Immunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis coupled to mutant genes associated with predisposition to arterial hypertension development

Full Text

Введение

В Российской Федерации в течение последних 10–15 лет наблюдался рост смертности от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), а артериальная гипертония (АГ) является основным фактором риска, определяющим прогноз заболеваемости и смертности от ССЗ [15]. Традиционно гипертоническая болезнь рассматривалась как нарушение двух систем, которые участвуют в регуляции водно-солевого баланса и сердечно-сосудистой функции: ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) и симпатической нервной системы (СНС). Однако лечение, направленное на ограничение влияния РААС или СНС на артериальное давление, дает сбой в 40% случаев, что предполагает, что должны быть задействованы еще какие-то механизмы [19]. В последнее время существует мнение, что на развитие артериальной гипертонии оказывает влияние иммунная система. Длительный воспалительный процесс вызывает накопление активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс, который приводит к эндотелиальной дисфункции — основной причине АГ, а повышенные количества ангиотензина II (вызывающего спазм сосудов), в свою очередь, оказывают активирующее влияние на иммунную систему. Усиленная активация иммунной системы является механизмом, поддерживающим АГ, и в то же время АГ опосредует генерализованную воспалительную реакцию в организме, нарушая функционирование кровеносных сосудов, сердца, почек и головного мозга. При гипертонии иммунные клетки проникают в кровеносные сосуды, способствуя эндотелиальной дисфункции и препятствуя расслаблению сосудов. В почках наблюдается инфильтрация и накопление различных подмножеств иммунных клеток; в сердце — инфильтрация провоспалительных элементов. Участие иммунной системы в развитии АГ кажется безусловным [18, 20] — она не только усугубляет развитие АГ, но способна предотвратить развитие артериальной гипертонии. Механизмы адаптивного иммунного ответа активируются в ответ на сигналы от СНС и РААС: происходит дифференцировка Т-лимфоцитов в Th-1 и Th-17, которые являются провоспалительными. В то же время адаптивная иммунная система может препятствовать развитию АГ, например, CD4⁺ Т-клетки, дифференцируясь в регуляторные Т-клетки (Tregs), подавляют активацию иммунного ответа, поскольку продуцируют иммуносупрессивные цитокины, такие как TGF-β и IL-10. Эти цитокины снижают эндотелиальную дисфункцию, препятствуя развитию артериальной гипертонии [16].

Механизмы иммунного ответа при описторхозе, несмотря на многолетнюю историю изучения этого гельминтоза, до настоящего времени остаются актуальной проблемой. В предыдущих исследованиях [6] были выявлены следующие изменения иммунного реагирования в хроническую стадию описторхозной инвазии: повышение концентрации в сыворотке крови общих циркулирующих иммунных комплексов; повышение активности фермента нейтрофилов миелопероксидазы (МП), поглотительной способности и активности бактерицидных систем нейтрофилов (НСТ-тест); повышение относительного и абсолютного количества эозинофилов; снижение количества моноцитов и натуральных киллеров (NK). Изменяется и адаптивный иммунный ответ: у пациентов с хроническим описторхозом (ХО) снижается количество лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺), В-лимфоцитов (CD3^–CD19⁺); увеличивается относительное количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺) и Т-лимфоцитов с маркером поздней активацией (CD3⁺HLA-DR⁺); возрастает индекс CD4⁺/CD8⁺.

В последнее время приходит понимание неоднородности патогенеза одного и того же заболевания при различных индивидуальных молекулярно-генетических и морфофункциональных особенностях организма [3]. Ранее проведенные исследования [1, 5, 8] позволили предположить влияние генетических полиморфизмов, связанных с предрасположенностью к развитию неинфекционных заболеваний, на реакцию иммунной системы пациентов с ХО на инвазию. Спектр генов-кандидатов включает группы генов, контролирующих различные метаболические, гомеостатические и иммунологические системы, нарушения которых, вовлечены в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний и механизмы иммунного ответа [10].

Целью исследования было выявление взаимосвязи между наличием полиморфизмов, ассоциированных с развитием артериальной гипертонии, и особенностями функционирования иммунной системы у пациентов с хронической описторхозной инвазией.

Материалы и методы

Было обследовано 52 пациента с диагнозом хронический описторхоз. Все пациенты дали информированное согласие на участие в этом исследовании. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФБУН «Тюменский научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии» Роспотребнадзора (протокол № 2 от 01.02.2023 г.). Медиана возраста обследуемых составила 54 года (IQR 38,8–62). Проведено комплексное исследование иммунологических показателей.

Фагоцитарная активность нейтрофилов (ФАН) определялась по способности клеток поглощать частицы латекса с d = 10 мкм (ООО «ДИАЭМ», Россия) — процент нейтрофилов из 200 проанализированных, содержащих частицы латекса [14]. Метаболическую активность нейтрофилов определяли цитохимическим методом восстановления нитросинего тетразолия до диформазана (НСТ-тест спонтанный и стимулированный 10% раствором пирогенала). Спонтанный НСТ-тест отражал степень активации кислородзависимого метаболизма и связанную с ним выработку свободных радикалов; стимулированный вариант характеризовал функциональный резерв [9]. Уровень миелопероксидазы нейтрофилов выявляли спектрофотометрическим методом [9].

Исследование фенотипа лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии цельной периферической крови с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, США), меченых FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), ECD (phycoerythrin-Texas Red-X) и PC5 (phycoerythrin-cyanin5) на проточном цитофлуориметре «Cytomics FC-500» (Beckman Coulter, США). Использовалось трехцветное иммунофенотипирование по панелям: CD3/CD4/CD45, CD3/CD8/CD45, CD3/CD16⁺56/CD45 и CD3/CD19/CD45. Основные фенотипы лимфоцитов: Т-лимфоциты (CD3⁺CD19^–CD16/56^–CD45⁺), Т-хелперы (CD3⁺CD4⁺CD45⁺), Т-цитотоксические (CD3⁺CD8⁺CD45⁺), NK-клетки (CD3^–CD16/56⁺CD45⁺), B-лимфоциты (CD3^–CD19⁺CD45⁺) и активированные Т-лимфоциты (CD3⁺CDHLADR⁺CD45⁺). Абсолютные значения были получены с помощью двухплатформенной технологии с использованием результатов гематологического анализа. Концентрацию иммуноглобулинов М, G, А, и E в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с помощью коммерческих наборов «Иммуноскрин-G,M,A-ИФА-БЕСТ» и «IgE-общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия). Концентрацию цитокинов (IFNγ, IL-4, IL-8, IL-10) определяли иммуноферментным методом с помощью коммерческих наборов «Гамма-интерферон-ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-4-ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-10-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия).

Выделение тотальной ДНК человека из образцов крови проводили с использованием коммерческих наборов «ДНК-сорб В» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Генетические полиморфизмы выявляли методом пиросеквенирования с применением системы генетического анализа «PyroMark24» и коммерческих наборов реагентов (АмплиСенс Пироскрин «ТОНО-скрин»), предназначенных для оценки предрасположенности к развитию артериальной гипертонии путем обнаружения полиморфизмов в локусах:

– rs1042713 гена ARDB2 (Адренорецептор β2);

– rs4762 гена AGT (Ангиотензиноген);

– rs699 гена AGT (Ангиотензиноген);

– rs5186 гена AGTR1 (Рецептор 1 типа ангиотензина II);

– rs1799983 гена NOS3 (Синтаза окиси азота).

Статистическая обработка полученных результатов выполнена лицензионным программным обеспечением SPSS, версия 22.0, предназначенным для научных исследований и доказательной медицины. Оценка значимости различий между группами c нормальным распределением значений (подтвержденным тестом Шапиро–Уилка) проводилась с помощью t-критерия Стьюдента (Т-тест). Оценка значимости различий между группами при распределении, отличном от нормального, проводилась с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни (U-тест). Критический уровень значимости принимался < 0,05. Сравнивали показатели иммунной системы в группах больных хроническим описторхозом с наличием и отсутствием мутаций, ассоциированных с предрасположенностью к артериальной гипертонии. В статье представлены достоверно различающиеся показатели (р < 0,05).

Результаты и обсуждение

При сравнении иммунологических показателей пациентов с ХО в группах с наличием и отсутствием мутаций генов AGT rs 4762 и AGTR1 rs5186 различий не выявлено.

Выявленные достоверные различия изучаемых показателей между группами пациентов с хроническим описторхозом с наличием мутантных аллелей генов, ассоциированных с развитием артериальной гипертонии, и без них представлены в таблицах.

У пациентов ХО с редким аллелем rs1042713 гена β2-адренорецептора (ADRB2) по сравнению с пациентами с частым аллелем достоверно повышено абсолютное количество лейкоцитов и абсолютное количество моноцитов; снижен общий иммуноглобулин Е (табл.1).

 

Таблица 1. Иммунологические показатели у пациентов с хроническим описторхозом в зависимости от наличия или отсутствия минорного аллеля rs1042713 гена ARDB2

Table 1. Immunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis, with/without minor allele rs1042713 of the ARDB2 gene

Показатель, единица измерения Parameter, unit of measurement	Отсутствие минорного аллеля, M±m/Me (Q25–Q75) Without minor allele, M±m/Me (Q25–Q75) n = 17	Наличие минорного аллеля, M±m/Me (Q25–Q75) With minor allele, M±m/Me (Q25–Q75) n = 34	Сравнение групп, p Group comparison, р
Лейкоциты, кл/мкл Leukocytes, cells/μl	5252±379	6352±355	0,05 T-тест/T-test
Моноциты, кл/мкл Monocytes, cells/μl	210 (152–240)	301,5 (178,5–387)	0,03 U-тест/U-test
IgЕ, ме/мл IgE, iu/ml	16,5 (9–34)	8 (2,13–22,75)	0,05 U-тест/U-test

 

Мутации гена β2-адренергического рецептора (ADRB2) ассоциированы с развитием артериальной гипертонии. β2-адренергические рецепторы (β2-AR) связаны с медленными кальциевыми каналами L-типа и обеспечивают расслабление гладкой мускулатуры, в том числе бронходилатацию и вазодилатацию [12]. β2-AR находятся практически на всех клетках организма человека (иммунных клетках в том числе) и опосредуют эффекты катехоламинов. Активация β2-AR сопряжена с реакциями и врожденного, и адаптивного иммунного ответа. При активации рецепторов в нейтрофилах человека ингибируется экспрессия CD11b/CD18 (рецепторы комплемента CR3), фагоцитоз, адгезия, миграция и окислительный метаболизм [22]. Естественные киллеры, экспрессирующие β2-AR, получают при их активации ингибирующие сигналы, а моноциты приобретают противовоспалительный фенотип. Адаптивный иммунный ответ также модулируется активированными β2-AR. Получая стимул через β2-AR, дендритные клетки вызывают дифференцировку CD4⁺ Т-клеток в Th1- или Тh2-типа [24]. Опосредуемые β2-AR сигналы вызывают ингибирование эффекторных функций Т-лимфоцитов [23]. Стимуляция β2-AR на B-лимфоцитах через систему cAMP/PKA вызывает активацию В-лимфоцитов: растет уровень протеина IgG1, наблюдается повышение экспрессии CD86. Стимуляция β2-AR на Т-лимфоцитах ингибирует (в различной степени выраженности) продукцию провоспалительных цитокинов Th-1, таких как IFNγ, IL-12, TNFα, и усиление продукции цитокинов Th2, таких как IL-10 и трансформирующий фактор роста (TGF-β), являющихся противоспалительными [17]. Таким образом, стимуляция β2-AR, находящихся на клетках иммунной системы, модулирует иммунный ответ — снижает активность врожденного и клеточного звена специфического иммунитета и усиливает активность гуморального звена адаптивного иммунного ответа. В целом стимуляция β2-AR приводит к снижению воспалительных и усилению противовоспалительных эффектов иммунного ответа.

Результаты исследований иммунологических показателей пациентов ХО с редким аллелем гена ADRB2 свидетельствуют об усилении реакций врожденного иммунитета и подавлении реакций гуморального звена специфического иммунного ответа. Активация механизмов неспецифической резистентности и подавление гуморального звена специфического иммунитета у пациентов ХО с наличием минорного аллеля гена β2-AR выражена в большей степени, чем в целом по всей группе с хроническим описторхозом. Вероятно, это является неблагоприятным эффектом данной мутации на течение инвазионной болезни, так как у пациентов с редким аллелем этого гена иммунный ответ избыточен и, возможно, переходит границы физиологической нормы.

Исследования иммунологических показателей пациентов ХО с наличием минорного аллеля (rs699) гена ангиотензиногена (AGT) продемонстрировало достоверное снижение относительного количества лимфоцитов в группе без мутации. Относительное количество B-лимфоцитов в этой же группе повышено. Концентрация общего IgM у пациентов с мутацией снижена (табл. 2).

 

Таблица 2. Иммунологические показатели у пациентов с хроническим описторхозом в зависимости от наличия или отсутствия минорного аллеля rs699 гена AGT

Table 2. Immunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis with/without minor allele rs699 of AGT gene

Показатель, единица измерения Parameter, unit of measurement	Отсутствие минорного аллеля, M±m Without minor allele, M±m n = 17	Наличие минорного аллеля, M±m With minor allele, M±m n = 34	Сравнение групп, p Group comparison, р
Лимфоциты, % Lymphocytes, %	37,43±3,12	30,98±1,09	0,05 T-тест/T-test
CD3–CD19+, %	7,43±0,72	10,39±0,65	0,02 T-тест/T-test
IgM, мг/мл IgM, mg/ml	2,15±0,33	1,97±0,14	0,01 T-тест/T-test

 

Ген AGT кодирует белок ангиотензиноген, который служит предшественником ангиотензина-II, обладающего вазопрессорной активностью. Есть данные подтверждающие связь этого протеина с иммунным ответом при развитии АГ. Ангиотензин II обладает значительным провоспалительным действием, индуцируя рекрутирование моноцитов и лимфоцитов в субэндотелиальное пространство, увеличивая экспрессию молекул клеточной адгезии, агрегацию тромбоцитов и секрецию цитокинов, хемокинов и факторов роста, которые вовлечены в развитие атеросклероза и воспаление сосудистой стенки. Ангиотензин II определяет дифференцировку иммунных клеток в клетки провоспалительного фенотипа и последующую продукцию ими провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, IFNγ, IL-17 TNFα, что усиливает окислительный стресс [18]. Т-клетки активируются и проникают в ткани в ответ на стимуляцию ангиотензином II. При ангиотензин II-зависимой артериальной гипертензии наблюдается увеличение Th-клеток; дисбаланс Т-хелперных лимфоцитов с увеличением Th1-типа и снижением Th2-типа в селезенке и почках; увеличение количества CD8⁺ Т-клеток и дважды негативных Т-клеток (CD3⁺CD4^–CD8^–); потеря адапторного белка лимфоцитов LNK (также известного как SH2B3) и увеличение хемокина RANTES. Также было отмечено увеличение количества Т-клеток памяти CD3⁺CD45RO⁺. Роль В-клеток не столь очевидна, однако в развитии ангиотензин-II-зависимой гипертонии она также существенна [4, 18, 22, 25].

Результаты исследований иммунологических показателей у пациентов ХО с редким аллелем гена AGT по сравнению с пациентами с частым аллелем указывают на отличия в адаптивном иммунном ответе. У пациентов с мутацией гена AGT наблюдается снижение относительного количества лимфоцитов, B-лимфоцитов; снижена продукция общего иммуноглобулина M, что может указывать на подавление механизмов клеточного и гуморального звеньев адаптивного иммунного ответа. По-видимому, у пациентов с минорным аллелем гена AGT активация иммунного ответа выражена в меньшей степени. Возможно, это способствует уменьшению повреждений, вызванных гиперактивным иммунным ответом на описторхозную инвазию. В таком случае эта мутация благоприятна для пациентов с описторхозной инвазией и заболевание может протекать в более легкой степени, ведь в патогенезе описторхоза значимую роль играют иммунопатологические реакции, а от характера сформированного иммунного ответа на инвазию зависит степень патологических изменений в организме человека [11].

Исследования показателей иммунного ответа пациентов ХО в группах с наличием и отсутствием мутации rs1799983 гена NOS3 (синтаза окиси азота) выявили следующие отличия: повышение показателя бактерицидности нейтрофилов — стимулированного НСТ-теста и повышение индекса стимуляции этого теста в группе с редким аллелем. Относительное количество хелперов (CD4⁺) у пациентов с мутацией гена NOS3 повышено (табл. 3).

 

Таблица 3. Иммунологические показатели у пациентов с хроническим описторхозом в зависимости от наличия или отсутствия минорного аллеля rs1799983 гена NOS3

Table 3. Immunological parameters in patients with chronic opisthorchiasis with/without minor allele rs1799983 of the NOS3 gene

Показатель, единица измерения Parameter, unit of measurement	Отсутствие минорного аллеля, M±m/Me (Q25–Q75) Without minor allele, M±m/Me (Q25–Q75) n = 17	Наличие минорного аллеля, M±m/Me (Q25–Q75) With minor allele, M±m/Me (Q25–Q75) n = 34	Сравнение групп, p Group сomparison, р
НСТстим., % NBT stimulated, %	37 (32,5–44,5)	46,5 (34–51)	0,049 U-тест/U-test
НСТстим./НСТспонт. NBT stimulated/NBT spontaneous	2 (1,415–2,5)	2,5 (2,0–3,3)	0,040 U-тест/U-test
CD3+CD4+, %	45±1	49,3±11,7	0,05 T-тест/T-test

 

Ген NOS3 кодирует эндотелиальную синтазу окиси азота (NOS3), которая участвует в синтезе оксида азота (NO) в клетках эндотелия сосудов. Окись азота является нейромедиатором, вызывает расслабление гладких мышц сосудов, участвует в защите от патогенов, регулирует программируемую гибель и пролиферацию клеток, играет важную роль в секреторной и репродуктивной системе [7]. Снижение активности NO-синтазы может привести к развитию сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений [21].

У пациентов с хроническим описторхозом наблюдается активация механизмов врожденного иммунного ответа. При наличии минорного аллеля гена синтазы окиси азота у пациентов с ХО показатели врожденного иммунного ответа также демонстрируют активацию, но по показателям стимулированного НСТ-теста и соотношению НСТстим./НСТспонт. можно судить о большем бактерицидном потенциале фагоцитирующих клеток, чем в отсутствие мутации гена NOS3. Наблюдаются изменения в клеточном звене адаптивного иммунного ответа: увеличение количества CD4⁺-лимфоцитов (характерное для описторхозной инвазии) более выражено у пациентов с мутацией. Возможно, мутация гена NOS3 неблагоприятна для пациентов ХО, так как приводит к усилению иммунного реагирования на описторхозную инвазию.

Заключение

При гельминтозах реакция иммунной системы, направленная на защиту от инвазии, является одновременно одним из главных механизмов патогенеза: иммунологические реакции, переходя границы адекватного физиологического ответа, становятся иммунопатологическими [13], являясь причиной тяжелых органных поражений. Результаты проведенного исследования позволяют предположить, что мутации генов, ассоциированных с развитием гипертонии, могут влиять на иммунное реагирование организма в ответ на заражение возбудителем описторхоза — усиливать или ослаблять иммунный ответ. Выявление исследованных полиморфизмов генов, ассоциированных с развитием АГ, у пациенов с ХО позволит осуществлять индивидуальный подход в терапии.

About the authors

Svetlana A. Grigorieva

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Author for correspondence.
Email: info@Tniikip.rospotrebnadzor.ru

Researcher, Clinical and Experimental Immunology Group

Россия, Tyumen

K. B. Stepanova

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: info@Tniikip.rospotrebnadzor.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Director

Россия, Tyumen

T. F. Stepanova

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: info@Tniikip.rospotrebnadzor.ru

DSc (Medicine), Professor, Head Researcher

Россия, Tyumen

A. N. Ozerova

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: info@Tniikip.rospotrebnadzor.ru

Researcher, Molecular Genetic and Parasitological Research Group

Россия, Tyumen

I. V. Bakshtanovskaya

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: info@Tniikip.rospotrebnadzor.ru

PhD (Biology), Head of the Molecular Genetic and Parasitological Research Group, Scientific Secretary

Россия, Tyumen

G. A. Kalgina

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: info@Tniikip.rospotrebnadzor.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Head of the Clinical and Experimental Immunology Group

Россия, Tyumen

L. V. Kurlaeva

Tyumen Region Infection Pathology Research Institute

Email: info@Tniikip.rospotrebnadzor.ru

Junior Researcher, Clinical and Experimental Immunology Group

Россия, Tyumen

References

Supplementary files