Evaluating peripheral blood lymphocyte subset composition and lipopolysaccharide-induced cytokine secretory activity in mononuclear leukocyte cultures from patients with febrile and meningeal forms of tick-borne encephalitis

Full Text

Введение

Клещевой энцефалит (КЭ) — это самая распространенная на территории России, в особенности в Западной Сибири, природно-очаговая арбовирусная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя, клинически преимущественно протекающая в виде лихорадочной формы (ЛФ), а также с возможностью поражения ЦНС и развитием менингеальной или очаговой форм (МФ или ОФ) болезни [2].

Исследования закономерностей иммунного ответа у больных КЭ, которые в основном ограничены определением различных параметров цитокинового статуса в сыворотке периферической крови пациентов, проведенные различными авторами, показали противоречивые результаты [3, 6, 7, 12, 23]. Кроме того, в литературе недостаточно информации об изменениях спонтанной и митоген-индуцированной секреции цитокинов в клеточных культурах лейкоцитов, полученных от больных КЭ в зависимости от различных клинических форм КЭ [3]. Известно, что общий иммунорегуляторный эффект цитокинов связан с их сложным сетевым взаимодействием, когда усиление секреции одних цитокинов может сопровождаться подавлением синтеза других, что во многом определяет особенности клинического течения заболевания [4].

Как известно, оценка функциональной активности иммунитета может проводиться с использованием культуральных методов, преследующих оценку продукции цитокинов и интенсивности пролиферации лимфоцитов периферической крови в ответ на стимуляцию клеток различными неспецифическими поликлональными митогенами растительного или бактериального происхождения, что в условиях in vitro позволяет получить информацию о реактивности клеточных факторов иммунитета у пациентов в динамике в зависимости от биологических свойств возбудителя, клинической формы и тяжести течения изучаемой патологии, включая бактериальные и вирусные инфекции, островоспалительные или аутоиммунные заболевания [4].

Одним из широко применяемых митогенов является липополисахарид (ЛПС), представляющий собой основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который используется для оценки в условиях in vitro состоятельности преимущественно факторов врожденного иммунитета [4]. Основными рецепторами распознавания ЛПС являются Toll-подобные рецепторы (TLR)4 при участии CD14, активация которых посредством транскрипционного ядерного фактора каппа (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells, NF-κB) инициирует экспрессию генов интерлейкинов (IL)-1β, IL-6, IL-12, фактора некроза опухоли (TNF)-α, а также хемокинов — хемоаттрактантного белка моноцитов (MCP)-1 (CCL2) и IL-8 (CXCL8), обладающих провоспалительными свойствами [14, 17].

Показано, что различные вирусы и их антигены по-разному взаимодействуют с мононуклеарными лейкоцитами, стимулированными ЛПС, что позволяет изучать особенности врожденного иммунного ответа при этих заболеваниях. В частности, нейраминидаза вируса гриппа усиливает ЛПС-стимулированную экспрессию NF-κB и гиперпродукцию провоспалительных цитокинов врожденного иммунного ответа, что может способствовать развитию «цитокинового шторма» и повреждению легких [19]. В то же время герпесвирусы способны устанавливать персистентную инфекцию, благодаря стратегии уклонения от иммунитета, в том числе за счет подавления механизмов врожденного иммунного ответа [15]. Известно, что РНК вируса КЭ распознается TLR3, TLR7 и TLR8, что стимулирует экспрессию генов провоспалительных цитокинов — IL-1β и TNFα, а также секрецию интерферонов (IFN) типа I, запуская реакции врожденного иммунитета [18]. Особенности врожденного иммунного ответа на вирус КЭ изучены недостаточно, хотя предполагают, что от этого зависит клиническое течение заболевания и риск диссеминации возбудителя в ЦНС с развитием более тяжелых форм инфекции [13, 18].

Целью исследования было изучение особенностей изменений субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и активности спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции цитокинов в культурах мононуклеарных лейкоцитов у больных с ЛФ и МФ острого КЭ.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 28 больных с ЛФ и МФ острого КЭ, госпитализированных в первую неделю болезни в инфекционную клинику Сибирского государственного медицинского университета (СибГМУ) Минздрава России. У всех пациентов диагноз среднетяжелого течения ЛФ или МФ КЭ был подтвержден данными эпидемиологического анамнеза, клинического и клинико-лабораторного обследования, включая исследование спинномозговой жидкости (СМЖ), и сформулирован в соответствии с клинической классификацией [2]. Лабораторная верификация диагноза проводилось с помощью определения коэффициентов позитивности (КП) для специфических иммуноглобулинов (Ig) классов M и G к вирусу КЭ методом иммуноферментного анализа (ИФА) в день госпитализации пациентов и через 14 дней с использованием тест-систем АО «Вектор-Бест» (Россия). Кроме того, у всех обследованных больных на основании отрицательных результатов определения специфических IgM и IgG к Borrelia burgdorferi s.l. в ИФА, а также ДНК Borrelia miyamotoi и Anaplasma phagocytophilum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (наборы АО «Вектор-Бест», Россия), были исключены иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), возвратная клещевая лихорадка и гранулоцитарный анаплазмоз человека. Вышеперечисленные методы ИФА также были применены в контрольной группе условно-здоровых доноров для исключения лиц, сероположительных по клещевым инфекциям.

Письменное добровольное информированное согласие дали все участники исследования. Проведение исследования получило одобрение этического комитета СибГМУ Минздрава России (протоколы № 9119/1 от 30.05.2022 г. и № 9568 от 30.10.2023 г.).

Группа больных ЛФ КЭ включала 16 пациентов (7 мужчин и 9 женщин; средний возраст: 47,0±3,2 лет), а группа с МФ КЭ состояла из 12 пациентов (5 мужчин и 7 женщин; средний возраст: 43,5±2,4 лет). Контролем послужили 13 условно-здоровых доноров крови, сопоставимых с основными группами по полу и возрасту (6 мужчин и 7 женщин; средний возраст: 46,3±2,2 лет).

Критерии включения пациентов с КЭ в исследование: поступление в стационар в первую неделю от начала болезни, подтверждение диагнозов ЛФ или МФ острого КЭ, исключение других клещевых инфекций, возраст от 20 до 60 лет. Критериями исключения были беременность, сопутствующая инфекционная (ВИЧ-инфекция, туберкулез и др.) и/или декомпенсированная фоновая соматическая патология.

Материалом для исследования служили пробы венозной крови, которые для определения субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови и лейкоцитарной формулы брали однократно при госпитализации в первые семь дней болезни, а для оценки продукции цитокинов в первичной культуре мононуклеарных клеток получали дважды — при поступлении в стационар и через 2 недели при выписке (после курса терапии).

Метод иммунофенотипирования лимфоцитов с применением флуоресцентно-меченых моноклональных антител (Elabscience, KHP) и последующим многоцветным цитометрическим анализом на проточном цитофлуориметре «Accuri C6» (BD Biosciences, США) был использован для определения абсолютного количества и относительного числа В-лимфоцитов CD19⁺CD3^–, Т-лимфоцитов CD3⁺CD19^–, Т-хелперов/индукторов CD3⁺CD4⁺CD45⁺, Т-цитотоксических лимфоцитов CD3⁺CD8⁺CD45⁺ и натуральных киллеров — NK-клеток CD3^–CD56⁺CD45⁺.

Первичные культуры мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из венозной крови методом градиентного центрифугирования на фиколле (ООО «БиолоТ», Россия), были получены для оценки спонтанной и ЛПС-стимулированной секреции TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-8 и MCP-1 методом ИФА в образцах кондиционной среды с помощью наборов АО «Вектор-Бест» (Россия). Кроме того, рассчитывали индекс стимуляции (ИС) как отношение показателя интенсивности митоген-стимулированной продукции цитокина в культуральной жидкости к соответствующему спонтанному уровню. Культивирование клеток осуществляли в полной питательной среде на основе RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», Россия) без применения митогена для оценки уровней спонтанной продукции цитокинов или после стимуляции 10 нг/мл бактериальным ЛПС Escherichia coli (Servicebio, КНР) в СО₂-инкубаторе HF90 (Heal Force, КНР) при 37°С и 5% концентрации СО₂ в течение 24 ч.

Статистическую обработку результатов проводили с применением STATISTICA 12.0 (StatSoft, США). Данные были представлены как медиана (Mе) и первый и третий квартили (Q1; Q3), поскольку они не подчинялись нормальному закону распределения в тесте Шапиро–Уилка. Статистический анализ различий между не связанными выборками выполняли при помощи U-критерия Манна–Уитни [5]. Для статистического анализа параметров в связанных группах в динамике применялся критерий Вилкоксона. Ранговая корреляция Спирмена была использована для корреляционного анализа. При уровне значимости р < 0,05 различия двух сравниваемых величин считали статистически значимыми.

Результаты

Установлено (табл. 1), что в начале заболевания уровни спонтанной продукции провоспалительных цитокинов IL-1β и TNFα, а также хемокина MCP-1 (CCL2) в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов, полученных от больных с ЛФ КЭ, были существенно выше, чем у больных с МФ КЭ (p = 0,017, p = 0,035, p = 0,035), а также по сравнению с соответствующими показателями в группе условно-здоровых лиц (p = 0,009, p = 0,018, p < 0,001). Уровни базальной продукции IL-6 в культуральной жидкости мононуклеарных лейкоцитов у пациентов с ЛФ КЭ в первую неделю болезни оказались достоверно выше, чем у здоровых доноров (p = 0,035), однако существенных различий этого показателя от группы больных с МФ обнаружено не было (p > 0,05). Кроме того, у больных с МФ КЭ уровни спонтанной секреции мононуклеарными клетками IL-1β, IL-6 и TNFα статистически значимо не отличались от соответствующих параметров в группе контроля (p > 0,05 во всех случаях), что, по-видимому, свидетельствовало о подавлении продукции этих цитокинов в случае клинически более тяжелой формы заболевания.

 

Таблица 1. Результаты оценки спонтанной и липополисахарид-стимулированной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови больных с лихорадочной и менингеальной формами клещевого энцефалита в начале болезни и в динамике через 2 недели, Mе (Q1; Q3)

Table 1. Assessment of spontaneous and lipopolysaccharide-stimulated cytokine production in the peripheral blood mononuclear cell cultures from patients with febrile and meningeal tick-borne encephalitis at disease onset and two weeks later, Mе (Q1; Q3)

Параметр Parameter		Больные клещевым энцефалитом Patients with tick-borne encephalitis		Здоровые доноры Healthy donors n = 13
		Лихорадочная форма Febrile form n = 16	Менингеальная форма Meningeal form n = 12
IL-1β	сп. I, пг/мл sp. I, pg/ml	106,4 (23,4; 314,9) p1 = 0,009	11,4 (2,29; 51,3) p2 = 0,017	20,5 (9,6; 25,0)
	сп. II, пг/мл sp. II, pg/ml	322,9 (294,3; 334,0) p1 < 0,001; p3 = 0,005	25,4 (6,50; 281,8) p1 = 0,044; p2 < 0,001; p3 = 0,025
	ст. I, пг/мл st. I, pg/ml	349,5 (343,5; 368,3) p1 < 0,001	353,9 (340,9; 368,4) p1 < 0,001	165,0 (110,0;230,0)
	ст. II, пг/мл st. II, pg/ml	357,6 (348,4; 369,6) p1 < 0,001	350,5 (340,6; 378,5) p1 < 0,001
	ИС I ratio I	4,80 (1,17; 14,8)	29,9 (1,15; 84,1) p1 = 0,009; p2 = 0,007	7,92 (6,11; 10,00)
	ИС II ratio II	1,12 (1,06; 1,27) p1 < 0,001; p3 = 0,005	14,3 (1,31; 59,2) p1 = 0,001; p2 < 0,001
IL-6	сп. I, пг/мл sp. I, pg/ml	298,0 (278,6; 436,9) p1 = 0,035	366,2 (102,3; 407,5)	220,2 (92,2; 353,2)
	сп. II, пг/мл sp. II, pg/ml	570,9 (348,7; 573,7) p1 < 0,001	170,1 (154,3; 270,2) p2 < 0,001
	ст. I, пг/мл st. I, pg/ml	570,8 (563,0; 574,6) p1 < 0,001	501,4 (485,8; 504,2) p2 < 0,001	500,4 (495,8; 501,1)
	ст. II, пг/мл st. II, pg/ml	574,7 (564,3; 586,6) p1 = 0,001	495,0 (492,9; 495,7) p2 < 0,001
	ИС I ratio I	1,90 (1,44; 2,03)	1,32 (1,23; 4,95) p1 = 0,045; p2 < 0,001	2,25 (1,42; 5,43)
	ИС II ratio II	1,02 (0,99; 2,75) p1 = 0,043	1,84 (1,63; 2,91)
IL-8	сп. I, пг/мл sp. I, pg/ml	180,6 (119,9; 207,7)	351,3 (287,5; 420,4) p1 < 0,001; p2 < 0,001	78,1 (58,6; 344,9)
	сп. II, пг/мл sp. II, pg/ml	154,8 (94,4; 178,7) p3 = 0,009	403,6 (375,8; 430,3) p1 < 0,001; p2 < 0,001
	ст. I, пг/мл st. I, pg/ml	199,3 (186,9; 213,0) p1 < 0,001	447,7 (415,0; 449,5) p2 < 0,001	450,7 (445,0; 453,3)
	ст. II, пг/мл st. II, pg/ml	189,0 (180,5; 201,1) p1 < 0,001	446,0 (444,0; 447,90) p2 < 0,001
	ИС I ratio I	1,78 (0,93; 1,87) p1 < 0,001	1,28 (1,06; 1,79) p1 < 0,001	5,78 (1,31; 7,59)
	ИС II ratio II	1,15 (1,03; 6,64) p3 = 0,002	1,11 (1,03; 1,17) p1 = 0,002; p3 = 0,005
MCP-1	сп. I, пг/мл sp. I, pg/ml	3519,0 (680,4; 4532,0) p1 < 0,001	761,5 (159,5; 2534,0) p1 < 0,001; p2 = 0,035	213,1 (118,1;1520,3)
	сп. II, пг/мл sp. II, pg/ml	3430,0 (2412,0; 5150,0) p1 < 0,001	1057,0 (257,1; 3849,0) p1 < 0,001; p3 = 0,034
	ст. I, пг/мл st. I, pg/ml	4470,5 (2448,0; 4687,0) p1 < 0,001	2757,0 (880,5; 3907,0) p1 < 0,001; p2 = 0,040	1104,4 (328,9; 1453,7)
	ст. II, пг/мл st. II, pg/ml	1870,5 (1658,0; 2034,0) p1 < 0,001; p3 = 0,002	2130,5(1639,0;3129,0) p1 < 0,001
	ИС I ratio I	1,24 (0,64; 6,31) p1 < 0,001	3,38 (0,45; 18,2)	9,20 (4,43; 17,2)
	ИС II ratio II	0,59 (0,32; 0,72) p1 < 0,001	2,15 (0,43; 18,1) p2 < 0,001
TNFα	сп. I, пг/мл sp. I, pg/ml	20,1 (5,12; 40,8) p1 = 0,018	11,1 (3,36; 11,9) p2 = 0,035	3,31 (2,15; 12,5)
	сп. II, пг/мл sp. II, pg/ml	20,0 (13,6; 45,9) p1 = 0,005	49,6 (38,5; 50,9) p1 < 0,001; p2 = 0,025; p3 = 0,012
	ст. I, пг/мл st. I, pg/ml	614,3 (591,9; 624,7) p1 < 0,001	345,3 (330,1; 351,2) p2 < 0,001	334,4 (323,8; 335,4)
	ст. II, пг/мл st. II, pg/ml	620,4 (587,3; 663,8) p1 < 0,001	338,6 (330,1; 345,4) p2 < 0,001
	ИС I ratio I	67,8 (27,1; 123,2)	29,7 (29,6; 96,5) p1 = 0,023	95,2 (16,4; 150,7)
	ИС II ratio II	34,2 (18,0; 48,9) p1 < 0,001; p3 = 0,009	6,83 (6,42; 8,67) p1 < 0,001; p2 < 0,001; p3 = 0,013
IL-10	сп. I, пг/мл sp. I, pg/ml	41,2 (22,9; 75,7) p1 = 0,014	28,5 (12,9; 53,7) p1 = 0,015	9,36 (2,45; 12,7)
	сп. II, пг/мл sp. II, pg/ml	66,0 (30,9; 95,9) p1 < 0,001	12,3 (7,51; 15,1) p2 < 0,001; p3 = 0,012
	ст. I, пг/мл st. I, pg/ml	128,2 (67,9; 229,7) p1 = 0,043	112,2 (96,5; 135,0)	63,8 (43,5; 111,4)
	ст. II, пг/мл st. II, pg/ml	153,3 (53,1; 248,0) p1 = 0,031	143,2 (140,1; 149,8) p1 = 0,018
	ИС I ratio I	2,22 (1,67; 12,0) p1 = 0,019	7,49 (2,51; 10,4)	8,81 (3,62; 23,1)
	ИС II ratio II	2,10 (1,71; 2,58)	11,6 (9,4; 37,5) p2 < 0,001

Примечание. сп. — спонтанный уровень; ст. — стимулированный липополисахаридом уровень; ИС — индекс стимуляции; р₁ — уровень значимости различий при сравнении параметров между больными и здоровыми донорами, U-критерий Манна–Уитни; р₂ — уровень значимости различий при сравнении параметров между больными с лихорадочной и менингеальной формами клещевого энцефалита, U-критерий Манна–Уитни; р₃ — уровень значимости различий при сравнении параметров у больных в динамике в начале болезни и через 2 недели, критерий Вилкоксона.

Note. sp. — spontaneous level; st. — lipopolysaccharide-stimulated level; ratio — stimulated to basal level ratio; p₁ — a significance level for differences while comparing parameters between patients and healthy donors, Mann–-Whitney U-test; p₂ — a significance level for differences while comparing parameters between patients with febrile and meningeal tick-borne encephalitis, Mann–Whitney U-test; p₃ — a significance level for differences while comparing parameters in patients at disease onset and two weeks later, Wilcoxon test.

 

Изучение спонтанной продукции этих цитокинов в супернатантах культур мононуклеарных клеток через 2 недели показало, что в группе пациентов с ЛФ КЭ уровни IL-1β значительно повышались (p = 0,005), в то время как уровни IL-6, TNFα и MCP-1 не имели статистических значимых изменений в динамике, оставаясь, также как и концентрации IL-1β, выше соответствующих значений в контрольной группе (p < 0,001 во всех случаях, кроме p = 0,005 для TNFα). В группе больных МФ КЭ в динамике через 2 недели после курса терапии отмечалось существенное повышение уровней спонтанной секреции IL-1β, TNFα и MCP-1 (p = 0,025, p = 0,012 и p = 0,034 соответственно). Кроме того, концентрации этих цитокинов в культурах больных с МФ КЭ после курса терапии превышали соответствующие значения у условно-здоровых лиц (p = 0,044, p < 0,001 и p < 0,001 для IL-1β, TNFα и MCP-1 соответственно).

Вместе с тем в начале заболевания и через 2 недели в динамике уровни спонтанной продукции хемокина IL-8 (CXCL8), который вызывает активацию и дегрануляцию нейтрофилов, в супернатантах культур мононуклеарных клеток больных с МФ КЭ, в отличие от других провоспалительных цитокинов, оказались существенно выше, чем у больных с ЛФ КЭ и в контрольной группе (p < 0,001 во всех случаях).

Кроме того, в начале болезни у больных с ЛФ и МФ КЭ уровни спонтанной секреции иммуносупрессорного цитокина IL-10 были существенно выше, чем в контрольной группе (p = 0,014 и p = 0,015). Через 2 недели у больных ЛФ КЭ уровни продукции этого цитокина по-прежнему оставались повышенными по сравнению с контролем (p < 0,001), а у больных с МФ КЭ, напротив, были существенно ниже, чем у больных с ЛФ КЭ (p < 0,001), снижаясь в динамике (p = 0,012) до уровней, сопоставимых с значениями в группе условно-здоровых лиц (p > 0,05).

Стимуляция культур мононуклеарных лейкоцитов ЛПС у больных МФ КЭ в первую неделю заболевания приводила к существенному подавлению уровней секреции таких провоспалительных цитокинов врожденного иммунного ответа, как IL-6, MCP-1 и TNFα по сравнению с уровнями соответствующих параметров у пациентов с ЛФ КЭ (p < 0,001 во всех случаях, кроме p = 0,040 для MCP-1), что в отношении ЛПС-индуцированной продукции IL-6 и TNFα сохранялось неизменным в динамике и через 2 недели (p < 0,001 во всех случаях). Кроме того, у больных с МФ КЭ уровни ЛПС-стимулированной секреции IL-6 и TNFα не имели статистически значимых различий от контрольных значений, что также свидетельствовало о подавлении их продукции (p > 0,05). Вместе с тем в начале заболевания и в динамике после курса терапии в культурах мононуклеарных лейкоцитов группы пациентов с ЛФ КЭ уровни ЛПС-индуцированной продукции IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 и TNFα были значительно выше, чем в контроле (p < 0,001 во всех случаях для IL-1β, IL-6, MCP-1 и TNFα; p = 0,043, p = 0,031 для IL-10 соответственно). Напротив, ЛПС-индуцированная секреция IL-8 в клеточных культурах у пациентов с ЛФ КЭ была значительно подавлена по сравнению с больными МФ КЭ и контролем (p < 0,001 во всех случаях), а в группе пациентов с МФ не имела существенных отличий от условно-здоровых лиц (p > 0,05).

Кроме того, в группе пациентов с МФ КЭ в начале заболевания индексы стимуляции (ИС) для IL-8 (p < 0,001), IL-6 (p = 0,045) и TNFα (p = 0,023) были существенно ниже, а ИС MCP-1 не имел существенных различий (p > 0,05) от соответствующих параметров у условно-здоровых лиц, что, по-видимому, отражало угнетение продукции этих цитокинов в культурах мононуклеарных лейкоцитов у больных КЭ с менингеальным синдромом.

В табл. 2 приведены результаты оценки субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови больных с ЛФ и МФ КЭ в первую неделю заболевания. Наряду с этим показано, что больные с МФ КЭ по сравнению с ЛФ и с контрольной группой имели существенно более высокие значения общего количества лейкоцитов крови (p = 0,008 и p = 0,006), главным образом за счет повышения относительного и абсолютного числа нейтрофилов (p = 0,012, p = 0,026, p < 0,001, p < 0,001) в гемограмме. В периферической крови обеих групп пациентов с КЭ по сравнению с условно-здоровыми донорами было выявлено существенное снижение относительного числа лимфоцитов (p = 0,003 и p = 0,025), а в группе больных с ЛФ КЭ было обнаружено уменьшение абсолютного количества этих клеток (p = 0,031), что, по-видимому, прежде всего было обусловлено значительно более низкими уровнями относительного и абсолютного числа Т-цитотоксических CD3⁺CD8⁺CD45⁺ клеток у больных КЭ вне зависимости от клинической формы заболевания (p = 0,004, p = 0,002, p < 0,001 и p < 0,001). Кроме того, больные с ЛФ КЭ по сравнению с контролем имели существенное увеличение относительного числа NK-клеток CD3^–CD56⁺CD45⁺ (p < 0,001) в периферической крови. В то же время у больных с МФ КЭ отмечалось статистически значимое снижение относительного и абсолютного числа NK-клеток CD3^–CD56⁺CD45⁺ в крови по сравнению с больными с более легким течением ЛФ КЭ (p = 0,026, p = 0,003).

 

Таблица 2. Результаты оценки субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови больных с лихорадочной и менингеальной формами клещевого энцефалита, Mе (Q1; Q3)

Table 2. Assessment of peripheral blood lymphocyte subset composition in patients with febrile and meningeal tick-borne encephalitis, Mе (Q1; Q3)

Параметр Parameter	Больные клещевым энцефалитом Patients with tick-borne encephalitis		Здоровые доноры Healthy donors n = 13
	Лихорадочная форма Febrile form n = 16	Менингеальная форма Meningeal form n = 12
WBC, × 109/L	5,85 (4,82; 6,04)	10,3 (7,00; 12,3) p1 = 0,008; p2 = 0,006	5,76 (4,32; 5,90)
NEUT, %	56,70 (49,90; 64,15)	70,70 (63,70; 77,20) p1 < 0,001; p2 = 0,012	51,40 (47,50; 55,40)
NEUT, × 109/L	3,21 (3,17; 4,44)	5,49 (3,20; 5,63) p1 < 0,001; p2 = 0,026	2,83 (2,11; 3,51)
LYMP, %	22,8 (15,5; 25,3) p1 = 0,003	22,5 (17,1; 28,9) p1 = 0,025	36,0 (32,0; 37,0)
LYMP, × 109/L	1,38 (1,18; 1,44) p1 = 0,031	2,03 (0,98; 2,40)	2,08 (1,45; 2,18)
CD3+CD19–, %	66,8 (53,5; 79,7) p1 = 0,021	73,8 (67,5; 86,1)	80,3 (78,2; 82,0)
CD3+CD19–, × 109/L	0,94 (0,29; 1,09) p1 = 0,035	1,33 (0,75; 1,96)	1,70 (1,09; 1,71)
CD19+CD3–, %	2,90 (1,50; 12,7)	9,75 (7,59; 15,68)	9,07 (8,97; 9,80)
CD19+CD3–, × 109/L	0,07 (0,01; 0,17)	0,22 (0,09; 0,31) p2 = 0,030	0,16 (0,14; 0,19)
CD3–CD56+CD45+, %	17,4 (16,1; 45,0) p1 < 0,001	11,4 (8,0; 20,9) p2 = 0,026	11,0 (8,98; 12,9)
CD3–CD56+CD45+, 109/L	0,25 (0,23; 0,28)	0,16 (0,10; 0,18) p1 = 0,003; p2 = 0,003	0,21 (0,19; 0,26)
CD3+CD8+CD45+, %	21,1 (17,2; 23,1) p1 = 0,004	17,4 (11,3; 22,5) p1 = 0,002	31,0 (29,9; 32,1)
CD3+CD8+CD45+, × 109/L	0,27 (0,09; 0,34) p1 < 0,001	0,30 (0,15; 0,42) p1 < 0,001	0,62 (0,47; 0,70)
CD3+CD4+CD45+, %	49,5 (36,2; 58,5)	58,2 (46,5; 69,1)	49,3 (47,3; 51,1)
CD3+CD4+CD45+, 109/L	0,68 (0,20; 0,82)	0,92 (0,52; 1,44)	1,01 (0,66; 1,08)
ИС ratio	2,77 (2,10; 2,85)	3,27 (1,81; 4,25)	1,59 (1,54; 1,70)

Примечание. WBC — лейкоциты; NEUT — нейтрофилы; LYMP — лимфоциты; CD3⁺CD19^– — Т-лимфоциты; CD19⁺CD3^– — В-лимфоциты; CD3^–CD56⁺CD45⁺ — NK-клетки; CD3⁺CD4⁺CD45⁺ — Т-хелперы/индукторы; CD3⁺CD8⁺CD45⁺ — Т-цитотоксические лимфоциты; ИС — индекс соотношения (Т-хелперов к Т-цитотоксическим лимфоцитам); р₁ — уровень значимости различий при сравнении с параметров между больными и здоровыми донорами, U-критерий Манна–Уитни; р₂ — уровень значимости различий при сравнении с параметров между больными с лихорадочной и менингеальной формами клещевого энцефалита, U-критерий Манна–Уитни.

Note. WBC — leukocytes; NEUT — neutrophils; LYMP — lymphocytes; CD3⁺CD19^– — T lymphocytes; CD19⁺CD3^– — B lymphocytes; CD3^–CD56⁺CD45⁺ — NK cells; CD3⁺CD4⁺CD45⁺ — T helper/inducer cells; CD3⁺CD8⁺CD45⁺ — T-cytotoxic lymphocytes; ratio — T-helper to T-cytotoxic сells ratio; p₁ — a significance level for differences while comparing parameters between patients and healthy donors, Mann–Whitney U-test; p₂ — a significance level for differences while comparing parameters between patients with febrile and meningeal tick-borne encephalitis, Mann–Whitney U-test.

 

Дополнительно нами выявлены отрицательные корреляционные зависимости между значениями максимальной высоты лихорадки у больных в начале заболевания, которые являются одними из критериев тяжести клинического течения ЛФ и МФ КЭ, и относительным числом лимфоцитов в периферической крови (r = —0,66, p < 0,001), а также уровнями ЛПС-стимулированной продукции IL-6 (r = —0,68, p < 0,001) и TNFα (r = —0,69, p < 0,001) в культурах мононуклеарных лейкоцитов крови. Более того, выявлены положительные корреляционные зависимости между относительным и абсолютным количеством нейтрофилов в гемограмме и уровнем спонтанной продукции IL-8 в культурах мононуклеарных лейкоцитов больных КЭ (r = 0,76, p < 0,001 и r = 0,69, p < 0,001).

Обсуждение

Известно, что клиническое течение КЭ может варьировать от инаппарантной или легкой ЛФ до тяжелых форм заболевания с диссеминацией возбудителя в ЦНС с развитием менингита или энцефалита, что, по-видимому, зависит как от биологических свойств штамма вируса КЭ, так и от индивидуальных особенностей иммунологической резистентности хозяина [1, 16]. Сравнительное изучение особенностей врожденного и адаптивного иммунного ответа в культурах клеток крови, инфицированных штаммами вирусов КЭ с различной патогенностью [16], показало, что высокопатогенный штамм был способен быстро проникать и активно реплицироваться в клетках в условиях in vitro, подавляя экспрессию молекул адгезии и активации на моноцитах, NK-клетках и CD8⁺ Т-лимфоцитах, приводя к подавлению врожденного иммунитета, в то время как низкопатогенный штамм, напротив, медленно реплицировался в клетках крови, вызывая значительное увеличение экспрессии молекул адгезии и активации, запуская врожденные защитные механизмы и обеспечивая быструю элиминацию вируса из организма, что может предрасполагать к клинически более легкому течению заболевания. Не исключено, что эти данные позволяют в значительной степени объяснить полученные нами результаты различий параметров иммунного ответа между группами больных с ЛФ и МФ КЭ.

Известно, что МФ КЭ клинически протекает более тяжело, чем ЛФ, что сопровождается не только менингеальным синдромом, выраженными симптомами интоксикации и лихорадки, но и тенденцией к умеренному увеличению количества нейтрофилов в гемограмме, которые играют существенную роль во врожденном иммунном ответе [2], что нашло подтверждение в проведенном нами исследовании, а также в положительной корреляционной зависимости между количеством нейтрофилов в периферической крови и уровнями спонтанной секреции в культурах мононуклеарных клеток хемокина IL-8 (CXCL8), который вызывает активацию и дегрануляцию полиморфноядерных лейкоцитов [4].

Как свидетельствуют данные литературы, большинство исследователей, так же, как и мы, при анализе показателей, характеризующих гемограмму и количественную структуру основных субпопуляций лимфоцитов, указывают на уменьшение относительного содержания и/или абсолютного количества лимфоцитов в крови у пациентов с МФ и/или ОФ КЭ по сравнению с условно-здоровым контролем. Однако, в отличие от полученных нами результатов, в литературе представлены сведения о том, что лимфоцитопения формируется, главным образом за счет снижения количества клеток, экспрессирующих антигены Т-хелперов (CD3⁺CD4⁺), но не маркеры Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺CD45⁺) [3, 6].

Известно, что NK-клетки являются важной частью врожденного иммунитета и активируются при многих вирусных инфекциях человека. Противовирусный ответ NK-клеток включает прямое уничтожение инфицированных вирусом клеток, опосредованное преимущественно высвобождением перфоринов и гранзимов, а также продукцией нескольких провоспалительных цитокинов, включая TNFα [9, 10]. Несколькими авторами было высказано предположение, что при инфекциях, вызванных флавивирусами, включая вирус денге [20, 21] и вирус японского энцефалита [22], NK-клетки играют важную роль в противовирусном контроле и оказывают влияние на тяжесть течения и исход этих заболеваний, хотя основные механизмы такого влияния остаются неизвестными. Установлено, что у больных острым КЭ с симптомами менингита и менингоэнцефалита в ранний период заболевания также происходит подавление функциональной активности NK-клеток в отношении клеток-мишеней, хотя это не всегда подтверждается какими-либо достоверными изменениями общего количества NK-клеток среди общего числа лимфоцитов [10].

У обследованных нами пациентов с МФ КЭ было выявлено существенное снижение концентрации NK-клеток CD3^–CD56⁺CD45⁺ в периферической крови по сравнению с больными с менее тяжело протекающей ЛФ КЭ. В то же время в группе пациентов с ЛФ КЭ количество NK-клеток было значительно выше, чем у здоровых лиц, что в целом соотносится с результатами Н.В. Крыловой с соавт. [3], продемонстрировавших аналогичное разнонаправленное изменение числа NK-клеток (CD3^–CD16⁺CD56⁺) в периферической крови больных с ОФ и ЛФ КЭ в остром периоде заболевания. Снижение количества NK-клеток и дефицит Т-клеточного звена иммунитета в крови у пациентов с тяжелым течением ОФ КЭ эти авторы рассматривали как один из критериев прогрессирования КЭ, в то время как умеренная активация системного цитокинового ответа Th1-типа и компенсаторный характер изменений параметров Т-клеточного иммунитета у больных с ЛФ может рассматриваться как адекватный иммунный ответ на инфекцию [3]. Не исключено, что эта закономерность указывает на миграцию NK-клеток через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), поскольку они были обнаружены в СМЖ пациентов с МФ и ОФ острого КЭ [11].

Исследования, включающие анализ концентраций цитокинов в биологических жидкостях у больных в зависимости от клинической формы КЭ демонстрируют противоречивые результаты [3, 6, 7, 12, 23]. По данным одних авторов у больных с МФ и ОФ КЭ в сыворотке крови [6, 23] и в особенности в СМЖ [10, 12, 23] было обнаружено значительное повышение уровней провоспалительных хемокинов/цитокинов IL-8, MCP-1, IL-6, IFNγ и/или TNFα по сравнению с группой условно-здоровых лиц и пациентов с ЛФ КЭ. Повышенные уровни провоспалительных цитокинов в сыворотке крови постепенно нормализовались в стадию реконвалесценции у больных с благоприятным исходом заболевания [12]. Кроме того, уровни иммуносупрессорного цитокина IL-10 в СМЖ обратно коррелировали с более тяжелым течением менингоэнцефалита, вызванного вирусом КЭ [12, 23].

Другие исследователи, напротив, при ОФ острого КЭ выявили недостаточность ответа Th1-типа и отсутствие значимых различий по сравнению с группой условно-здоровых лиц для концентрации провоспалительных цитокинов IL-8, IL-1β и/или TNFα в сыворотке крови, а также обнаружили существенное снижение уровней этих цитокинов в сыворотке и индексов стимуляции (ИС) TNFα и IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных клеток, индуцированных конканавалином А, по сравнению с больными ЛФ КЭ [3]. В то же время у больных с ЛФ КЭ концентрации этих цитокинов в сыворотке крови существенно превышали аналогичные показатели в контроле, что в целом соотносится с полученными нами данными и свидетельствует о разнонаправленных изменениях активности факторов врожденного иммунитета у больных с разными формами КЭ: при более легкой ЛФ и при тяжелом течении с поражением ЦНС [3, 7]. Подавление в культурах мононуклеарных лейкоцитов крови спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, TNFα и IFNα, было выявлено при тяжелом течении некоторых других инфекционных заболеваний, в частности, при коронавирусной инфекции COVID-19 [8]. Менингеальная форма у больных острым КЭ, характеризующаяся проникновением вируса КЭ через ГЭБ, по-видимому, сопровождается более выраженной дизрегуляцией иммунного ответа, приводящей к дефициту NK-клеток, количественному дисбалансу субпопуляций Т-лимфоцитов, увеличению числа нейтрофилов в периферической крови и подавлению спонтанной и/или митоген-стимулированной продукции провоспалительных цитокинов, ответственных за реакции врожденного иммунитета, главным образом, IL-6, TNFα и MCP-1.

Заключение

Таким образом, установлено, что в группе больных МФ КЭ, имевших более тяжелое клиническое течение заболевания, интенсивность спонтанной и/или ЛПС-стимулированной секреции мононуклеарными лейкоцитами крови провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, MCP-1 и TNFα была существенно ниже, а IL-8, напротив, выше, чем у пациентов с ЛФ КЭ. Кроме того, у больных с МФ КЭ уровни спонтанной и/или ЛПС-индуцированной наработки IL-6 и TNFα либо не имели статистически значимых различий, либо оказались ниже соответствующих контрольных значений, что также свидетельствует об угнетении функциональной активности клеток. Напротив, в группе пациентов с ЛФ КЭ уровни спонтанной и/или ЛПС-индуцированной продукции IL-1β, IL-6, MCP-1 и TNFα были значительно выше, чем у здоровых лиц. При этом спонтанная секреция иммуносупрессорного цитокина IL-10 у пациентов обеих групп существенно превышала таковую в контроле. Независимо от клинической формы у пациентов с КЭ в крови выявлено существенное снижение по сравнению с условно-здоровыми донорами относительного числа лимфоцитов, относительного и абсолютного числа Т-цитотоксических клеток. У больных с МФ КЭ отмечалось статистически значимое повышение числа нейтрофилов в гемограмме, снижение относительного и абсолютного количества NK-клеток по сравнению с больными с менее тяжело протекающей ЛФ КЭ. По-видимому, развитие МФ у больных острым КЭ ассоциировано с более выраженной дизрегуляцией иммунного ответа, приводящей к дефициту NK-клеток, количественному дисбалансу субпопуляций Т-лимфоцитов, увеличению числа нейтрофилов в периферической крови и подавлению продукции провоспалительных цитокинов, ответственных за реакции врожденного иммунитета.

Дополнительная информация

Конфликт интересов. Авторы данной статьи сообщают об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Ekaterina N. Ilyinskikh

Siberian State Medical University

Author for correspondence.
Email: infconf2009@mail.ru

д.м.н., доцент, профессор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии

Russian Federation, Tomsk

O. V. Voronkova

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

DSc (Medicine), Associate Professor, Head of the Division of Biology and Genetics

Russian Federation, Tomsk

A. V. Reshetova

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

PhD Student of the Division of Infectious Diseases and Epidemiology

Russian Federation, Tomsk

R. R. Hasanova

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor of the Division of Biology and Genetics

Russian Federation, Tomsk

I. E. Esimova

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

DSc (Medicine), Associate Professor of the Division of Biology and Genetics

Russian Federation, Tomsk

N. A. Chernyshov

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

PhD Student of the Division of Biology and Genetics

Russian Federation, Tomsk

O. V. Yampolskaya

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

Student

Russian Federation, Tomsk

A. V. Yampolskaya

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

Student

Russian Federation, Tomsk

E. M. Polomoshnova

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

Student

Russian Federation, Tomsk

E. V. Minakova

Siberian State Medical University

Email: infconf2009@mail.ru

Student

Russian Federation, Tomsk

References

Supplementary files