Tumor infection with human herpes viruses and features of peripheral blood lymphocyte subset composition in patients with uveal melanoma

Full Text

Введение

Вирусы группы герпеса (HHV) — ДНК-содержащие вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина, вызывать пожизненную латентную инфекцию и реактивироваться в условиях ослабленного иммунитета. HHV-γ, обладают высоким онкогенным потенциалом, участвуют в росте и прогрессировании злокачественных опухолей различной локализации.

Так, роль вируса Эпшейна–Барр (EBV) в развитии лимфом Беркитта, Ходжкина, NK-/T-клеточной лимфомы назального типа, а также рака желудка и носоглотки подтверждена многочисленными исследованиями [18, 27]. Показано, что вирус герпеса человека 8 типа (HHV-8) является причиной ряда лимфопролиферативных заболеваний, саркомы Капоши, карциномы гортани и аденокарциномы (АК) предстательной железы [12, 28, 38]. Эффекты HHV α- и β-подгрупп (Herpes simplex virus (HSV-1, HSV-2), цитомегаловируса (CMV), вирус герпеса человека 6 типа (HHV-6) и др.), связанные с малигнизацией, продолжают активно изучаться.

Роль HHV в развитии глазной онкопатологии в настоящее время остается одним из малоизученных вопросов. В доступной литературе найдены единичные публикации, в которых приведены описания опухолей конъюнктивы и первичных витреоретинальных неходжкинских лимфом, ассоциированных с EBV [5, 25, 36]. Случай обнаружения геномов CMV и EBV в сочетании с Chlamydia trachomatis в материале пациента с увеальной меланомой представлен также в работе С.В. Саакян и соавт. [4].

Ежегодно в России фиксируется более 1000 случаев (на 100 тыс. населения) офтальмоонкологических заболеваний, среди которых наиболее распространенным является увеальная меланома (УМ) [3]. УМ происходит из меланоцитов сосудистой оболочки, наиболее часто локализуется в хориоидее (до 90%) и, значительно реже, в радужке и цилиарном теле.

Несмотря на то что в настоящее время разработаны высокотехнологичные современные методы лечения УМ, более чем у половины пациентов в короткие сроки развивается метастатическая болезнь, которая значительно ухудшает витальный прогноз [35].

Важным фактором, способствующим неопластической прогрессии, является ослабление системы иммунологического надзора и, в частности, нарушения в количественном и качественном составе основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови.

Действительно, в 1990-х гг. группами Kan-Mitchell J. с соавт. и Huang X.Q. с соавт. были обнаружены изменения количества циркулирующих цитотоксических лимфоцитов крови при меланоме кожи и увеального тракта [14, 17].

Несколько позднее появились данные, свидетельствующие об ассоциации роста УМ со сдвигами более широкого состава иммунокомпетентных клеток, вовлекающими также звено хелперов/индукторов, минорную популяцию «дубль-позитивных» Т-клеток и натуральные киллеры (CD16⁺CD56⁺) — основные лимфоциты врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в противоопухолевой и противовирусной защите.

В последние годы было показано, что реактивация и хроническое течение герпесвирусной инфекции при УМ, в отличие от пациентов с неонкологической патологией глаза и нормальной иммунологической реактивностью, сопровождается «неадекватными» сдвигами в составе эффекторных популяций лимфоцитов врожденного и адаптивного иммунитета, что может вести к ослаблению противоопухолевой защиты и способствовать злокачественному росту [1].

Взаимодействия в системе «вирус — клетки опухоли — иммунная защита организма» при УМ в силу методических трудностей, остаются все еще малоизученными, в то время как онкогенная роль вирусов — облигатных внутриклеточных паразитов неоспоримо доказана при целом ряде злокачественных новообразований.

На сегодняшний день большинство исследований сосредоточены на расшифровке иммуномодулирующих свойств микроокружения опухоли in situ и детальных механизмах опухольспецифического ответа.

Однако исследования, направленные на прямой поиск HHV в опухоли и возможных взаимосвязей ее инфицированности с качественным и количественным составом субпопуляций лимфоцитов крови при УМ, не проводились.

Цель: определение и анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у пациентов с УМ в зависимости от инфицированности материала опухолей вирусами герпеса человека (HHV).

Материалы и методы

В исследование вошли 99 пациентов (57 женщин и 42 мужчины в возрасте от 18 до 83 лет) с опухолями увеального тракта, находившихся на лечении в Отделе офтальмоонкологии ФГБУ НМИЦ Глазных болезней им. Гельмгольца.

Диагноз ставился на основании данных стандартных и специализированных офтальмологических методов обследования. Средний уровень проминенции опухоли (по данным эхографии) составил 6,1±3,0 мм, а диаметр основания — 15,7±2,1 мм. Всем пациентам проведена энуклеация пораженного глаза с последующим патогистологическим исследованием. У 98 пациентов диагностирована УМ (99%), в одном случае морфология опухоли соответствовала аденокарциноме пигментного эпителия сетчатки (АПЭС).

Материал опухоли помещался в криопробирки типа Eppendorf и хранился в камере глубокой заморозки при температуре –70°C до проведения исследований.

В биоматериале опухоли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) (термоциклер «CFX96», Bio-Rad Laboratories, Inc., США) проводилось определение генома HSV-1,2, VZV, CMV, EBV, вирусов HHV-6, HHV-8 согласно инструкциям фирмы-производителя. Для постановки ПЦР-РВ использовали коммерческие тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).

Забор крови проводился в утреннее время до энуклеации в вакуумные пробирки со стабилизатором К3ЭДТА (Zhejiang Gongdong Medical Technology Co., Ltd., КНР).

Иммунофенотипирование субпопуляций лимфоцитов в цельной крови (ЦК) пациентов и здоровых доноров выполнялось методом лазерной цитофлуориметрии на проточном цитометре «BD FACS Canto II» (Becton Dickinson, CША) с использованием системы моноклональных антител «Multitest 6-Color TBNK Reagent» в пробирках «BD Tru Сount» (Becton Dickinson, CША). В программе Canto (Becton Dickinson, CША) определяли относительное и абсолютное содержание Т-лимфоцитов (CD3⁺), Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺CD8^–), T-цитотоксических (CD3⁺CD4^–CD8⁺), T-дубль позитивных (CD3⁺CD4⁺CD8⁺), NK-клеток (CD16⁺CD56⁺), В-лимфоцитов (CD19⁺), рассчитывался индекс (CD4⁺/CD8⁺), отражающий баланс хелперов и цитотоксических Т-клеток.

В группу контроля вошли 33 здоровых человека без признаков офтальмопатологии, сопоставимых по возрасту и полу с пациентами основных групп.

Всего исследована 231 проба биоматериала: ткани опухоли (n = 99) и цельная кровь (n = 132).

Статистическая обработка данных выполнена в программах «Biostatd», «Exсel» (t-критерий Стьюдента, уровень статистической значимости: p < 0,05). Количественные данные представлены в виде М±m (М — среднее значение, m — ошибка среднего значения).

Результаты

ДНК HHV обнаружена в материале опухоли 11,3% пациентов (n = 11): при этом наиболее часто, в 72,7% случаев (n = 8), определялся геном EBV, существенно реже, в 18,2% проб (2 человека), — HHV-6. В 1 случае (при АПЭС) выявлено сочетанное инфицирование EBV и HHV-6. По результатам ПЦР-обследования в зависимости от инфицированности опухоли пациентов распределили на 2 группы: I группа — HHV+ и II группа — HHV–.

Результаты исследования крови пациентов основных групп показали, что средние значения абсолютного количества лимфоцитов (CD45⁺) были примерно одинаковыми (2,1±0,08 × 10⁹/л HHV–; 2,2±0,2 × 10⁹/л HHV+) (табл.).

 

Таблица. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови здоровых добровольцев и пациентов с УМ в зависимости от инфицированности материала опухоли (М±m)

Table. Peripheral blood lymphocyte subset composition in healthy volunteers and patients with uveal melanoma based on tumor material HHV infection (M±m)

Показатель Factors	Единица измерения Unit	Исследуемые группы | Groups
		Контроль Control (n = 33)	Пациенты с УМ | Patients with UM (n = 99)
			Наличие генома HHV в материале опухоли HHV genome detected in tumor material
			HHV+ (n = 11)	HHV – (n = 88)
Лимфоциты CD45+ Lymphocytes CD45+	× 109/л	2,06±0,11	2,2±0,2	2,1±0,08
Т-лимфоциты общая популяция CD3+ Т lymphocytes (total population) CD3+	%	73,1±0,87	77,64±1,18*#	71,18±0,86
	× 109/л	1,51±0,08	1,7±0,15	1,51±0,066
Т-хелперы CD3+CD4+ Т helphers CD3+CD4+	%	45,7±1,19	49,5±2,06	45,01±0,98
	× 109/л	0,97±0,06	1,12±0,13	0,97±0,05
Т-цитотоксические CD3+CD8+ Cytotoxic T lymphocytes CD3+CD8+	%	25,6±1,04	28,37±2,5	26,7±0,83
	× 109/л	0,52±0,03	0,6±0,06	0,6±0,03
Т-«дубль-позитивные» лимфоциты CD3+CD4+CD8+ “Double positive” lymphocytes CD3+CD4+CD8+	%	0,54±0,31	1,19±0,23*	1,25±0,15*
	× 109/л	0,009±0,007	0,026±0,005*	0,027±0,004*
В-лимфоциты CD19+ В lymphocytes CD19+	%	12,8±0,63	12,4±1,32	13,3±0,65
	× 109/л	0,24±0,02	0,29±0,05	0,29±0,02
Натуральные киллеры CD16+CD56+ Natural killers CD16+CD56+	%	14±0,87	9,49±1,33*#	15,06±0,8
	× 109/л	0,29±0,03	0,2±0,03	0,29±0,015
Отношение CD4+/CD8+ CD4+/CD8+ ratio		1,95±0,12	1,95±0,25	1,84±0,07

Примечание. N — количество обследуемых в группе; * — достоверность различия параметров у пациентов исследуемых групп по сравнению с группой контроля (р < 0,05); ^# — достоверность различия параметров у пациентов основных исследуемых групп (р < 0,05).

Note. N — number of subjects per group; * — significant differences for test group patient parameters compared with control group (p < 0.05); ^# — significant differences for patient parameters in main test groups (p < 0.05).

 

При анализе средних значений общей субпопуляции Т-клеток (CD3⁺) обнаружили повышение как относительного до 77,64±1,18%, так и абсолютного (1,7±0,15 × 10⁹/л) ее содержания у пациентов HHV+ в сравнении как с контрольной группой доноров без офтальмопатологии (73,1±0,87%, p < 0,05; 1,51±0,08 × 10⁹/л), так и с группой без ДНК возбудителя в ткани опухоли (71,18±0,86%, p < 0,05; 1,51±0,07 × 10⁹/л). Повышение CD3⁺ лимфоцитов в HHV+ группе было обусловлено, главным образом, подъемом абсолютного (1,12±0,13 × 10⁹/л) и относительного (49,5±2,06%) количества Т-хелперов/индукторов (CD3⁺CD4⁺), отличавшим ее как от контроля (0,97±0,06 × 10⁹/л; 45,7±1,19%), так и от группы пациентов с неинфицированными опухолями (0,97±0,05 × 10⁹/л; 45,01±0,98%). Содержание цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺) у пациентов обеих групп было практически одинаковым (0,6±0,06 × 10⁹/л; 0,6±0,03 × 10⁹/л) и незначительно отличалось от такового у контрольной группы (0,52±0,03 × 10⁹/л), это касается как абсолютных, так и относительных значений.

Индивидуальный анализ частоты сдвигов от нормы показал, что у 36,4% пациентов с инфицированными опухолями относительное количество Т-клеток (CD3⁺) было выше нормальных значений, тогда как у пациентов с HHV– опухолями такие изменения в содержании указанной субпопуляции наблюдались в 3 раза реже (11,4%). Данная тенденция сохранялась по отношению к Т-хелперам/индукторам и цитотоксическим лимфоцитам (рис.).

 

Рисунок. Частота случаев (%) сдвигов от нормы (здоровых доноров) в (суб)популяционном составе лимфоцитов крови (относительное и абсолютное количество) и клеточного соотношения CD4⁺/CD8⁺ у пациентов с HHV+ (А) и HHV– (Б) тканью УМ

 

В крови пациентов I группы (с присутствием ДНК вирусов в ткани опухоли) наиболее часто выявлялся дисбаланс основных регуляторных популяций хелперов-индукторов/цитотоксических лимфоцитов, который заключался в увеличении соотношения CD4⁺/CD8⁺. Так, если в группе HHV– только в 15,9% случаев отмечалось повышение CD4⁺/CD8⁺ относительно нормы, то в группе HHV+ данные сдвиги выявлялись в 2,3 раза чаще (36,4%). Относительное и абсолютное количество «дубль-позитивных» Т-клеток (CD3⁺CD4⁺CD8⁺) было повышено у пациентов обоих групп (0,026±0,005 × 10⁹/л, p < 0,05; 0,027±0,004 × 10⁹/л, p < 0,05) в сравнении с группой контроля (0,009±0,007 × 10⁹/л), что подтверждает ранее опубликованные данные и согласуется с исследованиями других ученых. При этом индивидуальный анализ частоты сдвигов от нормы показал, что в группе HHV+ практически в 2 раза чаще (54,5%) встречаются пациенты с повышенными значениями абсолютного количества «дубль-позитивных» лимфоцитов, чем в группе HHV– (28,4%). Увеличение количества CD3⁺CD4⁺CD8⁺ клеток в крови онкологических пациентов, а также больных аутоиммунными и инфекционными заболеваниями описано в целом ряде работ [6, 32, 33].

Обращает внимание достоверное снижение относительного количества NK-клеток (10±1,3%) у пациентов подгруппы HHV+ по сравнению как с контрольной (14±0,87%, p < 0,05), так и с группой пациентов с HHV– опухолями (15±0,8, p < 0,05). При индивидуальном анализе частоты сдвигов от нормы у 25% пациентов с инфицированными опухолями абсолютное и относительное количество NK-клеток также было снижено, тогда как в крови у пациентов с HHV– опухолями, наоборот, отмечалось повышение относительного (23,9%) и абсолютного (4,5%) содержания клеток указанной популяции.

Обсуждение

По результатам нашего исследования инфицированность опухолей увеального тракта составила 11,3%, при этом практически в 73% из них была обнаружена ДНК EBV. В течение жизни EBV сохраняется в эпителиальных клетках и В-лимфоцитах, реализуя два основных сценария течения инфекции — латентную и литическую [11]. В-лимфоциты поддерживают вирус в латентной форме, экспрессируя шесть ядерных антигенов (EBNA) и два латентных мембранных белка (LMP), что обеспечивает его уклонение от системы иммунологического надзора. В латентно инфицированных ВЭБ-положительных клетках вирус может реактивироваться и перейти к продуктивной фазе жизнедеятельности, называемой литическим циклом. Во время литической репликации EBV поочередно экспрессирует до 80 генов, что приводит к образованию новых вирусных частиц, гибели инфицированной клетки и распространению вируса по организму [19].

В литературе описаны исследования, подтверждающие способность EBV инфицировать клетки эндотелия сосудов и активировать внутриклеточные белки-ингибиторы апоптоза [16, 24]. Бесконтрольный рост сосудов опухоли, поддерживаемый в том числе EBV, способствует ее питанию и росту, а также повышает риск метастазирования за счет увеличения проницаемости сосудистой стенки. Роль EBV в развитии метастатической болезни при УМ еще предстоит изучить, однако ряд уже проведенных исследований указывает на то, что вирус способствует метастазированию других опухолей, например, назофарингеальной карциномы [13, 21]. Два паттерна развития инфекции EBV обуславливают различные варианты взаимодействия между вирусом и клеткой, а также локальный и системный иммунный ответ. Ослабление контроля со стороны иммунной системы приводит к трансформации зараженной клетки, в том числе онкогенного характера. Считается, что EBV является причиной 1% (до 200 000 случаев ежегодно) злокачественных новообразований человека [39]. По данным литературы, до 90% населения земного шара инфицировано EBV, однако развитие онкологического процесса, ассоциированного с вирусом, наблюдается лишь в исключительных случаях [15]. Очевидным фактором, объясняющим столь редкое распространение онкологических заболеваний, вызванных EBV, у здоровых инфицированных людей, является наличие мощного иммунного ответа на вирус, в частности, опосредованного Т-клеточным звеном иммунитета.

Реакция иммунной системы на трансформированную клетку и своевременное ее уничтожение лежит в основе противоопухолевого иммунного ответа. Распознавание генетически измененной клетки запускает сигнальный каскад в лимфоцитах, сопровождающийся выработкой цитокинов, позволяющих избежать противоопухолевой толерантности иммунной системы. Дендритные клетки захватывают белки — продукты онкогенеза и предоставляют их Т-лимфоцитам на молекулах гистосовместимости MHC I и MHC II, активируя ответ эффекторных Т-клеток против канцер-специфических антигенов [8]. В литературе описаны исследования, указывающие на способность клеток УМ блокировать активирующую функцию дендритных клеток, в частности, продукцию ими цитокинов и активацию Т-лимфоцитов [23].

Онкологическая трансформация, запущенная EBV, подавляет противоопухолевые механизмы клетки, так как экспрессия латентных генов вируса сопряжена с перестройками в матричной РНК клетки-хозяина и препятствует синтезу защитных белков (p53, p63, p73) [7]. В данных условиях адекватный системный противоопухолевый иммунный ответ в случае вирус-положительных опухолей становится практически единственным способом защитить организм от бесконтрольного роста трансформированных клеток. В связи с этим изучение субпопуляционного состава лимфоцитов и их роли в элиминации опухолевых клеток актуально для разных видов опухолей, особенно инфицированных различными возбудителями. В публикациях отечественных и зарубежных авторов описано повышение CD3⁺CD4⁺ лимфоцитов (Т-хелперов) у пациентов с различными видами опухолей [2, 37]. Т-хелперы/индукторы играют важную роль в иммунной защите и борьбе с вирусными инфекциями и раком, они участвуют в передаче цитокиновых сигналов и создании оптимальных условий для правильного функционирования других иммунных клеток, таких как макрофаги, В-клетки и цитотоксические Т-лимфоциты. В нашем исследовании увеличение общего количества Т-лимфоцитов в 3 раза чаще встречалось у пациентов с HHV+ опухолью, при этом повышение средних значений общей популяции происходило за счет увеличения CD3⁺CD4⁺ клеток. Известно, что активированные CD4⁺ клетки играют важную роль в контроле EBV, особенно в клетках с латентностью I типа, где вирус синтезирует белок EBNA1, обеспечивающий устойчивость вирусной эписомы в опухолевых клетках [20, 26]. Более того, литическая активность EBNA1-специфичных CD4⁺ Т-клеток против трансформированных вирусом опухолевых клеток наблюдалась при всех EBV-опосредованных злокачественных новообразованиях, включая лимфому Беркитта [30].

Анализ результатов исследования показал повышение количества средних значений «дубль-позитивных» Т-лимфоцитов в обеих группах. Ранее сдвиги в этой популяции были отмечены у пациентов с различными злокачественными новообразованиями, в том числе с меланомой кожи [31]. Однако накопление минорной популяции, в случае кожной меланомы, обнаруживали именно в инфильтрате опухоли, тогда как в периферической крови увеличение количества CD3⁺CD4⁺CD8⁺ не наблюдалось. Наши результаты согласуются также с ранее полученными данными при УМ больших размеров [1]. Натуральные киллеры (NK-клетки, CD16⁺CD56⁺) относятся к эффекторным клеткам врожденного иммунитета и составляют от 5% до 15% от общей популяции циркулирующих лимфоцитов. NK-лимфоциты выполняют множество биологических функций, обладают прямой цитотоксичностью в отношении инфицированных вирусом и онкотрансформированных клеток [10]. Увеличение количества натуральных киллеров, как и их миграция в опухолевый инфильтрат, при онкологическом процессе закономерно и неоднократно описано [34]. В наше работе обнаружено снижение относительного количества NK-клеток (CD16⁺CD56⁺) в периферической крови у пациентов с HHV+ опухолями, тогда как у остальных пациентов отмечалось нормальное или увеличенное их количество. Известно, что прогрессирование EBV инфекции связано, в том числе, с недостаточным количеством натуральных киллеров или с угнетением их функции [9, 29]. Более того, вирус, ограничивая экспрессию литических генов, защищает инфицированную клетку от NK-опосредованного уничтожения за счет повышенной устойчивости к апоптозу [22]. Не исключено, что снижение количества NK-клеток в периферической крови связано с их прямой цитотоксической функцией и миграцией в очаг роста опухоли и локального размножения бактерий и вирусов, в том числе EBV.

Заключение

Анализ результатов исследования показал, что в 70% случаев в инфицированном опухолевом материале (HHV+) при УМ выявлялся геном EBV.

У пациентов с HHV+ опухолями обнаружены характерные качественные и количественные сдвиги в составе лимфоцитов периферической крови, которые затрагивали преимущественно популяции Т- и NK-клеток:

а) повышение относительного содержания популяции CD3⁺ лимфоцитов, обеспеченное, главным образом, увеличением доли Т-хелперов и закономерный рост соотношения CD4⁺/CD8⁺, указывают на тесные патогенетические взаимосвязи Т-клеточного звена иммунитета с функционированием вирус-ассоциированной опухоли;

б) более частое выявление сниженного количества циркулирующих естественных киллеров не позволяет исключить миграцию CD16⁺ CD56⁺ лимфоцитов из кровяного русла в опухолевый очаг, содержащий вирус, а также прямое влияние EBV на данные клетки, являющиеся ключевыми элементами системы иммунного надзора за опухолями.

About the authors

Elena V. Svetlova

Moscow Helmholtz Research Сentre of Eye Diseases

Author for correspondence.
Email: qr888@ya.ru

Virologist, Laboratory of Virology and Microbiology, Department of Immunology and Virology

Россия, Moscow

N. V. Balatskaya

Moscow Helmholtz Research Сentre of Eye Diseases

Email: qr888@ya.ru

PhD (Biology), Leading Researcher, Head of the Department of Immunology and Virology

Россия, Moscow

I. G. Kulikova

Moscow Helmholtz Research Сentre of Eye Diseases

Email: qr888@ya.ru

Biologist, Laboratory of Virology and Microbiology, Department of Immunology and Virology

Россия, Moscow

S. V. Saakyan

Moscow Helmholtz Research Сentre of Eye Diseases

Email: qr888@ya.ru

RAS Corresponding Member, DSc (Medicine), Professor, Head of the Department of Ophthalmooncology and Radiology

Россия, Moscow

I. V. Svirina

Moscow Helmholtz Research Сentre of Eye Diseases

Email: qr888@ya.ru

PhD Student, Department of Ophthalmooncology and Radiology

Россия, Moscow

A. E. Andryushin

Moscow Helmholtz Research Сentre of Eye Diseases

Email: qr888@ya.ru

Researcher, Department of Immunology and Virology

Россия, Moscow

E. B. Myakoshina

Moscow Helmholtz Research Сentre of Eye Diseases

Email: qr888@ya.ru

DSc (Medicine), Researcher, Department of Ophthalmooncology and Radiology

Россия, Moscow

References

Supplementary files