ESCHERICHIA COLI phenotypic characteristics and antagonistic activity in opisthorchiasis invasion

L. V. Kataeva; Катаева Л. В.; N. F. Karpukhina; Карпухина Н. Ф.; A. A. Vakarina; Вакарина А. А.; O. N. Kolotova; Колотова О. Н.; T. F. Stepanova; Степанова Т. Ф.; K. B. Stepanova; Степанова К. Б.

doi:10.15789/2220-7619-ECP-13303

ESCHERICHIA COLI phenotypic characteristics and antagonistic activity in opisthorchiasis invasion

Authors: Kataeva L.V.¹, Karpukhina N.F.¹, Vakarina A.A.¹, Kolotova O.N.¹, Stepanova T.F.¹, Stepanova K.B.¹
Affiliations:
1. Tyumen Region Infection Pathology Research Institute
Issue: Vol 13, No 6 (2023)
Pages: 1049-1057
Section: ORIGINAL ARTICLES
URL: https://iimmun.ru/iimm/article/view/13303
DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-ECP-13303
ID: 13303

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Opisthorchis felineus invasion in human causes inflammatory and dyskinetic disorders of the gastrointestinal tract accompanied by altered phenotypic characteristics in colon microbiota. The aim of research — study an impact of the Escherichia coli isolate phenotypic characteristics on Klebsiella spp. bacteria, isolated from colonic contents of patients with diagnosed opisthorchiasis as well as E. coli antagonistic activity. Materials and methods. The phenotypic properties of 54 E. coli isolates and 8 genus Klebsiella isolates obtained from colonic contents of patients with diagnosed opisthorchiasis were assessed. Identification of isolates and analysis of proteomic profiles were performed using Maldi BioTyper 3.0 software. 204 co-cultivation datasets were analyzed investigating antagonistic activity of E. coli isolates with varying properties on Klebsiella spp. E. coli and Klebsiella spp. isolates were examined by whole genome sequencing. Results. E. coli bacteria with typical phenotypic characteristics showed significantly more prominent antagonistic activity against Klebsiella spp. A significantly higher level of antagonistic activity against K. oxytoca bacteria vs K. pneumoniae strains. The proteomic bacterial strain profiles were divided into clusters depending on the level of antagonistic activity. E. coli molecular serotyping for O- and H-antigens revealed the genes of enterotoxigenic, enteroinvasive and extraintestinal pathogens in 60.0% of cases. Strains with the highest antagonistic activity index, which are carriers of the genes typical to enterotoxigenic E. coli sequence serotypes O6:H1 and O6:H5, were identified. The genome of such strains consisted of the largest number of virulence gene complexes: adhesins, invasins, toxins, bacteriocins. Multilocus sequence typing and sequence serotyping of E. coli and K. pneumoniae strains established their heterogeneity; K. oxytoca isolates were identified as ST242 and ST176. All strains were characterized by homology of antibiotic resistance markers (oqxA, oqxB, fosA) and a variety of beta-lactam resistance gene variants. Conclusion. It was found that E. coli isolates with typical phenotypic characteristics and carriers of virulence gene complexes exhibited significantly more pronounced antagonistic activity against Klebsiella spp. isolated from colonic contents of patients with diagnosed opisthorchiasis.

Keywords

antagonistic activity, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, proteinograms, molecular serotyping, sequence types, virulence gene complexes, resistance markers

Full Text

Введение

Кишечная микробиота — одна из основных гомеостатических систем организма, дисбаланс которой становится причиной многих соматических и инфекционных заболеваний. Паразитирование гельминтов в организме хозяина, вызывает патологические изменения тканей и органов, усугубляя нарушение микробиоценоза [15]. Описторхоз, относящийся к группе биогельминтозов, наносит немалый ущерб здоровью населения. Течение болезни при данной нозологии нередко сопровождается хронизацией процесса и необратимыми осложнениями [3].

Различные виды и биотопы микроорганизмов находятся в состоянии топической и пищевой конкуренции, обеспечивающей образование синтрофных связей, обмен генетическим материалом, формирование консорциумов, реализующиеся в механизме антагонизма [2]. Феномен оппозитного влияния микросимбионтов на их биологические свойства (антагонистический, антилизоцимный, персистентный потенциал и биопленкообразование) позволяет реализовать распознавание чужеродных патогенов в микробиоте [4]. В частности, жизнедеятельность гельминта O. felineus в организме «хозяина» оказывает системное влияние на микробиоту желчевыводящих путей кишечного биотопа, приводящее к изменению ее вирулентных свойств и нарушению барьерной функции [15]. Паразитарные инвазии способствуют нарушению симбиотических и синергических взаимоотношений бактерий в макроорганизме, обеспечивая трансформацию таксономического состава микробиоты, изменение факторов и механизмов микробной регуляции. Активация антагонистических свойств культуры осуществляется при условии улучшения ее метаболических и ростовых характеристик. Ингибирование антагонистической активности бактерий — представителей нормобиоты связано с подавлением их антимикробных факторов и функциональных свойств патогенами, а также с негативным действием на активность генов, экспрессирующих продукты обмена [12].

Постоянный представитель кишечной микробиоты млекопитающих E. coli, преимущественно не проявляет патогенной активности, однако в последнее время отмечается ее способность к продукции токсинов [6]. Установлено, что при описторхозной инвазии в составе кишечной микробиоты человека выявляются E. coli, в геноме которых обнаруживаются маркеры патогенных E. coli — носителей кластеров О-антигенов и H-антигенов, ассоциированных с вирулентностью. Обмен мобильными генетическими элементами ведет к появлению новых вариантов E. coli, обладающих генами, кодирующими различные факторы патогенности [15], провоцируя аномальные воспалительные реакции, различные дегенеративные и злокачественные эффекты в пораженном органе.

Некоторые комменсальные штаммы бактерий могут контролировать рост патогенных бактерий, однако при инвазии O. felineus количество их бактериальных клеток снижается и приводит к изменению микробиоты кишечника, что показано на экспериментальной модели (инвазированные хомяки) [20].

Одним из основных микробных патогенов при описторхозной инвазии являются бактерии рода Klebsiella spp. (в 19,6±7,4% случаев) [15]. Классический тип K. pneumoniae чаще вызывает инфекции у ослабленных реанимационных пациентов, в то время как гипервирулентные штаммы с гипермукоидным фенотипом вызывают тяжелые инфекции у ранее здоровых пациентов [10]. K. oxytoca также вызывает нозокомиальные и внебольничные инфекции, может быть причиной тяжелого геморрагического колита [8].

Таким образом, изучение функционирования микропаразитоценоза при инфекционно-инвазионном процессе представляется актуальной проблемой, в том числе с позиций молекулярно-генетических исследований. Чрезвычайно важно изыскание новых подходов для профилактики инфекций и дальнейших исследований по снижению риска осложнений воспалительного характера после дегельминтизации.

Цель исследования — определить антагонистическую активность изолятов E. coli в отношении бактерий Klebsiella spp., выделенных из содержимого толстой кишки пациентов с диагнозом «Описторхоз».

Материалы и методы

Изучены фенотипические свойства 54 изолятов E. coli и 8 — бактерий рода Klebsiella (3 — K. oxytoca; 5 — K. pneumoniae), выделенных из содержимого толстой кишки пациентов с диагнозом «Описторхоз». Штаммы E. coli разделены по биохимическим свойствам на группы: ферментирующие/не ферментирующие лактозу (Lac+/Lac–); обладающие/не обладающие гемолитической активностью (Gem+/Gem–); подвижные/неподвижные (подв.+/подв.–). Микробиологические исследования проводились классическим бактериологическим методом. Видовую идентификацию бактерий подтверждали методом масс-спектрометрии с использованием программного обеспечения Maldi BioTyper 3.0. Уровень идентификации изолятов выше 2.0 свидетельствовал о высокой достоверности. Пакет прикладных программ позволил изучить протеомный профиль всех исследованных штаммов, свидетельствующий о гомологии их белковых спектров и выражающийся коэффициентом корреляции.

Проведено 204 исследования антагонистической активности изолятов E. coli с различными свойствами в отношении бактерий Klebsiella spp. Определение АА бактерий проводили по методике совместного культивирования в жидкой питательной среде. Для этого суточную агаровую культуру смывали стерильным физиологическим раствором и готовили суспензию, содержащую 500 млн микробных клеток в 1 мл. В 5,0 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) с pH 7,2–7,4 вносили 1,0 мл взвеси E. coli и 0,1 мл — Klebsiella spp. Суспензию инкубировали при 37°С и через 24, 48 и 72 ч из бульонных культур готовили ряд последовательных десятикратных разведений. Из разведений 10^–5 и 10^–6 производили высевы по 0,1 мл, в двойной повторности на чашки Петри со средой Левина. Посевы выдерживали в термостате при 37°С 18–20 ч, после чего подсчитывали число выросших колоний E. coli и Klebsiella spp. на каждой чашке отдельно. Значение индекса антагонистической активности (ИАА) вычисляли по формуле (%):

$И А А = \frac{К}{К + Ф} \times 100$ ,

где К — число колоний E. coli; Ф — число колоний Klebsiella spp. (объекта антагонизма), выросших на плотной питательной среде при высеве из МПБ после сокультивирования.

Все штаммы E. coli по выраженности АА были разделены на три группы. В группу с низкой АА были отнесены штаммы с показателем ≤ 29; штаммы с показателем от 30 до 70 составили среднюю группу; штаммы, которые имели ИАА более 70, характеризовали как обладающие высокой АА.

Определение и оценка чувствительности к антибиотикам изолятов E. coli и Klebsiella spp. осуществлялись по минимальной подавляющей концентрации (МПК) в автоматическом режиме (Sensititre Aris 2x).

Штаммы E. coli и K. pneumoniae изучены методом полногеномного секвенирования. Полученные единичные прочтения для каждого штамма были собраны в контиги при помощи программы Unicycler v.0.4.7. Образцы с величиной средних покрытий геномов выше 200 свидетельствовали о достаточном объеме данных. Обработка результатов полногеномного секвенирования проводилась с помощью программного обеспечения анализа метагеномных образцов Kraken Metagenomics version 2 (классификатор ридов — коротких нуклеотидных последовательностей). Филогенетические исследования осуществляли в программе Wombac 2.0, которая позволяла находить коровые SNP в нуклеотидных последовательностях и производить выравнивание этих полиморфизмов. Для определения О-антигенов и капсульных антигенов штаммов K. pneumoniae использовали сервер Kaptive. Определение сиквенс типов осуществляли с использованием сервера MLST 2.0 (Multi-Locus Sequence Typing) (https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST), а также программой Lasergene.

Статистическая обработка полученных данных и визуализация результатов были проведены в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2016. Для анализа применялись методы статистической обработки с применением программы SPSS, версия 22. Номинальные данные описывались с указанием абсолютных значений, процентных долей и доверительных интервалов (95% ДИ) — метод Клоппера–Пирсона. Анализ статистической значимости различий ИАА проведен с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни и таблиц сопряженности по критерию хи-квадрат Пирсона (χ²). Различия полученных значений считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Фенотипические исследования изолятов E. coli, выделенных из содержимого толстой кишки пациентов с диагнозом описторхоз показали, что в их структуре преобладали лактозопозитивные, не обладающие гемолитической активностью и подвижные штаммы (рис. 1). Изоляты K. pneumoniae и K. oxytoca, идентифицированные в этой же группе пациентов, характеризовались проявлением типичных для этих видов свойств. При исследовании изолятов E. сoli и Klebsiella spp. на чувствительность к антибиотикам установлено, что все они были чувствительны к цефалоспоринам, карбапенемам, защищенным пенициллинам, хлорамфениколу, триметоприму/сульфаметоксазолу и аминогликозидам.

Рисунок 1. Структура изолятов E. coli, выделенных из содержимого толстой кишки пациентов с диагнозом «Описторхоз», по фенотипическим характеристикам, %

Figure 1. The pattern of E. coli isolates obtained from large intestine contents of patients with diagnosed opisthorchiasis based on phenotypic characteristics, %

Изучение антагонистической активности изолятов E. coli в отношении бактерий рода Klebsiella выявило повышение ИАА c 33,7% (95% ДИ: 17,5–28,5) в первые сутки совместного культивирования бактерий до 54,1% (95% ДИ: 17,5–28,5) к 3-м суткам. Средний показатель ИАА составил 45,4% (95% ДИ: 17,5–28,5). Увеличение значений индекса АА штаммов E. coli не зависело от их фенотипических свойств за весь период наблюдения (рис. 2). Вместе с тем сравнительный анализ показателей ИАА штаммов E. coli в группах, ферментирующих лактозу и обладающих подвижностью, в 1,3 раза выше при сравнении с аналогичными показателями изолятов с противоположными свойствами на вторые сутки наблюдения. Статистически значимые более высокие показатели ИАА установлены на вторые и третьи сутки наблюдения только по подвижности штаммов (непараметрический критерий Манна–Уитни, p = 0,002 и p = 0,001 соответственно).

Рисунок 2. Сравнительная характеристика ИАА изолятов E. coli, отличающихся по фенотипическим свойствам, в динамике по суткам, %

Figure 2. Comparative characteristics of IAA of E. coli isolates differing in phenotypic properties, daily dynamics, %

В структуре всех штаммов на долю E. coli, обладающих низкой антагонистической активностью (ИАА ≤ 20), пришлось 22,2% (95% ДИ: 12,04–35,6), с высокой антагонистической активностью (ИАА > 70) — 48,1% (95% ДИ: 34,34–62,16).

Таким образом, все штаммы E. сoli с типичными фенотипическими характеристиками (Lac+, Gem–, подв.+), проявляли более выраженную антагонистическую активность в отношении Klebsiella spp. при сравнении с ИАА штаммов, проявляющих противоположные признаки. Данные подтверждены статистическим анализом с применением непараметрического критерия Манна–Уитни, p = 0,027.

Все штаммы E. сoli, исследованные на антагонистическую активность, и Klebsiella spp. подвергли протеомному анализу. Сравнение белковых спектров штаммов E. сoli, обладающих низкой антагонистической активностью, выявило два кластера (рис. 3А). Коэффициент корреляции протеинограмм бактерий первого и второго кластера составил 0,80, что свидетельствует о значительной схожести этих штаммов.

Рисунок 3. Дендрограммы штаммов E. сoli, обладающих низким показателем ИАА ≤ 20 (А) и высоким — ИАА > 70 (Б)

Figure 3. Dendrograms of E. coli strains with low IAA 20 (A) and high — IAA > 70 (B)

Примечание. *Цифрами обозначены отдельные кластеры E. coli.

Note. *Numbers indicate separate E. coli clusters.

Дендрограммы штаммов E. сoli, обладающих высокой антагонистической активностью, различались по степени филогенетического родства и распределились на 4 кластера (рис. 3Б). Анализ протеинограмм установил гетерогенность белковых профилей этой группы E. сoli, что подтверждается умеренным показателем коэффициента корреляции — 0,65. Четвертый кластер представлен максимальным количеством штаммов (15), которые по фенотипическим свойствам отличались незначительно, коэффициент корреляции их протеинограмм составил 0,7. Генетически сходные штаммы (большая их часть) разлагали лактозу, были подвижными и не обладали гемолитической активностью.

Анализ спектральных профилей штаммов Klebsiella spp. показал разделение их по видам: K. oxytoca и K. pneumoniae. Изоляты E. сoli проявляли высокую АА в отношении бактерий K. oxytoca значительно чаще, чем при взаимодействии со штаммами K. pneumoniae, различия статистически достоверные (χ² = 7,113; р = 0,008).

Изоляты E. сoli (13), обладающие высоким уровнем АА, были изучены молекулярно-генетическими методами. Молекулярное серотипирование по О- и H-антигенам в 60% случаев выявило наличие генов энтеротоксигенных (О6:Н1, О6:Н5, О6:Н31, О8:Н30, О25:Н4), энтероинвазивных (О144:Н45) и внекишечных патогенных (О1:Н7, О2:Н6) E. сoli. Мультилокусное сиквенс-типирование по семи локусам (adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA, recA) этих штаммов установило, что только два штамма относились к сиквенс-типу ST10 одного клонального комплекса; у 5 штаммов принадлежность к клональному комплексу не определялась. Таким образом, по сиквенс-типам штаммы характеризовались гетерогенностью.

Результаты полногеномного секвенирования штаммов E. coli, изолированных от пациентов с описторхозной инвазией, свидетельствовали о наличии у них 25 комплексов генов, ассоциированных с вирулентностью: адгезинов — pic, sfaS, iha, lpfA; инвазинов — mchF, iroN, ireA; токсинов — astA, cnf1, vat, sat, senB, eilA, sigA; бактериоцинов — mchB, mchC, mcmA, cba, cma, selB. Практически у всех штаммов (80%) обнаружен ген increased serum survival (iss) — ген повышенной выживаемости в сыворотке крови, а также ген glutamate decarboxylase (gad) — фермент, катализирующий процесс декарбоксилирования в микробной клетке. Два штамма, обладающие максимально высоким показателем ИАА, являлись носителями наибольшего количества комплексов генов вирулентности (48% и 36%): адгезинов (pic, sfaS, iha); инвазинов (mchF, iroN); токсинов (astA, cnf1, vat, sat) и бактериоцинов (mchB, mchC, mcmA), и относились к энтеротоксигенным E. coli сиквенс-серотипам О6:Н1 и О6:Н5.

Сиквенс-серотипирование штаммов K. pneumoniae, выявило отличие их по О- и капсульному (KL) антигенам: KL2:О1v2; KL1:О1v2; KL47:О1v1; KL139:О1v1; KL125:О5. Мультилокусное сиквенс-типирование (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB, tonB) установило принадлежность к разным сиквенс типам. Для всех штаммов была характерна гомология маркеров антибиотикорезистентности oqxA, oqxB (chloramphenicol, benzylkonium chloride, cetylpyridinium chloride, nalidixic acid, ciprofloxacin, trimethoprim) и fosA (fosfomycin) и разнообразие вариантов генов резистентности к бета-лактамным антибиотикам.

Сиквенс-типы бактерий K. oxytoca определены как ST242 (два штамма) и ST176. По маркерам резистентности к различным группам антимикробных препаратов один штамм в геноме имел максимальный набор (oqxA, oqxB, qnrB1, fosA, fosA3, rmtB, dfrA14, tet(A), bla_CTX-M-55, bla_SHV-106, bla_TEM-214, bla_TEM-209, bla_NDM-1, bla_SHV-28, bla_TEM-206, bla_TEM-1B, bla_TEM-141); у двух других выявлены гены только группы bla_OXY-2-5, bla_OXY-5-1, bla_OXY-5-2.

Таким образом, изоляты E. coli, выделенные из содержимого толстой кишки пациентов с диагнозом «Описторхоз» показали, что в их структуре преобладали культуры ферментирующие лактозу, обладающие подвижностью и не проявляющие гемолитическую активность. Установлено, что изоляты этой группы проявляли высокую антагонистическую активность в отношении бактерий рода Klebsiella и характеризовались носительством генов сиквенс-серотипов по О- и H-антигенам энтеротоксигенных, энтероинвазивных и внекишечных патогенных E. coli. Кроме того, они являлись носителями генов, ассоциированных с вирулентностью.

Обсуждение

Микробиота играет существенную роль в жизнедеятельности организма. Одна из основных ее функций — формирование барьера колонизационной резистентности, предотвращающая контаминацию слизистых оболочек патогенами путем проявления антагонистической активности автохтонной микробиоты [7, 14]. Иммунологический статус макроорганизма обеспечивает оптимальные для конкретных ситуаций симбиотические и антагонистические отношения микроорганизмов, способствующие формированию новых фенотипических и генотипических свойств [9]. Так называемый «микробный орган» характеризуется фенотипической гетерогенностью, генетической разнородностью и сложными скоординированными связями. Факторы, определяющие структуру микробных сообществ и их антагонистические взаимодействия в кишечнике, еще мало изучены [1, 16].

Типичными представителями микробиоты млекопитающих являются E. coli, характеризующиеся широким спектром ферментативной активности, подвижности, биопленкообразования, участием в горизонтальном переносе генетической информации [5]. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что изоляты E. coli, выделенные из фекалий пациентов с диагнозом «Описторхоз» обладали преимущественно типичными фенотипическими свойствами, но при этом являлись носителями комплексов генов вирулентности. Почти половина изученных нами изолятов обладали генами, ответственными за продукцию бактериоцинов. Известно, что гены системы продукции бактериоцинов, являются важными факторами колонизационной резистентности кишечника и связаны с их пробиотическими свойствами [14]. Антимикробная активность бактериоцинов, обуславливающая антагонизм между бактериями, направлена не только на штаммы филогенетически родственных видов бактерий, но и других видов и родов. Решение проблемы резистентности к антибиотикам бактерий инициирует интерес к естественным альтернативам — колицинам и микроцинам, продуцируемым E. coli [18, 19]. В 80% случаев штаммы E. coli, изолированные от пациентов с описторхозной инвазией, являлись носителями гена glutamate decarboxylase (gad) — фермента, катализирующего необратимое декарбоксилирование l-глутаминовой кислоты, участвующей в выполнении различных физиологических функций [21, 22].

В кишечной микробиоте человека при описторхозной инвазии наиболее часто встречаются бактерии K. pneumoniae, которые могут быть представлены как комменсальными, так и высокопатогенными штаммами с гипермукоидным фенотипом. Генетические детерминанты патогенного потенциала этих штаммов (гены вирулентности, связанные с адгезией и мукоидным фенотипом) значительно чаще выявляются при воспалительных заболеваниях кишечника [11]. Наибольшую опасность представляют случаи, связанные с гипервирулентными штаммами, способными одновременно продуцировать и бета-лактамазы расширенного спектра действия. Сочетание вирулентности и множественной лекарственной резистентности представляет высокий риск развития бактериальной инфекции [13, 17]. Результаты проведенных исследований изолятов K. pneumoniae выявили наличие в их геномах факторов вирулентности — капсульных антигенов. Несмотря на это, некоторые штаммы E. coli, обладающие антагонистической активностью, подавляли рост вирулентных штаммов K. pneumoniae.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о том, что антагонистическая активность штаммов E. сoli с типичными фенотипическими признаками является одним из важных факторов колонизационной резистентности биотопа организма человека от патогенов при инфекционном заболевании. Установлено, что геномы типичных представителей нормобиоты кишечника (E. сoli) при описторхозной инвазии содержат комплексы генов вирулентности и патогенности. Возможно, эти характеристики обеспечивают высокий уровень их антагонистической активности в отношении Klebsiella spp.

Результаты исследований позволили определить штаммы, отличающиеся выраженными антагонистическими свойствами, и депонировать их в государственной коллекции. Нуклеотидные последовательности редких штаммов размещены в GenBank NCBI. Результаты исследования генома штаммов E. сoli положены в основу изобретения, получен патент РФ № 2756794 «Штамм нового генотипа Escherichia coli 1654-1 для молекулярно-генетического типирования бактерий рода Escherichia».

Понимание молекулярно-биологических особенностей на уровне фенотипических свойств отдельных изолятов даст возможность прогнозирования колонизационной резистентности биотопа и управления инфекционно-инвазионным процессом.