Comparative assessment of interferon activity in influenza and COVID-19

Full Text

Введение

Респираторные вирусы проникают в клетки эпителия слизистых дыхательных путей, являю щихся воротами инфекции, в которых реплицируются c поражением других органов и тканей, вызывая клинически повышение температуры тела, головную боль, насморк, боль в горле и кашель. Частые острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) могут свидетельствовать о нарушениях врожденного и адаптивного иммунитета. На ранних стадиях инфекции цитокиновый каскад начинается с провоспалительных цитокинов, включая интерфероны (IFN) I типа, фактор некроза опухолей (TNFα), IL-1β и др., действие которых клинически ассоциируют с лихорадочным состоянием, слабос тью, сонливостью и анорексией. Из известных респираторных вирусов наиболее серьезные осложнения вызывают вирусы гриппа А и В, а также коронавирусы [3, 8, 11, 15]. Комплексное исследование системы IFN при гриппе изучалось [5, 14], а при COVID-19 результаты получены сравнительно недавно ввиду «новизны» инфекции. Активность IFN, как потенциала противовирусной защиты организма от вирусов, оценивается методом «Интерфероновый статус» с выявлением различной степени выраженности недостаточности биологической активности IFN, продуцируемых лейкоцитами крови. Определенный интерес вызывает возможность применения в комплексной терапии ОРВИ гриппа и COVID-19 иммуноактивных препаратов, способных повлиять на увеличение активности IFN. Целью настоящего исследования явилась оценка биологической активности IFN, продуцируемых лейкоцитами крови, клинической эффективности при использовании препаратов индукторов IFN, иммуномодуляторов на фоне базисной терапии.

Материалы и методы

Был исследован биологический материал: гепаринизированная кровь от пациентов среднетяжелого течения в острый период инфекции на 1–2 сутки заболевания с установленным диагнозом грипп (n = 113) (H3N2; H1N1) и COVID-19 (n = 110. Исследование проводилось при информированном согласии пациентов.

Биологическую активность интерферонов (IFN статус) определяли in vitro микрометодом по разработанной авторами методике [6]. Оценивали: циркулирующий (сывороточный) IFN; активность IFN I типа (α/β), продуцируемых лейкоцитами крови, при стимуляции их вирусом болезни Ньюкасла (NDV), штамм Канзас; активность IFN типа II (γ), продуцируемых лейкоцитами, при индукции их митогеном — фитогемагглютинином (ФГА) (ООО «Компания «ПанЭко», Россия); активность спонтанного IFN in vitro. За титр IFN принимали величину, обратную разведению, при котором задерживается деструкция монослоя клеток от внесенного тест-вируса везикулярного стоматита (VSV) — максимальное разведение, при котором наблюдается 100% защита монослоя клеток Vero от цитопатогенного действия (ЦПД) тест-вируса. Учет результатов проводили по последней лунке 100% защиты клеточного монослоя, однако, если в следующей лунке титрования имел место 50% показатель защиты, то брали их среднее значение. Данный метод позволяет по совокупности показателей оценить степень недостаточности/дефицита системы IFN по такому параметру, как способность к выработке биологически активного IFN лейкоцитами крови, выражаемого в титрах биологической активности (ТБА). За показатели биоактивности IFN I типа в норме принимались значения ТБА ≥ 640, II типа — ≥ 64, сывороточного IFN ≤ 2–8 и спонтанно продуцируемого — < 2 ТБА.

Дополнительно к базисной терапии применяли препараты для иммунокоррекции: индукторы IFN кагоцел, циклоферон, иммуномодуляторы ингавирин, поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4. Кагоцел назначали по 2 таблетки 3 раза в сутки в течение первых двух суток, затем по 1 таблетке 3 раза в сутки в течение последующих двух дней. Курс лечения 4 дня. Циклоферон — 2 таблетки однократно в первые, вторые, четвертые, восьмые сутки лечения. Ингавирин назначали в дозе 90 мг в сутки в течение 5 дней. Во всех группах пациентам проводили симптоматическую терапию (1% раствор нафтизина, мукалтин, аскорутин), при этом исключали препараты, обладающие жаропонижающим действием. На фоне базисной терапии госпитализированным пациентам с COVID-19 вводили бактериальные лиганды — поликомпонентную вакцину Иммуновак-ВП-4 — интраназально по 2 капли (1 мг) в каждую половину носа ежедневно и подкожно через день с 1-го по 11-й день нахождения в стационаре (группа А, n = 30); на фоне базисной терапии введение ВП-4 перорально по 2 мл (20 мг) и по 2 капли (1 мг) интраназально в каждую половину носа ежедневно с 1-го по 10-й день нахождения в стацио наре (группа В, n = 30). Пациенты из группы контроля (С, n = 50). получали терапию в виде: фавипиравир 200 мг по схеме, эноксапарин 0,4 мг/сут подкожно, дексаметазон 8–12 мг/сут, при СРБ ≥ 60 мг/л — тоцилизумаб 400 мг/сут.

Статистическую обработку показателей проводили c использованием программного обеспечения Biostat. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

При ОРВИ была определена биологическая активность IFN, продуцируемых лейкоцитами крови (IFN статус), что отражено на рис. 1. У пациентов неосложненным гриппом было отмечено статистически значимое угнетение биологической активности IFN I типа (α/β), подавление γ-IFN-генеза, повышение содержания биологической активности IFN в сыворотке крови у 73 из 113 пациентов (64,5%±4,99%), что является ответной реакцией организма на вирусную инфекцию [2], и наличия у 64 из 113 пациентов (57%±5,2%) биологически активного спонтанного IFN в реакции in vitro (рис. 1).

 

Рисунок 1. Показатели биологической активности IFN I (А) и IFN II (Б), продуцируемые лейкоцитами крови, при гриппе и COVID-19

Figure 1. Indicators of biological activity of IFN I (A) and IFN II (B) produced by blood leukocytes during influenza and COVID-19

Примечание. *p < 0,05 — статистически значимые отличия показателей здоровых добровольцев и пациентов (p < 0,05).

Note. *p < 0.05 — statistically significant differences in the indicators of healthy volunteers and patients (p < 0.05).

 

В пробах гепаринизированной крови пациентов с COVID-19 острого периода (n = 110) в реакции in vitro определена биологическая активность IFN I и II типов, продуцируемых лейкоцитами крови. На рис. 1 отражены выявленные нами показатели биологической активности IFN I и II типов при COVID-19 (р < 0,05) в острой стадии. Так, практически у всех пациентов выявлено значительное угнетение биологической активности IFN I и II типов, которое можно отнести к выраженной недостаточности 3 и 4 степени. У части обследуемых выявили глубокий дефицит (следовые количества) биологической активности IFN: 67 человек (60,9%±4,7%) — 4 степени по IFN I типа и 40 (36,4%±4,6%) — IFN II типа. Зарегистрировано повышение биологической активности IFN в сыворотке крови у 12 пациентов (10,9%±2,9%). Выявлено токсическое воздействие сыворотки крови пациентов на культуру клеток у 20 больных (18,2%±3,7%). Наконец, в 4 (3,6%±1,8%) пробах неиндуцированной крови in vitro обнаружено наличие спонтанного IFN, не образующегося в физиологических условиях.

По сравнению с гриппом, при COVID-19 имеет место существенно более значительное угнетение биологической активности IFN, отражающее степень поражения вирусом SARS-CoV-2 системы IFN как естественной противовирусной защиты организма (рис. 1). В острой стадии заболевания значения ТБА для IFN I типа кратно отличаются от референcных: при норме в 640 ТБА средние значения составили < 32 (резкое угнетение в ≥ 20 раз) (p < 0,05). По IFN II типа при норме 64 ТБА отмечено снижение в 7,3 раза (p < 0,05). Эти результаты наглядно демонстрируют степень угнетения биологической активности IFN I и II типов при COVID-19 по сравнению с референсными значениями. Угнетение активности IFN в острой фазе COVID-19 отличается от иммунопатологической картины при остром гриппе: в последнем случае также выявлено снижение биоактивности IFN относительно нормы в несколько раз, однако оно не столь выражено по сравнению с таковым при COVID-19 (рис. 1).

В связи с угнетением физиологической биологической активности IFN при ОРВИ, вызванным вирусами гриппа и COVID-19, возникает необходимость усиления естественного противовирусного ответа с применением иммуноактивных препаратов (IFN, индукторы IFN, иммуномодуляторы) для увеличения противовирусного потенциала организма при помощи индукции биологической активности IFN ответа [1, 2, 10]. В настоящее время для лечения ОРВИ эффективно используются препараты IFN: растворы для инъекций, мази, гели, капли в нос. Препараты IFNα сочетают свойства ингибитора вирусной продукции и повышения иммунной защиты организма [2] и применяют как при сезонном гриппе, так и при пандемическом гриппе А. Под действием IFN повышается эффективность иммунного распознавания антигена, усиливаются фагоцитарная и цитолитическая функции, направленные на элиминацию возбудителя или антигенно измененных клеток, а также коррекция других вторичных иммунодефицитов, развивающихся вследствие патологического процесса. Ряд исследователей отмечают индукцию образования IFN и активацию фагоцитов после применении IFNβ [7], IFNα2b или сочетания IFN с арбидолом [13] при COVID-19.

Нами показано увеличение биологической активности IFN после лечения пациентов иммуноактивными препаратами, способными усилить противовирусную защиту организма. В качестве таких препаратов в комплексной базисной терапии были применены: циклоферон, кагоцел, ингавирин, бактериальные лиганды (Иммуновак-ВП-4).

Так, при гриппе были применены иммуноактивные препараты циклоферон, кагоцел, ингавирин. На рис. 2 отражено увеличение биологической активности IFN после лечения пациентов с гриппом иммуноактивными препаратами, способными усилить противовирусную защиту организма (рис. 2).

 

Рисунок 2. Показатели биологической активности IFN I типа (А) и IFN II типа (Б) при лечении сезонного гриппа H3N2 препаратами циклоферон, кагоцел, ингавирин

Figure 2. Indicators of biological activity of type I IFN (A) and type II IFN (B) in the treatment of H3N2 influenza with cycloferon, kagocel, and ingavirin

Примечание. *p < 0,05 — статистически значимые различия показателей после лечения с показателями до лечения.

Note. *p < 0.05 — statistically significant differences in indicators after treatment with indicators before treatment.

 

По окончании лечения нормализация показателей IFN статуса в большей степени отмечена у больных, получавших испытуемые препараты. Так, биологическая активность IFNα восстановилась у 25 (90%±5.8%) больных, получавших кагоцел, у 24 (80%±7,4%) — циклоферон (р < 0,05). Показатели IFNγ нормализовались у 24 (85%±6,9%), 12 (60%±9,1%), соответственно (р < 0,05). Показатели IFN в сыворотке крови нормализовались у 18 (65%±9,2%), 29 (97%±3,2%), соответственно (р < 0,05). Применение препарата ингавирин также показало нормализацию показателей IFN статуса (р < 0,05). Следует отметить, что при повышении биологической активности IFN I и II типов, продуцируемых лейкоцитами крови, отмечено снижение биологической активности IFN в сыворотке крови и снижение концентрации белков IFNα и IFNγ.

Таким образом, при лечении препаратами кагоцел, циклоферон, ингавирин отмечено благоприятное влияние препаратов на течение неосложненного гриппа с более быстрым снижением температуры, исчезновении симптомов интоксикации и катаральных явлений у больных по сравнению с базисной терапией.

При COVID-19 в остром периоде заболевания были разработаны и применены 2 схемы лечения с назальным использованием в комплексной базисной терапии поликомпонентной вакцины Иммуновак-ВП-4: интраназально-подкожное введение ВП-4 (группа А, n = 30); интраназально-пероральный прием ВП-4 (группа В, n = 30). Группой контроля служили пациенты, также поступившие на лечение в стационар и получавшие только базисную терапию (группа контроля С, n = 50).

Мониторинг показателей биологической активности IFN I и IFN II типа в процессе лечения показал значительное увеличение (p < 0,05) активности IFN в группах (А и В) с добавлением в базисную терапию вакцины Иммуновак-ВП-4 сразу после проведенного курса лечения (2 визит) и дальнейшее увеличение активности IFN через месяц после заболевания (3 визит) в сравнении с группой контроля (С), пациенты которой получали только базисную терапию (рис. 3). Следует отметить и неплохой отдаленный эффект по истечении 12 мес. после начала заболевания (4 визит). Следует отметить, что полученные данные по увеличению функциональной биологической активности IFN сочетались с улучшением других лабораторных характеристик, а также с клинической эффективностью (рис. 3).

 

Рисунок 3. Изменение показателей биологической активности IFN I типа (А) и IFN II типа (Б) в процессе лечения пациентов в острой фазе COVID-19 (группы A, B, C)

Figure 3. Changes in the biological activity of type I IFN (A) and type II IFN (B) during the treatment of patients in the acute phase of COVID-19 (groups A, B, C)

Примечание. * — p < 0,05 в сравнении с визитом 1.

Note. * — p < 0.05 compared to visit 1.

 

Оценка противовирусной защиты организма против нового коронавируса SARS-CoV-2 при применении иммунотропного препарата — поликомпонентной вакцины Иммуновак-ВП-4 изучена впервые. Было показано, что разные схемы применения ВП-4 приводят к положительным лечебно-профилактическим эффектам, связанным с иммуноактивными свойствами поликомпонентной вакцины. Оценена перспективность противовирусной защиты организма против CОVID-19 препаратом ВП-4 с индукцией биологической активности IFN I и II типов, продуцируемых лейкоцитами крови.

Нами показаио, что усиление естественного противовирусного ответа, выраженного в увеличении индукции активности IFN, продуцируемых лейкоцитами крови, возможно с применением препарата Иммуновак-ВП-4 [10]. В целом, влияние Иммуновак-ВП-4 на коррекцию параметров показателей врожденного и адаптивного иммунитета приводит к улучшению клинической картины заболевания [4].

Во многом благодаря тому, что IFN занимают ведущее место среди медиаторов противовирусного иммунитета [9, 12], терапевтические средства на их основе имеют преимущество перед другими противовирусными препаратами, так как обладают биологической активностью в отношении практически всех вирусов и запускают в клетках программу синтеза антивирусных белков. К тому же, на уровне организма IFN вызывает стимуляцию процессов врожденного и приобретенного противовирусного иммунитета, формируя единую защитную реакцию против вирусов. Выраженность противовирусного ответа может быть усилена применением иммуноактивных (иммунотропных) препаратов (иммуномодуляторов, индукторов IFN) для увеличения индукции IFN-опосредованного ответа [10].

Заключение

Изучение активности IFN I и II типов, продуцируемых лейкоцитами крови, при ОРВИ позволило выявить их недостаточность (грипп) и даже дефицит (COVID-19). Применение в комплексной терапии иммуноактивных препаратов показало повышение противовирусной активности (р < 0,05). Следует отметить иммунологическую целесообразность и клиническую перспективность использования иммунокорригирующих препаратов (препараты IFN, индукторы IFN, иммуномодуляторы, бактериальные лиганды (Иммуновак-ВП-4)) в комплексном лечении и профилактике гриппа и новой коронавирусной инфекции COVID-19.

About the authors

Tatiana P. Ospelnikova

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera; N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: ospelnikovat@mail.ru

PhD (Medicine), Leading Researcher, Head of the Interferon Laboratory, Senior Researcher, Cytokines Laboratory

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny lane, 5a; Moscow

O. A. Svitich

Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera

Email: ospelnikovat@mail.ru

DSc (Medicine), Professor of RAS, RAS Corresponding Member, Director

Russian Federation, 105064, Moscow, Maly Kazenny lane, 5a

F. I. Ershov

N.F. Gamaleya Federal Research Center for Epidemiology and Microbiology

Email: ospelnikovat@mail.ru

RAS Full Member, DSc (Medicine), Professor, Head Researcher

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files