Comparative characteristics of the nasal mucosa microflora at different level of allergic inflammation in the respiratory tract

Full Text

Введение

В настоящее время аллергические заболевания органов дыхания занимают обширную нишу среди хронических заболеваний. Самыми распространенными вариантами респираторной аллергии являются аллергический риносинусит и бронхиальная астма [19, 23]. Ежегодный стремительный рост их распространенности делает актуальными исследования их этиологии и патогенеза. Проведенные ранее исследования свидетельствуют о гетерогенности респираторных проявлений аллергии, однако важно понимать, что есть как общие, так различные звенья их патогенеза [1]. Фенотипические проявления клинико-патогенетических вариантов респираторной аллергии являются результатом повреждающего действия медиаторов воспаления, выброс которых опосредован различными механизмами (атопическими и псевдоатопическими). Фактор, инициирующий выброс вазоактивных субстанций, определяет разновидность аллергических реакций. Для атопии характерно участие специфических реагинов, чаще иммуноглобулинов E. Термин псевдоатопия указывает на то, что в качестве триггера аллергической реакции выступают факторы, которые, минуя стадию сенсибилизации, ведут к образованию и выбросу вазоактивных веществ [1]. Классическим проявлением респираторной псевдоатопии является астматическая триада (АТ): полипозный риносинусит (ПРС), непереносимость ненаркотических анальгетиков и нестероидных противовоспалительных препаратов, инициирующих липоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты с образованием лейкотриенов, обладающих выраженным бронхоконстрикторным эффектом, с формированием бронхиальной астмы.

Слизистая оболочка полости носа является физиологическим барьером на пути проникновения различных аэрогенных факторов окружающей среды. Для нее характерен определенный состав микробиоты, который достаточно стабилен. Воспалительный процесс в области верхних отделов дыхательных путей развивается при воздействии вирулентного возбудителя и несостоятельности местных и общих защитных ресурсов организма. Результаты научных исследований содержат информацию о весьма скудном представительстве микроорганизмов начального отдела респираторного тракта, участвующих в формировании бактериальных ассоциаций [7]. Воспалительные процессы в носовой полости нарушают неспецифический барьер на пути проникновения аллергенов и других поллютантов. Изменения микробиома можно рассматривать как индикатор дисбиоза респираторного тракта.

Цель настоящего исследования — дать сравнительную микробиологическую характеристику слизистой оболочки носа больных респираторной аллергией различного генеза и уровня поражения дыхательных путей.

Материалы и методы

Обследованы больные респираторной аллергией в возрасте от 23 до 51 года (средний возраст — 22,6±2,1 лет) и практически здоровые добровольцы (n = 120), идентичные по полу и возрасту. В структуре патологии выделены: респираторная атопия, включающая в себя атопический риносинусит (АР, n = 28) и атопическую бронхиальную астму (АБА, n = 28), и респираторная псевдоатопия, включающая в себя ПРС (n = 68) и АТ (n = 28). Диагностика заболеваний проводилась при комплексной работе аллерголога-иммунолога и оториноларинголога. Были использованы стандартные общеклинические методы и методы специфической аллергологической диагностики (аллергологический анамнез, prick-тестирование с неинфекционными аллергенами, определение уровней общего и специфических иммуноглобулинов E в сыворотке крови методом ИФА).

Дизайн исследования: на первом этапе исследовали микробиом слизистой оболочки носа; на втором этапе изучили видовой состав бактерий рода Staphylococcus; на третьем этапе проведена сравнительная характеристика микрофлоры слизистой оболочки носа в зависимости от генеза респираторной аллергии и уровня поражения респираторного тракта.

При взятии образцов материала для исследования микробиома слизистой оболочки носа использовались стерильные тупферы с коммерческой транспортной средой Эймса. Выделение микроорганизмов проводили на питательных дифференциально-диагностических средах: желточно-солевом агаре (ЖСА), агаре Эндо и энтерококк-агаре. В качестве основы ЖСА использовали элективный солевой агар. По прописи готовили 1,8–2% агар, рН 7,2–7,4. К расплавленному и охлажденному до 45–50°С агару, соблюдая правила асептики, добавляли 20% щелочной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток взбалтывали с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия), смешивали тщательно агар с желточной взвесью, разливали по 20 мл в чашки Петри. Посев проводили секторным методом: чашку делили на 4 сектора; в первом секторе делали площадку с ватного тампона и рассеивали четырьмя штрихами во второй сектор; прожигали петлю и рассеивали четырьмя штрихами в третий сектор; прожигали петлю и рассеивали четырьмя штрихами в четвертый сектор. Засеянные среды инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Подсчет микроорганизмов проводили по расчетной таблице. Выросшие изоляты пересевали на скошенный мясопептонный агар и питательный полужидкий агар (0,4%) для получения чистых культур и изучения признаков, используемых при идентификации. О чистоте культуры судили с помощью визуального и микроскопического контроля.

Статистическая обработка результатов исследования выполнена с применением пакета прикладных программ Statistica 10.0. Изучаемая выборка описана с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 25 и 75 перцентилей (С₂₅ и С₇₅). Нормальность распределения подтверждена методом Колмогорова–Смирнова. Статистически значимые различия между показателями независимых выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна–Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез меньше или равен 0,05.

Результаты

На первом этапе был изучен видовой состав микрофлоры слизистой оболочки носа при риносинуситах различного генеза (АР и ПРС): Streptococcus pneumoniae, Streptococcus haemolyticus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae (табл. 1).

 

Таблица 1. Показатели видового состава микрофлоры слизистой оболочки носа при атопическом и полипозном риносинусите, Ме (С₂₅–С₇₅)

Table 1. Indicators of the species composition of the microflora of the nasal mucosa with atopic and polypoid rhinosinusitis, Me (C₂₅–C₇₅)

Показатели, КОЕ/мл Parameters, CFU/ml	Контроль Control	АР AR	ПРС PRS
	1 N = 209	2 N = 28	3 N = 68
S. pneumoniae	1000 (0–1000)	8000 (100–2500)	2 500 000 (10 000–3 000 000) Р1 = 0,012
S. haemolyticus	0	1500 (1000–2000) Р1 < 0,001	10 000 (1000–15 000)
E. faecium	0	1000 (10–5005) Р1 < 0,001	0
E. faecalis	0	1000 (10–10 000) Р1 < 0,001	0
M. catarrhalis	1000 (0–1000)	10 000 (100–15 000)	15 000 (1000–42 000)
H. influenzae	0	280 000 (1200–300 000) Р1 < 0,001	0

Примечание. Статистически достоверные различия: P₁ — с группой контроля.

Note. Statistically significant differences: P₁ — vs. control group.

 

При АР показатель содержания условно-патогенных микроорганизмов находилось в пределах референсных интервалов, за исключением Haemophilus influenzae, количество которых статистически значимо выше, чем в группе контроля. Кроме того, в группе больных АР на слизистой оболочке носа обнаружены бактерии Streptococcus haemolyticus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, которые не выявлены в группе контроля.

При ПРС содержание КОЕ Streptococcus pneumoniae статистически значимо выше по сравнению с группой контроля. При этом такие возбудители, как Haemophilus influenzae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, которые были обнаружены при АР, при ПРС, как и в группе контроля, отсутствовали (табл. 1).

На втором этапе изучили видовой состав бактерий рода Staphylococcus, выделенных со слизистой оболочки носа при АР и ПРС (табл. 2). Показана статистически значимо высокая численность штаммов Staphylococcus aureus, относящихся к коагулазопозитивным стафилококкам, в группе АР по сравнению с группой контроля (табл. 2). При этом частота встречаемости и количество коагулазонегативных стафилококков статистически значимо достоверно выше относительно группы контроля. Выявлено большое видовое разнообразие микроорганизмов, относящихся к роду Staphylococcus: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. cohnii, S. capitis, S. hyicus. Представляет интерес наличие на слизистой оболочке носа S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. cohnii, S. capitis, S. hyicus при АР, тогда как в группе ПРС обнаруживаются S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. capitis. В группе контроля штаммов таких видов, как S. capitis и S. hyicus, не выявлено.

 

Таблица 2. Показатели видового состава бактерий рода Staphylococcus, выделенных со слизистой носа при атопическом и полипозном риносинусите, Ме (С₂₅–С₇₅)

Table 2. Parameters of the genus Staphylococcus species composition isolated from the nasal mucosa with atopic and polypous rhinosinusitis, Me (C₂₅–C₇₅)

Показатели, КОЕ/мл Parameters, CFU/ml	Контроль Control	АР AR	ПРС PRS
	1 N = 209	2 N = 28	3 N = 68
S. aureus	200 (0–200)	15 500 (40–17 000) Р1 < 0,001	52 550 (100–500 000)
S. epidermidis	1000 (100–100 000)	10 000 (1000–10 000) Р1 < 0,001	5000 (1000–100 000) Р1 = 0,021
S. haemolyticus	100 (10–100)	10 000 (100–100 000) Р1 = 0,039	55 000 (7500–2 550 000) Р1 = 0,023
S. hominis	5505 (100–11 000)	300 (90–10 000) Р1 = 0,029	750 000 (500 000–1 000 000) P2 = 0,029
S. cohnii	10 000 (10 000–10 000)	10 000 (1000–100 000)	0
S. capitis	0	10 000 (5500–205 000)	1000 (1000–1000)
S. hyicus	0	5500 (1000–10 000)	0

Примечание. Статистически достоверные различия: P₁ — с группой контроля, Р₂ — с группой АР.

Note. Statistically significant differences: P₁ — vs. control group, P₂ — vs. AR group.

 

На третьем этапе определен состав микроорганизмов рода Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Enterobacteriaceae и дана сравнительная характеристика микрофлоры слизистой оболочки носа больных респираторной аллергией различного генеза и уровня поражения респираторного тракта (табл. 3).

 

Таблица 3. Состав микрофлоры слизистой оболочки носа при различном генезе аллергического воспаления и уровне поражения респираторного тракта, Ме (С₂₅–С₇₅)

Table 3. The microbial composition of the nasal mucosa with different genesis of allergic inflammation and level of respiratory tract damage, Me (C₂₅–C₇₅)

Показатели, КОЕ/мл Parameters, CFU/ml	Контроль Control	ПРС PRS	АТ AT	АР AR	АБА ABA
	1 N = 209	2 N = 68	3 N = 28	4 N = 28	5 N = 28
Staphylococcus spp.	10 000 (1000–10 110)	516 000 (20 000–863 000) Р1 < 0,001	1 000 000 (500 000–50 000 000) Р1 < 0,001	100 000 (52 500–25 050 000) Р1 = 0,05	5 000 000 (1 000 000–100 000 000) Р1 < 0,001
Streptococcus spp.	1000 (550–1000)	1 000 000 (500 000–8 000 000) Р1 < 0,001	500 000 (50 000–50 000 000) Р1 < 0,001	50 050 000 (100 000–100 000 000) Р1 = 0,03	100 000 000 (10 000 000–500 000 000) Р1 < 0,001
Enterococcus spp.	0 (0–0)	0(0–0)	1000 (1000–1000) Р1,2 < 0,001	5050 (100–10 000) Р1,2 < 0,001	50 000 (10 000–500 000) Р1,2,3 < 0,001
Enterobacteriaceae spp.	1000 (100–10 000)	100 000 (100 000–100 000) Р1 < 0,001	10 000 (1000–500 000)	27 500 000 (5 000 000–50 000 000) Р1,2 = 0,02	27 500 000 (1 000 000–50 000 000) Р1 < 0,001
Общее количество Total amount	15 780 (1000–20 800)	2 183 250 (1 046 600–6 148 500) Р1< 0,001	2 104 000 (1 011 000–100 000 000) Р1< 0,001	102 605 050 (5 200 100–200 010 000) Р1 = 0,02	278 006 000 (105 001 000–51 100 000) Р1 < 0,001

Примечание. Статистически достоверные различия: P₁ — с группой контроля, Р₂ — с группой ПРС, P₃ — с группой АТ, Р₄ — с группой АР.

Note. Statistically significant differences: P₁ — vs. control group, P₂ — vs. PRS group, P₃ — vs. AT group, P₄ — vs. AR group.

 

Особенностями изменения состава условно-патогенной микрофлоры при риносинуситах, независимо от генеза аллергического воспаления, установлено статистически значимо высокое содержание общей микробной флоры в группе АР и ПРС относительно группы контроля, превышающее 10⁶ КОЕ/мл. В частности, при АР и ПРС было обнаружено статистически значимо высокое содержание микроорганизмов, принадлежащих к родам Staphylococcus, Streptococcus и Enterobacteriaceae (превышает 10³), по сравнению с группой контроля.

При бронхиальной астме, независимо от генеза аллергического воспаления, установлено статистически значимо высокое содержание общей микробной флоры, превышающее 10⁶ КОЕ/мл. Определено статистически значимое высокое содержание микроорганизмов рода Staphylococcus, Streptococcus и Enterococcus при АБА и АТ на слизистой оболочке носа относительно группы контроля. При этом в группе АБА концентрация семейства Enterococcus статистически значимо выше, чем в группе АТ.

Общей особенностью микробного пейзажа слизистой оболочки носа при респираторной атопии, независимо от уровня аллергического воспаления респираторного тракта (АР и АБА), является статистически значимо высокое содержание всех исследуемых микроорганизмов (Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Enterobacteriaceae) и, соответственно, общего количества микробной флоры относительно группы контроля.

При респираторной псевдоатопии, независимо от уровня поражения респираторного тракта, определена статистически значимо высокая концентрация Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и общего количества микробной флоры относительно группы контроля.

При ПРС определено статистически значимо высокое содержание микроорганизмов рода Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. относительно группы контроля. Микроорганизмов рода Enterococcus при ПРС, как и в группе контроля, не обнаружено, тогда как при АТ на слизистой оболочке носа их концентрация статистически значимо выше, чем в группе контроля.

В группе больных АТ определена статистически значимо высокая концентрация Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. относительно группы контроля.

Обсуждение

Проведенное нами исследование выявило качественные и количественные изменения состава назальной микробиоты при различных клинико-патогенетических вариантах респираторной аллергии. Факты дисбиоза слизистой оболочки носа при аллергических заболеваниях респираторного тракта встречаются и в литературе. При этом результаты достаточно противоречивы, есть данные как об увеличении, так и об уменьшении количества условно-патогенной микрофлоры [2, 9, 16].

В настоящем исследовании продемонстрированы как общие, так и специфические изменения состава микробной флоры слизистой оболочки носа в зависимости от генеза аллергического воспаления и уровня поражения респираторного тракта.

Так, общей особенностью дисбиоза при аллергических риносинуситах, независимо от генеза воспаления (АР и ПРС), является наличие микроорганизмов рода Staphylococcus, таких как Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis. Состав микроорганизмов, обитающих на слизистой оболочке носа, уже при минимальных отклонениях может являться маркером дисбиотических изменений. Изучение других родов микроорганизмов установило статистически значимо высокое содержание Staphylococcus, Streptococcus и Enterobacteriaceae (превышает 10³) при АР и ПРС по сравнению с группой контроля.

Для бронхиальной астмы, независимо от генеза аллергического воспаления, определено статистически значимо высокое содержание микроорганизмов рода Staphylococcus, Streptococcus и Enterococcus относительно группы контроля.

Таким образом, специфичным для респираторной атопии является численное преобладание всех изучаемых микроорганизмов относительно группы контроля. Эти результаты совпадают с большим количеством исследований, описывающих важную роль дисбиоза слизистой оболочки носа в патогенезе аллергических заболеваний [3, 12, 17, 18, 22]. Дисбиоз дыхательных путей может быть как следствием напряженного иммунитета, так и вероятным фактом бактериальной сенсибилизации. Изученные нами микроорганизмы относятся к условно-патогенной микрофлоре, поэтому увеличение их численности является дисбиотическим изменением слизистой оболочки носа и может быть следствием нарушения как системного, так и местного иммунитета.

При псевдоатопии, независимо от уровня поражения респираторного тракта (ПРС и АТ), обнаружен дисбиоз вследствие высокой концентрации микроорганизмов Staphylococcus, Streptococcus и общего количества микробной флоры по сравнению с группой контроля. Отличительной особенностью при респираторной псевдоатопии стало более высокое содержание Enterococcus при АТ, чем при ПРС. Есть факты, свидетельствующие о мукозальном дисбактериозе: увеличение количества условно-патогенной микрофлоры при ПРС, в частности повышение концентрации семейств Staphylococcus и Streptococcus [4, 11, 21, 24].

Проведенная нами сравнительная микробиологическая характеристика слизистой оболочки носа при различных клинико-патогенетических вариантах респираторной аллергии показала численное преобладание условно-патогенной микрофлоры при АР по сравнению с ПРС и группой контроля.

При АР на слизистой оболочке носа наблюдается выраженное увеличение содержания изучаемой микрофлоры по сравнению с ПРС. При этом в группе ПРС, несмотря на обеднение видового состава бактерий рода Staphylococcus, концентрация штаммов S. hominis была значительно выше по сравнению с таковой в группе АР (табл. 2).

При бронхиальной астме, в зависимости от генеза аллергического воспаления, также определены характерные особенности. Микроорганизмы рода Enterococcus при АБА обнаруживаются статистически значимо чаще, чем при АТ. Согласно данным литературы, эти бактерии обладают сенсибилизирующей активностью и могут инициировать аллергическое воспаление [5, 14].

При АР значительно увеличено количество условно-патогенной микрофлоры по сравнению с группой контроля. По данным литературы, семейство Enterobacteriaceae относят к микроорганизмам с нерегулярным присутствием в носовой полости [25].

В группе ПРС показано нарушение микробного пейзажа слизистой оболочки носа за счет возрастания КОЕ бактерий семейства Staphylococcus, Streptococcus и Enterobacteriaceae, а также общего числа микробной флоры. Вышеуказанные микроорганизмы являются представителями нормофлоры слизистой оболочки носа, но их суммарное количество не должно превышать 10³ КОЕ/мл. В литературе есть информация об увеличении количества условно-патогенной микрофлоры при ПРС, в частности о повышении концентрации семейств Staphylococcus и Streptococcus [6, 8, 10, 13].

При АТ определено увеличение содержания бактерий семейства Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Enterobacteriaceae и общего количества микробной флоры.

Значимое увеличение содержания всех исследуемых бактерий по сравнению с группой контроля при АБА согласуется с мнением ученых о выраженных дисбактериозах при атопических заболеваниях [15, 20]. Интересен тот факт, что количество бактерий рода Enterococcus при АБА статистически значимо выше, чем во всех исследуемых группах, включая группу контроля.

Проведенная нами сравнительная микробиологическая характеристика аллергических заболеваний респираторного тракта показала, что при АБА отмечаются наиболее выраженные изменения назальной микробиоты.

В группе ПРС и АТ общее количество микробной флоры составляет более 10⁶ КОЕ/мл, а в группах псевдоатопии превышает 10⁸ КОЕ/мл. Однако общее количество микробной флоры статистически значимо выше при АТ и АБА по сравнению с риносинуситом соответствующей этиологии. Увеличение количества условно-патогенных микроорганизмов может свидетельствовать о более выраженных иммунологических изменениях при атопии (АР, АБА) в отличие от псевдоатопии (ПРС, АТ).

Таким образом, при атопии установлено преобладание условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с псевдоатопией.

Полученные нами результаты исследования можно расценить как явления дисбактериоза, наступившего вследствие снижения местного и системного иммунитета из-за трофических нарушений слизистой оболочки носа. Микробный пейзаж слизистой оболочки носа в норме скуднее, чем пейзаж зева, поэтому любые, даже минимальные отклонения могут быть признаком дисбиоза, влекущим более серьезные проблемы со стороны макроорганизма [27].

Итак, при респираторной атопии (АР и АБА) определено доминирование условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с респираторной псевдоатопией (ПРС и АТ). При АР показано более высокое содержание семейства Enterobacteriaceae и Enterococcus и низкое количество Staphylococcus hominis, чем при ПРС. При АБА увеличена концентрация Enterococcus в отличие от АТ и АР. Увеличение численности бактерий семейства Enterobacteriaceae и Enterococcus на слизистой оболочке носа характеризует дисбактериоз, акцентируя важную роль этих семейств в запуске аллергического воспаления респираторного тракта атопического генеза. Отличительной межгрупповой особенностью изученных нами клинико-патогенетических вариантов респираторной аллергии является большая концентрация семейства Enterobacteriaceae при АР по сравнению с ПРС и микроорганизмов рода Enterococcus в группе АБА по сравнению с группой АТ. Таким образом, можно сделать вывод, что при аллергическом риносинусите (АР, ПРС) и бронхиальной астме (АБА, АТ) имеет место выраженный дисбактериоз за счет увеличения условно-патогенной флоры на слизистой оболочке носа по сравнению с группой контроля.

About the authors

Anna M. Lazareva

Research Institute of Medical Problems of the North, Federal Research Center Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: nuraaa@rambler.ru

PhD (Medicine), Junior Researcher, Laboratory of Clinical Pathophysiology

Россия, 660022, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznyaka str., 3g

S. V. Smirnova

Research Institute of Medical Problems of the North, Federal Research Center Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: svetvita@mail.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Head of the Scientific Direction

Россия, 660022, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznyaka str., 3g

O. A. Kolenchukova

Research Institute of Medical Problems of the North, Federal Research Center Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: kalina-chyikova@mail.ru

PhD, MD (Biology), Leading Researcher

Россия, 660022, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznyaka str., 3g

References

Supplementary files