической форме одиночных нитей являются пептиды коллагена (рис.).

 

Рисунок. Формирование нейтрофильных экстраклеточных ловушек в нитевидной форме нейтрофилами здоровых доноров под влиянием пептидов коллагена

Figure. Neutrophil extracellular traps formation in filamentous form by neutrophils of healthy donors under collagen peptides influence

Примечание. По вертикальной оси — нейтрофильные экстраклеточные ловушки (в %). По горизонтальной оси — концентрация пептидов коллагена (мкг/мл).

Note. On the vertical axis — neutrophil extracellular traps (in %). On the horizontal axis — the collagen peptides concentration (mg/mL).

 

Таким образом, наше предположение о том, что коллаген, локализованный на поверхности фибробластов, может индуцировать формирование НЭЛ в виде одиночных нитей, нашло свое экспериментальное подтверждение. Физиологическое значение этого эффекта пока нуждается в четкой интерпретации, но перспективы практического его применения уже достаточно ясны. Данные литературы показывают, что НЭЛ могут быть вовлечены не только в начальные этапы воспаления, но и в последующий фиброз [4]. У больных с опухолевыми заболеваниями было выявлено, что коллаген индуцирует формирование нейтрофильных экстраклеточных ловушек [7] и способствует инфильтрации активированных лимфоцитов в опухолевую ткань, однако морфологические формы НЭЛ при этом не были определены.

Заключение

Определение причины и вида воспаления имеет важное значение в медицине, так как этот принцип классификации необходим для постановки диагноза и определения тактики лечения.

Предложена система классификации видов воспаления, основанная на определении параметров адаптивного иммунитета. Эта классификация использует сочетания различных цитокинов [11]. Результаты проведенного нами исследования демонстрируют эффективность избранного подхода к поиску специфических маркеров воспаления. Обнаружение в крови больных нейтрофильных сетей — признак инфекционного воспалительного процесса. Этот вывод в некоторой степени подтверждается данными других исследований, в которых обнаружили подобные структуры (web-like structures) [9]. Вместе с тем нейтрофильные сети формируются и под влиянием апоптозирующихся клеток, инфицированных вирусами или внутриклеточными микроорганизмами [1].

Нейтрофильные экстраклеточные ловушки в морфологической форме одиночных нитей, согласно результатам наших исследований, являются маркерами асептического воспаления, а также признаком поражения эндотелия.

About the authors

Alexander N. Kazimirskii

Pirogov Russian National Research Medical University

Author for correspondence.
Email: alnica10@mail.ru

DSc (Biology), Leading Research Associate, Department of Molecular Technologies, Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Россия, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

J. M. Salmasi

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

DSc (Medicine), Professor, Head, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Россия, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

G. V. Poryadin

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

DSc (Medicine), Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Россия, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

M. I. Panina

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

DSc (Medicine), Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Россия, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

A. E. Kim

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

Assistant Professor, Department of Pathophysiology and Clinical Pathophysiology, Human Biology and Pathology Institute

Россия, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

L. S. Rogozhina

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: alnica10@mail.ru

Assistant Professor, Department of Hospital Surgery No. 1

Россия, 117513, Moscow, Ostrovityanov str., 1

References

Supplementary files