ESAT-6 and CFP-10 antigens as a biotechnology molecule substrate. Applications in medicine

Full Text

Введение

Рекомбинантные технологии уже давно и широко применяются в медицине. С их помощью создаются лекарственные, диагностические и профилактические средства. Рекомбинантные технологии являются отраслью генной инженерии и подразумевают модификацию генного материала (ДНК, РНК) с целью синтеза целевого белка. Синтезированные белки могут выступать в качестве лекарственных препаратов (инсулины, факторы свертывания крови, интерфероны, генотерапевтические препараты, ферментные средства талиглюцераза альфа, велаглюцераза альфа и т. д.), средств профилактики (вакцины) и диагностики для использования в иммуногистохимии, иммуноферментном анализе, проточной цитофлуориметрии и др.

Важность и необходимость рекомбинантных технологий обусловлена не только огромным потенциалом создания новых белковых молекул, но и рядом ограничений, связанных с источниками получения белка и особенностями реакции живых организмов на чужеродные белки. В силу сложности своего строения белки могут синтезироваться только живыми организмами, а выделение их из живых организмов связано с рядом проблем, к числу которых относятся потенциальные различия в строении одного и того же белка и загрязнение целевого экстракта балластными веществами. Вторая проблема — любые чужеродные белки живыми организмами воспринимаются как антигены и при повторной встрече организма с антигеном развивается иммунный ответ. Введение гетерогенного по строению белка, смеси белков или смеси белков с низкомолекулярными соединениями усиливает иммунную реакцию на их повторное введение. При создании лекарственных средств в большинстве случаев (кроме, возможно, пищеварительных ферментов) это является неприемлемым — фармацевтическая субстанция должна быть стандартизованной и минимально иммуногенной, а применение рекомбинантных технологий позволяет в значительной мере устранить перечисленные проблемы. Напротив, при создании вакцин используются полноценные бактерии или вирусы в виде ослабленных (аттенуированных) штаммов или их фрагменты именно с целью формирования надежного иммунитета за счет воздействия целого комплекса антигенов. Промежуточное положение между лекарственными средствами и вакцинами занимают диагностические средства. В зависимости от цели применения, их состав и чистота могут заметно различаться, поэтому в некоторых случаях, например, при диагностике наличия аллергии используются экстракты из источника аллергена, содержащие большое количества антигенов и балластных веществ, в других случаях может требоваться более чистое и однообразное по строению средство, так как это влияет на такие важные параметры любого диагностического теста как чувствительность и специфичность.

Настоящая работа посвящена рассмотрению биотехнологической платформы на основе рекомбинантных белков ESAT-6 и CFP-10 являющихся антигенами ряда микобактерий, включая M. tuberculosis, нашедших широкое применение в диагностике латентной туберкулезной инфекции.

Предпосылки разработки биотехнологической платформы на основе белков ESAT-6 и CFP-10 для совершенствования диагностики латентной туберкулезной инфекции

ESAT-6 и CFP-10 — белки, синтезируемые рядом микобактерий из группы M. tuberculosis complex — M. tuberculosis, M. kansasii, M. szulgai и M. marinum [4, 29]. ESAT-6 (англ. early secreted antigenic target) — ранний секретируемый антиген с массой 6 kDa обладает литической активностью и способствует проникновению микобактерии в клетку, а также дестабилизирует фагосомы, позволяя микобактерии покинуть фагосому и переместиться в цитозоль макрофага, тем самым избежав лизиса [36, 43]. CFP-10 (англ. culture filtrate protein, син. Rv3874) — белок клеточного фильтрата с массой 10 kDa, образующий комплекс с ESAT-6 и обеспечивающий его доставку к месту действия [43]. Оба белка являются антигенами микобактерий и широко используются в диагностике латентной туберкулезной инфекции (ЛТИ), а также являются компонентами противотуберкулезных вакцин, находящихся в данный момент на этапе клинических исследований [26, 23].

Арсенал средств для диагностики активного туберкулеза достаточно широк — микроскопические и микробиологические методы, молекулярно-генетическое тестирование, изучение клинических проявлений заболеваний, лучевые методы визуализации легких и лимфатических узлов и т. д. При этом для диагностики ЛТИ — формы заболевания, когда возбудитель туберкулеза только присутствует в организме человека, но инфекционный процесс еще не начался — упомянутые методы диагностики неприменимы [33]. Особое внимание к ЛТИ вызвано тем, что, согласно современной парадигме, лечение туберкулеза необходимо начинать на ранних стадиях, желательно на этапе ЛТИ, не дожидаясь проявления клинических признаков заболевания. Такая практика обусловлена тем, что туберкулез является жизнеугрожающим заболеванием, лечение которого усложняется по мере его прогрессирования; распространены формы туберкулеза с устойчивостью к отдельным противотуберкулезным препаратам, что затрудняет и удлиняет лечение; а также тем, что страдающие от туберкулеза могут инфицировать окружающих [3]. Самым высоким риском развития туберкулеза обладают люди, страдающие ВИЧ, часто контактирующие с больными туберкулезом, заключенные и страдающие силикозом легких. Меньшим, но повышенным по сравнению с общей популяцией, риском развития туберкулеза обладают беженцы, недавно прибывшие иммигранты, люди, нуждающиеся в диализе, недавно перенесшие пересадку органов, а также получающие иммуносупрессирующую терапию [21].

До 1996 г. единственным широко применяемым и хорошо изученным способом массового скрининга на туберкулез была туберкулиновая проба (проба Манту, внутрикожная туберкулиновая проба [ВТП]) — внутрикожное введение туберкулина (здесь и далее под туберкулином имеется ввиду туберкулин PPD, от англ. purified protein derivative) с последующей регистрацией ответа на введение. Возникновение ответа, проявляющегося формированием инфильтрата (папулы) в месте введения, должно свидетельствовать о наличии сенсибилизации организма возбудителем туберкулеза и о его присутствии в организме, что является основанием для начала превентивной противотуберкулезной терапии, однако в действительности причин ответа несколько больше, что затрудняет интерпретацию результатов. Первое, на что следует указать, это то, что туберкулин является не чистым соединением, а смесью — фильтратом убитых нагреванием M. tuberculosis (в случае туберкулина PPDRT23 и PPD-S) или M. tuberculosis и M. bovis (в случае туберкулина PPD-L). Следствием упомянутого факта является достаточно высокая чувствительность теста, но низкая специфичность. Возникновение ответа на его введение может означать как сенсибилизацию, указывающую на присутствие в организме микобактерий, способных вызвать туберкулез, так и на присутствие в организме нетуберкулезных микобактерий, которые не способны вызвать туберкулез, или наличие в анамнезе вакцинации БЦЖ (вакцина, содержащая аттенуированный штамм M. bovis субштамма BCG-1, обладающий ослабленной вирулентностью и практически полной неспособностью вызвать туберкулез у человека). Последний фактор особенно сильно влияет на интерпретацию результатов ввиду того, что вакцина БЦЖ является очень распространенной в ряде стран и в том числе в РФ. Так, в РФ БЦЖ прививаются около 95% детей, что означает, что у большинства из них ВТП укажет на потенциальное присутствие возбудителя туберкулеза, что на деле окажется ложноположительным результатом в большинстве случаев [5, 18]. Подводя итоги массовой туберкулинодиагностики, проведенной в Москве с 2000 по 2006 г., было подсчитано, что не более 1% от положительно ответивших на ВТП детей и подростков в итоге были взяты под диспансерное наблюдение. Специфичность ВТП составила 41,7% у детей и 22,2% у подростков. Сходные результаты были получены и в других субъектах [13]. Результаты другого сравнительного исследования показали, что каждый второй ребенок, получающий превентивную химиотерапию на основании результатов ВТП, может получать ее необоснованно [1].

Стоит отметить и достаточно высокую частоту ложноотрицательных результатов ВТП у отдельных групп лиц: пациентов с распространенным активным туберкулезом, у которых частота ложноотрицательных результатов ВТП может достигать 17% и дополнительно увеличиваться по мере возрастания тяжести инфекционного процесса; пациентов с ВИЧ, у которых частота ложноотрицательных результатов может достигать 28% при уровне CD4-клеток 400–500 кл/мкл и до 100% при уровне CD4-клеток менее 200 кл/мл; у пожилых людей, у которых частота ложноотрицательных результатов может достигать 30%. К другим недостаткам этого теста относятся: низкая чувствительность у иммунокомпрометированных пациентов (например, у пациентов с ВИЧ), необходимость повторного посещения врача для интерпретации результатов [33]. Суммируя вышеперечисленные недостатки, можно сказать, что основной проблемой ВТП является высокая частота ложноположительных результатов, что приводит к проведению излишних медицинских манипуляций с пациентами и нерациональному расходованию медицинских ресурсов [5]. К положительным чертам ВТП можно отнести достаточно высокую изученность теста, а также сравнительно небольшую ресурсоемкость метода.

Недостатки ВТП и отсутствие альтернатив стимулировали проведение поиска новых методов диагностики ЛТИ. В 1996 г. было закончено секвенирование генома разных видов микобактерий и их сравнительный анализ позволил выявить наличие так называемых «регионов различий» (англ. region of difference, RD-1, RD-2 и т. д.) — фрагментов генома, обнаруженных лишь у части видов и отсутствующих у других [42]. На данный момент обнаружено не менее 20 таких регионов в геномах микобактерий. В геноме M. tuberculosis выявлены 14 «регионов различий» (RD), которые также присутствуют лишь у ограниченного числа других видов микобактерий [37]. В теории гены обнаруженных регионов могли кодировать белки, отсутствующие у других видов микобактерий, соответственно обнаружение этих специфических белков указывало бы на присутствие в организме именно тех видов микобактерий, которые способны его продуцировать. Потенциально открытие таких белков позволило бы создать на их основе высокоспецифичные диагностические тесты [20].

Впоследствии был открыт целый ряд таких специфических белков (MPT51, MPT59 MPT64 (Ag85B, Rv1886c), MTB8, MTB48, Rv0934, Rv1837c и др.), однако результаты экспериментов подтвердили клиническую применимость лишь небольшого их числа. Проблема заключалась в том, что тесты на их основе не демонстрировали достаточного уровня чувствительности, что нивелировало их специфичность. Среди самых эффективных белков оказались ESAT-6 и CFP-10, гены которых находятся в RD-1. Тесты, основанные на комбинации этих белков, продемонстрировали более высокую чувствительность по сравнению с тестами на основе какого-либо одного из них, что предопределило их дальнейшее совместное использование [4, 42].

Тесты на основе рекомбинантных ESAT-6 и CFP-10 преодолели недостатки ВТП — благодаря возросшей специфичности на результаты тестирования перестало влиять наличие вакцинации БЦЖ в прошлом, снизилась частота ложноположительных результатов из-за реакции на нетуберкулезные микобактерии и т. д.

Диагностические тесты на основе ESAT-6 и CFP-10 имеют несколько форм реализации: тесты in vitro, выполняемые в лаборатории на основе биологического материала пациента (кровь), и внутрикожные пробы, аналогичные ВТП, отличающиеся применением ESAT-6 и CFP-10 вместо туберкулина.

IGRA-тесты

Исторически первыми появились лабораторные методы in vitro. Как и внутрикожные методы они основаны на механизме клеточного ответа: организм, в котором присутствуют микобактерии, способные вызвать туберкулез, сенсибилизирован к антигенам микобактерий, и иммунные клетки Т-клеточного звена, «знакомые» с антигеном, при встрече с ним запускают процесс воспаления [33]. При постановке внутрикожных проб воспаление проявляется характерным инфильтратом в месте введения. При лабораторном исследовании у пациента берется образец крови с циркулирующими в ней Т-лимфоцитами, затем в образец крови добавляется микобактериальный антиген или их смесь, которые при взаимодействии с сенсибилизированными Т-лимфоцитами провоцируют выделение ими IFNg, который подвергается количественному анализу и при превышении пороговых значений указывает на наличие в организме активных микобактерий [20]. Тесты на основе этого принципа получили название IGRA-тесты (англ. interferon-gamma release assays). Первоначально, в качестве антигена применялся туберкулин, однако in vitro методы с его использованием характеризовались наличием практически тех же недостатков, за исключением того, что результаты получались быстрее, и не требовалось повторного посещения пациентом врача [33, 42]. С открытием антигенов, кодируемых в регионах различий, туберкулин был заменен на них. На данный момент в мире общепризнаны и широко применяются два валидированных IGRA-теста: T-SPOT.TB и QuantiFERON-TB Gold (QFT). Они отличаются друг от друга составом антигенов и критериями оценки результатов тестирования. При проведении T-SPOT.TB используются рекомбинантные антигены ESAT-6 и CFP-10. Образец крови пациента инкубируется течение 16–24 ч в присутствии антигенов, а затем при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) по методу ELISPOT проводится подсчет числа Т-лимфоцитов, выделяющих IFNg [27]. В качестве антигенов в тесте QFT выступают рекомбинантные ESAT-6, CFP-10 и TB7.7(p4). Образец крови пациента подвергается центрифугированию с последующим инкубированием с антигенами в течение 16–24 ч. Уровень IFNg определяется с помощью ИФА по методу ELISA — путем подсчета выделившегося IFNg [35].

Чувствительность IGRA-тестов при диагностике ЛТИ составляет около 68–90% для T-SPOT.TB и 46–80% для QFT. Оба теста обладают высокой и сопоставимой специфичностью > 95% [24, 32]. Для сравнения: чувствительность ВТП в среднем составляет около 80%, при этом если в качестве критерия положительной пробы использовать размер папулы 5, 10 или 15 мм, то чувствительность будет составлять около 98, 70–90 и 40–60% соответственно. Специфичность ВТП при диагностике ЛТИ у лиц без вакцинации БЦЖ может достигать 100%, но снижается до 60–80% при ее наличии [13, 24, 31, 32]. Важно отметить, что говоря о чувствительности и специфичности любого метода диагностики ЛТИ, необходимо учитывать, что все оценки являются приблизительными, так как золотого стандарта диагностики ЛТИ по-прежнему нет [3]. Не стоит также забывать, что высокие показатели диагностической ценности, продемонстрированные в условиях хорошо спланированного и проведенного эксперимента, не всегда достигаются в реальных условиях. Так, по замечанию авторов, проанализировавших опыт применения IGRA-тестов в РФ, результаты их применения были несколько ниже, чем заявлено в международных рекомендациях [40].

Результаты крупного метаанализа исследований с участием пациентов из групп повышенного риска показали, что риск развития туберкулеза у лиц с положительным тестом превышает риск развития туберкулеза у лиц с отрицательным тестом в случае IGRA-тестов в 9,35 раз (95% доверительный интервал (ДИ) [6, 48–13, 49]), в то время как в случае ВТП — в 4,24 раза (95% ДИ [3, 3–5, 46]). Положительная диагностическая ценность (англ. positive predictive value) для IGRA-тестов и ВТП составила 4,2 и 1,6% соответственно, а негативная диагностическая ценность (англ. negative predictive value) — 99,4 и 99,1% соответственно. Риск развития туберкулеза у лиц с положительным результатом теста, не получивших профилактического лечения, превысил риск у лиц, получивших лечение, при использовании IGRA-тестов в 2,36 раза (95% ДИ [1, 06–5, 23]) и при использовании ВТП — 1,35 раза (95% ДИ [0, 59–3, 12]) Таким образом, было показано, что IGRA-тесты обладают большей предсказательной ценностью, чем ВТП [45].

В качестве аналога для замены более дорогого импортного теста QFT был разработан отечественный in vitro IGRA-тест на основе ESAT-6, CFP-10 и туберкулина, получивший название Тубинферон. Доказательная база данного теста ограничена и противоречива, что не позволяет сделать определенный вывод о диагностической ценности данного метода [7, 8, 9, 10]. Тубинферон разрабатывался как альтернатива QFT, поэтому в качестве косвенной оценки ценности нового метода можно использовать данные о частоте совпадений между двумя тестами. Так, по результатам параллельных исследований было установлено, что у детей результаты Тубинферона и QFT совпадали в 68% [7] и в 74,6% случаев (в то время как АТР и QFT совпадали в 90% случаев) [8]. При использовании QFT в качестве эталона чувствительность и специфичность Тубинферона в другом исследовании составила 64,7 и 75,9% соответственно [9]. На момент написания статьи тест не имеет действующего регистрационного удостоверения в РФ [16].

Внутрикожные пробы с ESAT-6 и CFP-10

Реализация ESAT-6/CFP-10-платформы в виде внутрикожных проб впервые была осуществлена в зарегистрированном в РФ диагностическом тесте на основе аллергена туберкулезного рекомбинантного (АТР, торговое наименование «Диаскинтест», ЛСР-006435/08, зарегистрирован 11.08.2008). В указанном тесте применяются не сами белки ESAT-6 и CFP-10, а единый рекомбинантный белок, состоящий из ESAT-6 и CFP-10 и продуцируемый генетически модифицированной культурой E. coli BL21 (DE3)/pCFP-ESAT. Идея создания АТР заключалась в разработке более специфичного теста по сравнению с ВТП, но пригодного для массового скрининга [4].

АТР имеет более чем 10-летний опыт клинического применения. Суммарно в 121 публикации по результатам использования АТР, тест применен у 12 026 761 пациента, из которых не менее 4 млн — дети [40]. Анализ государственных закупок показал, что с 2013 г. по настоящее время было закуплено более 5 млн упаковок АТР, что в пересчете на дозы превышает 170 млн доз [17].

По результатам крупного метаанализа, включившего результаты 61 публикации по результатам применения АТР, общая точность АТР составляет 95,1% (95% ДИ [95, 06–95, 1]), у ВИЧ-положительных лиц — 92,4% (91,9–92,7). Чувствительность АТР у пациентов с туберкулезом составляет 86,0% (95% ДИ [80, 0–92, 0]) и 100% у детей с туберкулезом. Сопоставление частоты положительных проб у пациентов с туберкулезом показало, что при применении АТР (80,5%) они наблюдались чаще, чем при QFT (67,0%) и T-SPOT.TB (72,2%), но реже, чем при применении ВТП (91,2%). У пациентов с туберкулезом в сочетании с ВИЧ частота положительных результатов с АТР (59,3%) была на уровне с QFT (61,3%) и несколько ниже, чем при использовании T-SPOT.TB (67,2%), но значительно выше, чем при ВТП (15,1%) [40].

В другом крупном объединенном анализе 33 работ, из которых были извлечены данные о результатах применения АТР и ВТП у 2 126 493 детей, было установлено, что диагностическая ценность АТР выше в группе подростков с 15 до 18 лет, чем в группе детей от 0 до 14 лет. Расчетная чувствительность и специфичность АТР у подростков составила 100 и 97,9% соответственно, в то время как при применении ВТП — 100 и 10,2% соответственно [6].

В сравнительном исследовании АТР и QFT, в котором принял участие 181 человек, было показано, что у взрослых и детей с туберкулезом результаты обоих тестов достаточно согласованы: у взрослых чувствительность АТР и QFT составила 68 и 82% соответственно, а специфичность — по 88% при согласованности в результатах у 84% пациентов; у детей чувствительность составила 73 и 65%, а специфичность — 84 и 86%, при согласованности результатов у 90% детей. Также было отмечено, что в подгруппах детей с туберкулезом, вызванным M. tuberculosis, и высокоактивным туберкулезом чувствительность АТР достигла 100%, в отличии от QFT, показавшего результат 67 и 79%. Таким образом было продемонстрировано, что у взрослых чувствительность АТР несколько уступает QFT, однако, напротив, у детей АТР оказался более чувствительным, но несколько менее специфичным [34].

Ретроспективный анализ 860 историй болезней детей и взрослых без ВИЧ, вакцинированных БЦЖ, прошедших обследование в ФГБУ Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии с использованием АТР, QFT и T-SPOT.TB, показал, что у детей наблюдается почти полная согласованность при использовании данных тестов: 100% у АТР и T-SPOT.TB, и 97,1% у АТР и QFT. В подгруппе взрослых результаты оказались менее согласованными — в 80,5% случаев между АТР и T-SPOT.TB и в 63,6% случаев между АТР и QFT. Рассчитанная чувствительность у взрослых с туберкулезом, вызванным M. tuberculosis, составила 88,7% для АТР, 90,6% для T-SPOT.TB и 87,0% для QFT. Согласно полученным результатам, АТР оказался сопоставим по своим диагностическим свойствам с QFT и T-SPOT.TB, при этом у детей наблюдалось почти 100%-ное совпадение результатов тестирования [41].

В литературе описаны следующие положительные изменения в диагностике туберкулеза, появившиеся после внедрения АТР: при диагностике локальных форм туберкулеза удалось повысить выявляемость на 22,9% и избежать гипердиагностики в 20,7% случаев [5]; значительно повысить выявляемость активного туберкулеза у детей и подростков от 1,75 до 24 и 37,7 раза [15, 14, 39]; значительно повысить выявляемость посттуберкулезных изменений у детей и подростков в 39,2 раза [14]; снизить частоту назначения превентивной химиотерапии в 5 раз (по сравнению с частотой назначения после положительного ответа на ВТП) и привести в итоге к снижению заболеваемости туберкулезом [14]. Было отмечено, что АТР может давать положительные результаты у детей с монотонной ВТП, которые вследствие этого не подлежали диспансерному наблюдению, что расширяет диагностические возможности для этой части популяции [2]. С помощью АТР возможно провести дифференциальную диагностику туберкулеза и поствакцинальных осложнений после вакцинации БЦЖ [4]. Специфичность АТР значительно превышает специфичность ВТП в случаях неактивного туберкулеза легочной и внелегочных локализаций, а также нетуберкулезных заболеваний внелегочной локализации — частота ложноположительных результатов при применении ВТП у таких пациентов достигает 70%. В целом применение АТР позволяет на 65–99% снизить частоту ложноположительных результатов с ВТП [4].

В настоящее время в клинической разработке находятся еще 2 диагностических теста на основе ESAT-6 и CFP-10: датский тест C-Tb, являющийся комбинацией ESAT-6 и CFP-10 в соотношении 1:1, и китайский, представляющий собой рекомбинантный белок ESAT-6–CFP-10.

По итогам исследования C-Tb частота положительных результатов среди здоровых пациентов, нечасто и часто контактирующих с больными туберкулезом, имеет высокую согласованность с QFT — результаты совпадают у 94% пациентов. В то же время у пациентов с туберкулезом частота положительных реакций на C-Tb составила лишь 67% против 81% на QFT и 90% на ВТП. Частота положительного ответа на C-Tb среди здоровых лиц составила 3% по сравнению с 22% при использовании ВТП, у лиц с нечастыми контактами — 16% по сравнению с 22% соответственно, и у лиц с частыми контактами — 43 и 51% соответственно [38].

В клинических исследованиях китайского теста оценивались разные дозировки белка ESAT-6–CFP-10, а также такие параметры как временнόй промежуток оценки, критерии оценки — размер папулы или размер эритемы. Полученные результаты показывают, что чувствительность нового теста составляет от 72,14 до 100%, а специфичность — от 89,83 до 97,49% [30, 44].

Вакцины на основе ESAT-6 и CFP-10

На данный момент единственной противотуберкулезной вакциной является вакцина БЦЖ, тем не менее в разработке находится не менее 25 вакцин. Часть из них содержит в своем составе ESAT-6 и/или CFP-10. Субъединичная вакцина AEC/BC02 основана на рекомбинантном белке Ag85b-ESAT-6–CFP-10. Другие субъединичные вакцины, содержащие в составе ESAT-6, это H1:IC31, H1:CAF01, H1:LTK63, H56:IC31/ AERAS-456. Не содержит в своем составе, но экспрессирует ESAT-6 живая вакцина TB/FLU-04L, основанная на векторе из вируса гриппа, экспрессирующего Ag85A и ESAT-6 [23, 26].

Несмотря на ожидаемую пользу от внедрения в клиническую практику новых противотуберкулезных вакцин возможно проявление и некоторых негативных последствий, связанных с сенсибилизацией к ESAT-6 и CFP-10. По аналогии с вакцинацией БЦЖ, из-за которой ВТП может давать ложноположительные результаты, применение вакцин на основе ESAT-6 и CFP-10 может снизить специфичность диагностических средств на их основе [28].

Обзор клинических рекомендаций

ВОЗ в своем документе 2018 г. настоятельно рекомендовала рассматривать ВТП и IGRA-тесты как равнозначные варианты, обладающие относительно одинаковыми преимуществами и недостатками при диагностике ЛТИ. Выбор конкретного варианта следует делать исходя из экономических и инфраструктурных возможностей, доступных в конкретном случае [3].

В сводных рекомендациях Американского торакального общества (англ. American Thoracic Society), Американского общества инфекционистов (англ. Infectious Diseases Society of America) и Американского Центра по контролю и профилактике заболеваний (англ. Centers for Disease Control and Prevention) 2017 г. указано, что у детей до 5 лет предпочтительнее применять ВТП вместо IGRA-тестов. У детей старше 5 лет и взрослых с подозрением на ЛТИ, с низким и средним риском прогрессирования ЛТИ до активного туберкулеза, прошедших вакцинацию БЦЖ и у лиц, которые могут повторно не посетить врача для интерпретации результатов ВТП более предпочтительным является применение IGRA-тестов. При этом уточняется, что ВТП является надежной альтернативой, особенно в ситуациях, когда IGRA-тесты недоступны, дороги или их применение неприемлемо по иным причинам. У детей старше 5 лет и взрослых с подозрением на ЛТИ и высоким риском прогрессирования ЛТИ до активного туберкулеза возможно применение любого из тестов, так как данных о преимуществе одного перед другим недостаточно [22, 29].

Международное сообщество UpToDate в серии своих рекомендаций также предлагает дифференцированный подход к диагностике ЛТИ. У детей до двух лет рекомендуется использовать ВТП, у детей с 2 до 4 лет, особенно прошедших вакцинацию БЦЖ, предпочтительнее использование IGRA-тестов. У детей с 5 лет рекомендуется применение IGRA-тестов в ситуации, когда большую важность имеет специфичность теста — например у здоровых детей или прошедших вакцинацию БЦЖ. В ситуациях, когда важна чувствительность теста — дети с высоким риском ЛТИ или дети, нуждающиеся в иммуносупрессивной терапии, могут быть использованы и ВТП и IGRA-тесты [19, 31].

В РФ предпочтительным тестом на ЛТИ у взрослых является проба с АТР. IGRA-тесты рекомендуются лишь при отказе от проведения кожных тестов или невозможности их проведения по медицинским показаниям [11]. У детей тестирование с целью формирования групп высокого риска развития туберкулеза и диагностики заболевания рекомендуется использовать либо пробы с АТР, либо IGRA-тесты. При отборе детей для ревакцинации БЦЖ и при выявлении периода первичного инфицирования у детей до 7 лет включительно рекомендуется применение ВТП, а в возрасте 8–14 лет — применение пробы с АТР. У детей с подозрением на туберкулез для верификации диагноза в комплексное клинико-лабораторное и рентгенологическое обследование рекомендуется включение пробы с АТР и/или IGRA-тестов [12].

Обзор клинических рекомендаций и руководств, предпринятый Европейским центром профилактики и контроля болезней (англ. European Centre for Disease Prevention and Control) в 2018 г. и объединивший в итоге 6 документов, опубликованных с 2010 по 2015 г. показал, что ни в одном из документов не предлагалось полного отказа от ВТП. В качестве единственного или в качестве предпочтительного ВТП по-прежнему рекомендуется у детей в возрасте до 5 лет. В общей популяции рекомендуются оба теста, при этом в странах с низким и средним уровнем доходов особенно не рекомендуется отказываться от ВТП. В качестве предпочтительного или в дополнение к ВТП IGRA-тесты часто рекомендуются в особых популяциях: у лиц с низким риском ЛТИ, прошедших вакцинацию БЦЖ, бездомных или употребляющих наркотические средства, иммигрантов из стран с высокой распространенностью туберкулеза, лиц с ВИЧ и другими состояниями, ассоциированными со снижением иммунитета [25].

Обсуждение

Изучение генома микобактерий, последующее открытие ESAT-6 и CFP-10 и разработка тест-систем на их основе внесли значительный вклад в совершенствование диагностики туберкулеза. Специфичность и высокая диагностическая информативность применения ESAT-6 и CFP-10 сочетаются с гибкостью в их технологическом применении: на их основе созданы и демонстрируют хорошие результаты тесты in vitro со смесью индивидуальных рекомбинантных белков, внутрикожные тесты как со смесью индивидуальных рекомбинантных белков, так и единым рекомбинантным белком ESAT-6–CFP-10. Разные формы реализации тест-систем позволяют выполнять и точный лабораторный анализ, и эффективный массовый скрининг. Многообещающие результаты также получены при испытаниях вакцин с ESAT-6 и CFP-10, что означает наличие у них потенциального иммуногенного эффекта у человека.

Обзор литературы продемонстрировал наличие значительной доказательной базы в отношении превосходящей эффективности тестов на основе ESAT-6 и CFP-10 по сравнению с ВТП при диагностике ЛТИ и в некоторых других ситуациях:

• применение тестов на основе ESAT-6 и CFP-10 при массовых скринингах в общей популяции позволяет значительно повысить выявляемость ЛТИ и активного туберкулеза по сравнению с ВТП. При этом заметно снижается частота ложноположительных результатов и последующих необоснованных назначений противотуберкулезной терапии, что также приводит и к экономии медицинских ресурсов;
• в странах с высокой частотой вакцинирования БЦЖ применение тестов на основе ESAT-6 и CFP-10 позволяет в еще большей степени снизить частоту ложноположительных результатов при применении ВТП;
• тесты с ESAT-6 и CFP-10 в отличие от ВТП позволяют дифференцировать туберкулезный процесс и поствакцинальные осложнения прививки БЦЖ;
• повышается выявляемость пациентов с посттуберкулезными изменениями;
• появляется возможность отслеживать состояние пациентов с монотонной реакцией на ВТП;
• значительно повышается эффективность дифференцирования активного туберкулеза от неактивного туберкулеза как легочной, так и внелегочной локализации, а также нетуберкулезных заболеваний внелегочных локализаций;
• in vitro тесты с ESAT-6 и CFP-10 являются надежными альтернативами в ситуации, когда проведение внутрикожных тестов с туберкулином или ESAT-6 и CFP-10 противопоказано или не представляется возможным по другим причинам.

Изучение отечественных и иностранных клинических рекомендаций позволило установить, что тесты на основе ESAT-6 и CFP-10 в той или иной форме реализации присутствуют во всех рассмотренных документах. В некоторых ситуациях они рекомендуются в качестве альтернативы ВТП, а в иных — в качестве предпочтительных средств диагностики.

Как было сказано ранее, тесты на основе ESAT-6 и CFP-10 реализованы в разных форматах: тест-системы для in vitro диагностики и тесты для внутрикожного применения. In vitro тесты считаются более точными по сравнению с внутрикожными, при этом они дороже, требуют наличия лаборатории и квалифицированного специалиста. В качестве дополнительных преимуществ in vitro тестов часто выделяются быстрота получения результата и отсутствие необходимости в повторном посещении врача, однако на практике эти преимущества не всегда реализуются — при массовых скринингах преимущество в скорости теряется, а для получения пациентом результатов может потребоваться повторное посещение врача. Внутрикожные тесты с ESAT-6 и CFP-10 не предполагают каких-либо изменений в практике их применения по сравнению с ВТП, поэтому их внедрение не требует дополнительных инфраструктурных или организационных мероприятий, а их более высокая стоимость по сравнению с ВТП компенсируется снижением расходов на диспансерное наблюдение или превентивное лечение людей за счет снижения частоты ложноположительные результатов. Таким образом, выбор в пользу in vitro или внутрикожных тестов следует делать исходя из клинической потребности и доступных ресурсов.

Заключение

Открытие антигенов ESAT-6 и CFP-10 позволило сделать первый и пока единственный прорыв в совершенствовании диагностики ЛТИ со времен внедрения самого первого теста ВТП. Благодаря относительной нетребовательности молекул ESAT-6 и CFP-10 на их основе был разработан ряд достаточно разных по характеристикам медицинских продуктов: in vitro тест-системы с индивидуальными рекомбинантными белками, внутрикожные тесты с рекомбинантными индивидуальными белками и рекомбинантным комплексным белком, комплексные вакцины. В области диагностики ЛТИ совместное применение ESAT-6 и CFP-10 позволило компенсировать многие недостатки ВТП. ESAT-6 и CFP-10 являются единственными отдельными антигенами (не считая смеси антигенов в составе туберкулина), используемыми в диагностике туберкулеза и применяемыми во всем мире, что дополнительно подчеркивает важность их открытия.

About the authors

Dmitry A. Kudlai

National Research Center — Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: D624254@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1878-4467
SPIN-code: 4129-7880
Scopus Author ID: 921055

PhD, MD (Medicine), Professor of Pharmacology Department, Institute of Pharmacy; Leading Researcher, Laboratory of Personalized Medicine and Molecular Immunology

Russian Federation, Moscow; Moscow

N. P. Doktorova

National Medical Research Center for Phthisiopulmonology and Infectious Diseases, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: D624254@gmail.com

PhD, MD (Medicine), Researcher

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files