Pediatric bacteremia and CNS infections associated with klebsiella pneumoniae: molecular genetic characteristics and clinical features

Full Text

Введение

Klebsiella pneumoniae является одним из наиболее значимых и опасных для жизни возбудителей внутрибольничных инфекций. Этот оппортунистический микроорганизм может вызывать инфекции кровотока, респираторного тракта, мочевыводящих путей, кожи и мягких тканей, воспаление мозговой оболочки головного и спинного мозга, приводя к увеличению госпитальной летальности, особенно у иммуносупрессированных пациентов, новорожденных и пожилых пациентов [19]. K. pneumoniae наряду с другими представителями порядка Enterobacterales имеет множество факторов, способствующих колонизации организма хозяина, а также способность к приобретению устойчивости к многим классам антибиотиков [6]. Геном K. pneumoniae может содержать большое количество детерминант резистентности, среди них особое значение имеют гены, кодирующие ферменты, разрушающие антибиотики. С точки зрения эпидемиологии наибольшую роль играют карбапенемазы групп: KPC, OXA-48, NDM и β-лактамазы расширенного спектра действия CTX-M типа [9, 18]. Распространение множественно-резистентных K. pneumoniae часто ассоциировано с международными клонами высокого риска, которые являются носителями генов карбапенемаз [24]. Изоляты, обладающие устойчивостью ко многим группам антибиотиков, а также имеющие дополнительные факторы вирулентности, играют большую роль в высокой смертности при инфекциях, ассоциированных c нозокомиальными патогенами [10].

Целью данного исследования было ретроспективное изучение молекулярно-генетических характеристик K. pneumoniae, выделенных из образцов крови и ликвора, а также описание клинических особенностей при бактериемии и инфекции ЦНС.

Материалы и методы

Бактериальные культуры. В период с 2014 по 2021 г. из положительных гемокультур и проб ликвора были отобраны 67 изолятов K. pneumoniae, которые были выделены от пациентов из двух многопрофильных детских стационаров: ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России (С1) — отделение реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), ОРИТ новорожденных, соматические отделения, и НИИ неотложной детской хирургии и травматологии Департамента здравоохранения г. Москвы (С2) — ОРИТ. Образцы крови инкубировали в анализаторе гемокультур «BACTEC 9050» (Becton Dickinson, США), «BacT/ALERT» (bioMerieux, Франция) до фиксации роста микроорганизмов, затем пробу отсевали на плотные питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя. Посевы производили на питательные среды: кровяной агар и Uri-select агар (BioRad, США), далее инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 24–48 ч. Идентификацию возбудителя проводили методом масс-спектрометрии MALDI-ToF (Bruker Daltonics, Германия).

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Были определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) следующих антибиотиков: меропенем, имипенем, колистин, азтреонам, тобрамицин, амикацин, гентамицин, фосфомицин, цефтазидим, цефепим, тикарциллин/клавуланат, пиперациллин/тазобактам, триметоприм/сульфаметоксазол, ципрофлоксацин. МПК антибиотиков определяли методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера–Хинтон (bioMerieux, Франция), Sensititre™ (ThermoScinetific, Великобритания). МПК меропенема определяли методом микроразведений в соответствии со стандартом (ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010). Результаты интерпретировали в соответствии с критериями Европейского комитета по тестированию чувствительности к антибиотикам (EUCAST), версия 10.0 (EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, version 10.0, 2020, pp. 10–20).

Все изоляты были разделены на штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и штаммы с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) в соответствии с рекомендациями [7]. Классификация базируется на чувствительности микроорганизмов к 6 группам антибиотиков: аминогликозидам (тобрамицин или гентамицин), пенициллинам (пиперациллин/тазобактам), карбапенемам (имипенем или меропенем), цефалоспоринам (цефотаксим, цефтриаксон или цефтазидим), фторхинолонам (ципрофлоксацин), сульфаниламидам (триметоприм/сульфаметоксазол). Изоляты, проявляющие устойчивость к 3 или 4 перечисленным группам, классифицировали как МЛУ, штаммы, резистентные к 5 или 6 группам, относили к ШЛУ.

Выделение ДНК и определение генов карбапенемаз. Для выделения ДНК использовали суточную культуру. Бактериальную ДНК выделяли согласно инструкции производителя с использованием коммерческих наборов «ГК-экспресс» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Полученные образцы хранили до использования при температуре –20°С.

Выявление генов, отвечающих за продукцию цефалоспориназ и карбапенемаз, проводили с использованием наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс ESBL CTX-M-FL» (CTX-M), «АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL» (KPC, OXA-48), «АмплиСенс MDR MBL-FL» (IMP, NDM, VIM) производства ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Проведение ПЦР осуществляли согласно инструкции производителя. ПЦР проводили с помощью амплификатора «LightCycler 96» (Roche, Швейцария/Германия).

Определение генов вирулентности и капсульных серотипов К1/К2. Гены вирулентности и принадлежность к капсульным серотипам К1/К2 определяли методом мультиплексной ПЦР [4]. Было определено наличие следующих генов: magA, специфичного для серотипа К1; rmpA, регулирующего синтез мукоидного фенотипа; entB, ассоциированного с синтезом энтеробактина; ybtS, связанного с синтезом йерсиниебактина; kfu, ответственного за связывание трехвалентного железа; iutA, кодирующего транспортер аэробактина; mrkD, ассоциированного с фимбриальными адгезинами 3 типа; allS, связанного с метаболизмом аллантоина; wzi, специфичного для серотипа К2. Ген entB использовался в качестве положительного контроля, так как широко распространен у изолятов K. pneumoniae. Результаты оценивали проведением электрофореза в 2% агарозном геле. Последовательности праймеров для определения генов вирулентности и K1/K2 были описаны Compain F. и соавт. [4].

Биопленкообразование. Анализ формирования биопленок на абиотической поверхности проводили с использованием сердечно-мозгового бульона (BHB; Becton Dickinson, США) по ранее описанной методике с модификациями [12].

Биопленки выращивали в 96-луночных полистироловых планшетах с плоским дном в трех повторах. Аликвоту 20 мкл бактериальной суспензии с мутностью 0,8 по МакФарланду вносили в лунки, содержащие 180 мкл BHB с последующей 24-часовой инкубацией при 37°С без перемешивания. После удаления бульона и планктонных клеток фиксировали биопленки добавлением 200 мкл 2,5% глутарового альдегида (инкубация 5 мин при комнатной температуре). Затем трижды промывали дистиллированной водой. Для окрашивания вносили 200 мкл кристаллического фиолетового (0,1% спиртовой раствор), инкубировали в течение 10 мин. После этого трижды промывали дистиллированной водой. Для растворения и обесцвечивания связанного красителя добавляли 200 мкл 95% этанола — инкубация 30 мин. Оптическую плотность итогового раствора измеряли при длине волны 590 нм с использованием планшетного считывателя «Infinite 200M» (Tecan, Австрия). Интенсивность биопленкообразования определяли согласно рекомендациям APMIS 2007, Stepanović S. и соавт. [23].

Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ). Генотипирование штаммов K. pneumoniae проводили методом МЛСТ согласно схеме, предложенной Институтом Пастера (Париж) [5]. Был проведен анализ семи «генов домашнего хозяйства»: rpoB (бета-субъединицы РНК-полимеразы), gapA (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы), mdh (малатдегидрогеназы), pgi (фосфоглюкоза-изомеразы), phoE (фосфорина Е), infB (фактора инициации трансляции 2), tonB (периплазматического энергетического трансдуцера). Полученные нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программы SeqMan (DNASTAR Inc.) и затем сравнивали с аллельными профилями базы данных BIGSdb (https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella).

Оценка клинических данных. Ретроспективно были проанализированы клинические данные пациентов, из крови или ликвора которых была выделена K. pneumoniae.

Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ SPSS 20.0 (SPSS Statistics, США) и Microsoft Excel 2010. Различия считались статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты

Чувствительность к антибиотикам и фенотипы резистентности. Чувствительность к антимикробным препаратам изолятов K. pneumoniae представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Чувствительность K. pneumoniae к антимикробным препаратам

Table 1. K. pneumoniae sensitivity to antimicrobial drugs

Антимикробный препарат Antimicrobial drug	Чувствительный Sensitive		Чувствительный при повышенной экспозиции Sensitive at increased exposure		Резистентный Resistant
	n	%	n	%	n	%
Меропенем Meropenem	37	55	7	11	23	34
Имипенем Imipenem	39	58	5	8	23	34
Колистин Colistin	46	69	–	–	21	31
Азтреонам Aztreonam	6	9	–	–	61	91
Тобрамицин Tobramycin	8	12	–	–	59	88
Амикацин Amikacin	26	39	–	–	41	61
Гентамицин Gentamicin	16	24	–	–	51	76
Фосфомицин Fosfomycin	37	55	–	–	30	45
Цефтазидим Ceftazidime	5	8	–	–	62	92
Цефепим Cefepime	4	6	6	9	57	85
Тикарциллин/клавуланат Ticarcillin/clavulanat	3	5	1	1	63	94
Пиперациллин/тазобактам Piperacillin/tasobactam	12	18	4	6	51	76
Триметоприм/сульфаметоксазол Trimethoprim/sulfamethoxazole	17	25	–	–	50	75
Ципрофлоксацин Ciprofloxacin	12	18	6	9	49	73

 

Фенотип МЛУ проявили 11 (16%) изолятов, фенотип ШЛУ имели 29 (43%) штаммов. При этом ШЛУ в сочетании с устойчивостью к колистину была выявлена у 17 (25%) штаммов. Достоверные различия по чувствительности к антибиотикам между двумя стационарами были определены только для ципрофлоксацина. Для изолятов из стационара С1 ципрофлоксацин in vitro был более эффективен, чем из стационара С2 (р = 0,0247).

Гены резистентности. Ген, отвечающий за продукцию цефалоспориназы bla_CTX-M, был обнаружен у 57 изолятов, что составило 85%. Основной детерминантой устойчивости к карбапенемам был ген bla_OXA-48 — частота его выявления составила 33%. Ген МБЛ (металло-β-лактамаза) bla_NDM обнаруживался значительно реже — у 9% изолятов. Комбинацию bla_OXA-48 и bla_NDM имели 7% штаммов. Гены bla_KPC, bla_IMP и bla_VIM найдены не были. Было определено, что bla_NDM достоверно чаще определялся в период с 2018 по 2021 гг. (р = 0,003).

Вирулентность. Все штаммы K. pneumoniae имели гены entB и mrkD. В значительной доле случаев определялся ген ybtS — 52 (78%). Аэробактин iutA был обнаружен у 12/67 (18%) штаммов. Способность к связыванию трехвалентного железа, кодируемая геном kfu, была характерна всего для двух изолятов (3%). Ген wzi, кодирующий капсульный серотип К2, был определен у семи изолятов K. pneumoniae. Штаммы, относящиеся к гипервирулентному серотипу К1, в нашем исследовании не встречались. Гены rmpA и allS не определялись ни у одного из изученных изолятов. Комбинации различных генов вирулентности у одного изолята представлены на рис. 1.

 

Рисунок 1. Комбинации детерминант вирулентности у изолятов K. pneumoniae

Figure 1. Combinations of virulence determinants in K. pneumoniae isolates

 

Биопленкообразование. Основная масса изолятов K. pneumoniae была способна к образованию биопленок. Всего два изолята (3%) не образовывали биопленок. Умеренную способность к образованию биопленок проявлял 41 (61%) изолят; сильную — 14 (21%) штаммов и слабую — 10 (15%) изолятов. Было определено, что в период с 2014 по 2017 г. чаще выявлялись изоляты, образующие сильные биопленки (р = 0,0005), а в период с 2018 по 2021 г. преобладали изоляты с умеренной способностью к образованию биопленок (р = 0,002).

Генотипирование. У изученных нами изолятов K. pneumoniae было обнаружено 27 различных генотипов. Наиболее часто встречающимися были: ST307 — 21%, ST395 — 12%, ST48 — 7%, ST39 — 6% и ST29 — 6% (рис. 2).

 

Рисунок 2. Генотиповой состав K. pneumoniae при бактериемии и инфекции ЦНС

Figure 2. K. pneumoniae genotype composition in bacteremia and CNS infection

 

Основная масса резистентных к карбапенемам изолятов принадлежала к генотипам ST307, ST395, ST48, ST29, ST2975 и ST198. Устойчивые к колистину изоляты относились к генотипам ST395 (5/17), ST307 (4/17), ST2975 (3/17), по одному изоляту — к генотипам ST48, ST11, ST39, ST29, ST985. На рис. 3 представлены генотипы изолятов, обладающих карбапенемазами.

 

Рисунок 3. Распространенность карбапенемаз среди представителей различных генотипов

Figure 3. Carbapenemase prevalence among representatives of various genotypes

 

Из табл. 2 можно сделать вывод, что факторы, отвечающие за гипервирулентность изолятов, распространены в определенных генотипах. Так сидерофор аеробактин (iutA) в 10/12 случаев определялся у представителей ST307 (р < 0,05). Гипермукоидный гипервирулентный капсульный К2 серотип в шести из семи случаев был определен у изолятов ST395 (p < 0,05).

 

Таблица 2. Детерминанты вирулентности у представителей различных генотипов K. pneumoniae

Table 2. Virulence determinants in representatives of various K. pneumoniae genotypes

Генотип (n) Genotype (n)	n	K2 (wzi)	ybtS	mrkD	entB	kfu	iutA
ST307 (14)	10		+	+	+		+
	4		+	+	+
ST395 (8)	5	+	+	+	+
	1		+	+	+
	1			+	+
	1	+	+	+	+		+
ST48 (5)	5		+	+	+
ST39 (4)	4		+	+	+
ST29 (4)	4		+	+	+
ST2975 (3)	3		+	+	+
ST377 (3)	3			+	+
ST45 (2)	2		+	+	+
ST198 (2)	2		+	+	+
ST4 (2)	2		+	+	+
ST6 (2)	2		+	+	+
ST20 (2)	2			+	+
ST11 (2)	2			+	+
ST784 (1)	1		+	+	+
ST309 (1)	1		+	+	+
ST866(1)	1		+	+	+
ST667 (1)	1		+	+	+
ST147 (1)	1		+	+	+
ST70 (1)	1			+	+
ST17 (1)	1			+	+
ST351 (1)	1			+	+
ST985 (1)	1		+	+	+
ST1079(1)	1			+	+
ST4652 (1)	1			+	+	+
ST736 (1)	1			+	+	+
ST881 (1)	1	+	+	+	+
ST584(1)	1			+	+		+
Всего Total	67	7 (10%)	52 (78%)	67 (100%)	67 (100%)	2 (3%)	12 (18%)

 

Представители ST307 были способны к формированию биопленок разной интенсивности: половина изолятов формировала умеренные биопленки, четыре изолята — сильные и три — слабые. Половина изолятов ST395 также формировала умеренные биопленки, три — слабые и один изолят не формировал биопленку. Изоляты ST48 имели сильные и умеренные биопленки. Два из трех изолятов ST2975 формировали умеренные биопленки и один — сильную. Все представители ST39, ST29, ST198, ST6, ST4 образовывали биопленки умеренной интенсивности. Оба изолята генотипа ST11 формировали сильные биопленки. Популяционная структура K. pneumoniae в разных отделениях по стационарам представлена в табл. 3.

 

Таблица 3. Генотипическое разнообразие K. pneumoniae в отделениях в разные годы

Table 3. K. pneumoniae genotypic diversity in the departments in different years

Год Year	ОРИТ С1 ICU H1	ОРИТ новорожденных С1 ICU of newborns H1	Соматические отделения С1 Somatic departments H1	ОРИТ С2 ICU H2
2014	ST11++, ST48++	ST48+, ST307++	–	ST70+
2015	ST17+, ST307+++	ST48++, ST351+	–	–
2016	ST307++++, ST4652+	–	–	ST395+
2017	ST307++, ST395+, ST784+ (DLV** ST17), ST881+	–	ST4+	ST4+, ST45+, ST307++, ST377++
2018	ST6++, ST29+, ST307+, ST985+ (SLV* ST29), ST2975+ (SLV ST307)	ST29++, ST39+ ST198++, ST309+ ST395+, ST2975++ (SLV ST307)	–	–
2019	ST29+, ST395+	ST395+	–	ST395+, ST377+
2020	–	ST20+, ST39+	ST866+, ST1079+	ST395+, ST584+, ST667+ (SLV ST39)
2021	ST45+	ST20+, ST395+, ST736+	–	ST39++ (SLV ST667), ST147+

Примечание. * — однолокусный вариант; ** — двухлокусный вариант; «+» — частота выделения.

Note. * — a single-locus variant; ** — a two-locus variant; “+” — frequency of allocation.

 

В ОРИТ С1 в течение четырех лет, с 2015 по 2018 г. при бактериемии и инфекции ЦНС у детей часто выделялись K. pneumoniae с генотипом ST307. В 2018 г. появился его однолокусный вариант ST2975. Изоляты ST395 выделялись в 2017 и 2019 гг. Генотип ST29 встречался с 2018 по 2019 г. Изоляты с генотипами ST6, ST11, ST17, ST784, ST881, ST985 и ST4652 встречались только в этом отделении.

В ОРИТ новорожденных С1 в 2014 и 2015 гг. наблюдалось выделение K. pneumoniae с генотипом ST48. Изоляты ST395 определялись в 2018, 2019 и 2021 гг. Генотип ST39 встречался в 2018 и 2020 гг. Штаммы, имеющие ST20, были выделены в этом отделении в 2020 и 2021 гг. Генотипы ST20, ST198, ST309, ST351 и ST736 определялись только в ОРИТ новорожденных С1.

Спорадические случаи бактериемии в двух соматических отделениях С1 в 2017 и 2020 гг. ассоциированы с K. pneumoniae разных генотипов, которые не входят в число клонов высокого международного риска.

В ОРИТ С2 в 2016, 2019 и 2020 гг. определялись изоляты K. pneumoniae с генотипом ST395. В 2017 и 2019 гг. выделялись штаммы ST377. В 2020 г. был выявлен изолят с генотипом ST667, а в 2021 г. появился его однолокусный вариант ST39. Штаммы с генотипами ST70, ST147, ST377, ST584 и ST667 выделялись только из стационара С2.

Представители клонов высокого международного риска ST48, ST29, ST198, ST2975 (SLV 307) встречались только в стационаре С1. ST377 был характерен только для стационара С2. В то же время такие генотипы международного риска, как ST39, ST307 и ST395, были определены в обоих стационарах.

Клинические данные. По результатам оценки клинических данных изоляты K. pneumoniae были выделены от 64 детей в возрасте от 5 суток до 17 лет. Медиана возраста — 4 месяца (1 м; 12 м). Пациенты были разделены на 4 возрастные группы: I (0–1 год) — 46 детей (71,8%), II (1–3 лет) — 3 ребенка (4,7%), III (3–7 лет) — 3 ребенка (4,7%), IV (7–17 лет) — 12 детей (18,8%). Характеристика изолятов, выделенных от детей разных возрастных групп, отображена в табл. 4.

 

Таблица 4. Характеристика изолятов K. pneumoniae в разных возрастных группах

Table 4. Characteristics of K. pneumoniae isolates in different age groups

Группы Groups Параметры Parameters		Группа 1 Group 1 n = 46	Группа 2 Group 2 n = 3	Группа 3 Group 3 n = 3	Группа 4 Group 4 n = 12
Карбапенемазы Carbapenemases	OXA-48	13	2	2	5
	NDM	5	–	–	1
	OXA-48+NDM	4	–	–	1
Фенотип резистентности Resistance phenotype	Чувствительные Sensitive	8	–	–	1
	МЛУ MDR	8	1	–	1
	ШЛУ XDR	16	2	3	7
	ШЛУ+COL XDR+COL	14	–	–	3
Интенсивность биопленок Biofilm intensity	Нет биопленки No biofilm	–	–	–	2
	Слабая Weak	6	2	–	2
	Умеренная Moderate	31	1	2	5
	Сильная Strong	9	–	1	3
Вирулентность Virulence	Иерсиниебактин Yersiniebactin	36	2	2	10
	Аеробактин Aerobactin	8	2	1	1
	К2 серотип K2 serotype	5	–	–	2
	Система kfu System kfu	2	–	–	–
Генотипы (ST) Genotypes (ST)		307 (n = 10), 395 (n = 6), 48 (n = 5), 29 (n = 3), 2975 (n = 3), 11 (n = 2), 20 (n = 2), 39 (n = 2), 198, 4, 6, 45, 309, 351, 736, 784, 866, 881, 985, 4652	307 (n = 2), 377 (n = 1)	307 (n = 2), 377 (n = 1)	39 (n = 2), 395 (n = 2), 4, 29, 45, 70, 147, 584, 667, 1079

 

Штаммы K. pneumoniae были получены от детей, наблюдавшихся с хирургической патологией (врожденные пороки сердца — 30%, абдоминальная патология — 39%, тяжелая сочетанная травма — 12%) и с соматическими заболеваниями, сопровождающимися антибактериальной и/или глюкокортикостероидной терапией — 14%. Из 60 пациентов с положительной гемокультурой диагноз «Сепсис» был у 19 (32%), из них 10 имели неблагоприятный исход (всего было 16 неблагоприятных исходов). В четырех случаях положительные высевы K. pneumoniae были получены из образцов ликвора, при этом у двух пациентов с диагнозом «Менингит». Микробиологическая характеристика неблагоприятных исходов отображена в табл. 5.

 

Таблица 5. Характеристика K. pneumoniae при неблагоприятных исходах бактериемии и инфекции ЦНС (n = 16)

Table 5. Characteristics of K. pneumoniae in unfavorable outcomes of bacteremia and CNS infection (n = 16)

Фенотип резистентности Resistance phenotype	Гены резистентности Resistance genes	Вирулентность Virulence	Биопленки Biofilms	ST******
Чувствительные — 25% Sensitive — 25% ШЛУ* — 25% XDR* — 25% ШЛУ + R** к колистину — 50% XDR + R** to colistin — 50%	CTX-M — 100% OXA-48 — 31% NDM — 6% OXA-48+NDM — 6%	Энтеробактин — 100% Enterobactin — 100% Фимбриальный адгезин — 100% Fimbrial adhesive — 100% Иерсиниебактин — 88% Yersiniebactin — 88% Аэробактин — 25% Aerobactin — 25% К2 капсульный серотип — 13% K2 capsule serotype — 13%	L*** — 13% М**** — 50% S***** — 37%	307 — 25% 395 — 13% 11 — 13% 6, 29, 39, 45, 48, 784, 985, 2975 — по 6% 6, 29, 39, 45, 48, 784, 985, 2975 — by 6%

Примечание. * — широкая лекарственная устойчивость, ** — широкая лекарственная устойчивость, в том числе устойчивость к колистину, *** — слабая биопленка, **** — умеренная биопленка, ***** — сильная биопленка, ****** — сиквенстип.

Note. * — extremely resistant, ** — extremely resistant, including resistance to colistin, *** — weak biofilm, **** — moderate biofilm, ***** — strong biofilm, ****** — sequenstype.

 

При бактериемии с летальным исходом, ассоциированной с K. pneumoniae, 12 пациентов были в возрасте до одного года, два пациента — от года до семи лет, и два — от семи до 17 лет. 15 пациентов наблюдались с хирургической патологией, и один — с соматической, у 10 был выявлен сепсис.

Обсуждение

Результаты данного исследования подтверждают общую негативную тенденцию последних лет — возрастание уровня резистентности у изолятов K. pneumoniae. Инфекции кровотока и ЦНС, ассоциированные с карбапенем-резистентными K. pneumoniae, распространены среди пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии [29]. При изучении молекулярно-генетических характеристик штаммов K. pneumoniae, выделенных из образцов крови и ликвора у детей, нами был обнаружен высокий уровень устойчивости штаммов к антимикробным препаратам. Множественно-резистентные и экстремально резистентные штаммы составляли 16 и 43% соответственно. Около четверти изолятов проявляли широкую лекарственную устойчивость, в том числе к колистину, который является последней линией терапии. В исследованиях наших китайских коллег распространенность множественно-резистентных K. pneumoniae при инфекциях кровотока варьируется от 18 до 61% [25]. В нашем исследовании до 88% изолятов K. pneumoniae проявляли устойчивость к аминогликозидам, 85% — к цефепиму, 91% — к азтреонаму. К карбапенемам, колистину и бисептолу были нечувствительны 34, 31 и 75% изолятов соответственно. Полученные результаты во многом отличаются от резистентности при инфекциях кровотока в США, где к аминогликозидам резистентны около 17%, к цефепиму — 9%, к азтреонаму — 16%, к меропенему — 9% и к бисептолу — 33% штаммов K. pneumoniae. При этом наши коллеги отмечают значительную роль множественно-резистентных изолятов K. pneumoniae при инфекциях кровотока [15]. Основной причиной резистентности к карбапенемам изолятов клебсиеллы из кровотока и ликвора была продукция карбапенемаз, в частности bla_OXA-48. Она распространена во многих странах [22], в том числе в России [1].

Ранее считалось, что бактерии, имеющие множественную резистентность, не способны проявлять гипервирулентность. В последние годы появляется много сообщений о выделении одновременно гипервирулентных и мультирезистентных штаммов K. pneumoniae [13, 16]. Эти штаммы могут представлять особую опасность для пациентов, поскольку способны вызывать тяжелые инфекции и длительно персистировать в организме пациента и в больничной среде. При изучении факторов вирулентности нами было обнаружено, что сидерофор энтеробактин определялся во всех клебсиеллах, как и во многих других исследованиях. Сидерофор иерсиниебактин ybtS, по результатам зарубежных работ, наиболее часто ассоциирован с инфекциями респираторного тракта, а у изолятов, выделенных из крови, встречается редко [3]. При этом в нашей работе 78% изолятов имели ген иерсиниебактина. Сидерофор аэробактин является одним из маркеров гипервирулентности [20]. Встречаемость гена аэробактина iutA достигает 56,8% у пациентов с менингитом [11]. При пиогенных абсцессах печени встречаемость этого фактора достигает 85,3% [28]. У исследованных нами изолятов аэробактин был выделен в 18%. Ген mrkD, кодирующий фимбрии 3 типа, отвечающие за биопленкообразование, встречался у всех изученных нами изолятов, это соотносится с данными других исследований [28]. Считается, что K. pneumoniae, относящиеся к К1/К2 серотипам, более вирулентные, чем представители других серотипов [20]. Мы не выявили изолятов К1-серотипа, а к серотипу К2 принадлежало 10% изолятов. Стоит отметить, что 6 из 7 изолятов К2-серотипа имели генотип ST395. Эти данные согласуются с результатами отечественного исследования, в котором капсульный серотип К2 обнаруживался у 15,7% штаммов и ассоциировался с ST395 [14]. Ген kfu, отвечающий за обмен железа, встречается редко, у изученных нами изолятов — всего в 3%. Аналогичные данные получены российскими и зарубежными учеными [6, 21].

У нозокомиальных изолятов клебсиеллы чаще всего наблюдается продукция умеренных и сильных биопленок [2]. Наши результаты соответствуют этим данным — 61% изолятов образовывали умеренные биопленки и 21% — сильные.

Представители генотипа ST307, выделенные из кровотока, часто имеют множественную лекарственную устойчивость и гипервирулентность [15], они способны вызывать внутрибольничные вспышки [26]. ST307 в этом исследовании был самым распространенным (21%). Изоляты этого генотипа чаще остальных обладали карбапенемазами и факторами гипервирулентности. Этот генотип был характерен для обоих стационаров и в некоторых отделениях выявлялся на протяжении нескольких лет.

Факторами риска для возникновения K. pneumoniae-ассоциированных инфекций кровотока и ЦНС являются хирургические вмешательства, травмы, наличие внутрисосудистого катетера, интубация трахеи, госпитализация в отделение реанимации, предшествующая антибиотикотерапия [27]. В нашей работе большая часть пациентов наблюдалась с хирургической патологией (68%). У 14% пациентов до выявления бактериемии или инфекции ЦНС проводились курсы антибиотикотерапии и/или применялись глюкокортикостероиды.

В исследовании Girometti N. и соавт. отмечено, что инфекции кровотока связаны с более высокой смертностью, чем инфекции других локализаций [8]. Наши данные соотносятся с этим утверждением, уровень летальности по данным проведенного исследования составил 25%. Высокая смертность, возможно, ассоциирована с вирулентностью микроорганизмов [17]. В нашем исследовании у изолятов, выделенных при неблагоприятных исходах, определялось множество факторов вирулентности, в частности иерсиниебактин — 88%, аэробактин — 25% и капсульный серотип К2 — 13%.

Заключение

Наши результаты подтверждают, что бактериемии и инфекции ЦНС, ассоциированные с K. pneumoniae, относительно распространены у педиатрических пациентов, что представляет собой серьезную проблему для здравоохранения. Эти инфекции значительно осложняют течение основного заболевания и связаны с большим числом летальных исходов. Нерациональное применение антибиотиков способствует селективному распространению множественно-резистентных изолятов, которые к тому же приобретают факторы вирулентности. На основании этого клиницистам необходимо строго контролировать применение антимикробных препаратов, обеспечивая их рациональное использование.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование не имело финансовой поддержки.

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов, который необходимо обнародовать.

About the authors

Zulfirya Z. Sadeeva

National Medical Research Center for Children’s Health of the Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: zulfiryasadeeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4587-0902

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Microbiology

Россия, Moscow

Irina E. Novikova

National Medical Research Center for Children’s Health of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: novikovayudina@outlook.com
ORCID iD: 0000-0003-4234-0209

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Microbiolog

Россия, Moscow

Anna V. Lazareva

National Medical Research Center for Children’s Health of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: annalaz71@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3896-2590

DSc (Medicine), Head Researcher, Laboratory of Molecular Microbiology, Head of the Microbiology Laboratory

Россия, Moscow

Natalya M. Alyabyeva

National Medical Research Center for Children’s Health of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: bambolinka@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9365-9143

PhD (Medicine), Senior Researcher, Head of the Laboratory of Experimental Immunology and Virology

Россия, Moscow

Olga V. Karaseva

National Medical Research Center for Children’s Health of the Ministry of Health of the Russian Federation; Clinical and Research Institute of Emergency Pediatric Surgery and Trauma, Department of Public Health of Moscow

Email: karaseva.o@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-9418-4418

DSc (Medicine), Head of the Department of Emergency Surgery and Pediatric Trauma; Deputy Director for Scientific Work, Head of the Department of Combined Trauma, Anesthesiology-Resuscitation

Россия, Moscow; Moscow

Olga G. Yanushkina

Clinical and Research Institute of Emergency Pediatric Surgery and Trauma, Department of Public Health of Moscow

Email: spartak-lfc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6227-466X

Researcher, Department of Combined Trauma

Россия, Moscow

Marina G. Verschinina

National Medical Research Center for Children’s Health of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: labckb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6051-5231

PhD (Medicine), Leading Researcher, Laboratory of Medical Genomics

Россия, Moscow

Andrey P. Fisenko

National Medical Research Center for Children’s Health of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fisenko@nczd.ru
ORCID iD: 0000-0001-8586-7946

DSc (Medicine), Professor, Director 

Россия, Moscow

References

Supplementary files