Assessing molecular genetic and immunological predictors of COVID-19 course in healthcare worker risk group

Full Text

Введение

С начала эпидемии новой коронавирусной инфекции COVID-19 в январе–марте 2020 г. в Китае, а в последующем — в Европе и Северной Америке, сообщается о случаях внутрибольничного инфицирования SARS-CoV-2, в том числе и среди медицинских работников (МР) [3]. Комплексное изучение особенностей врожденных и адаптивных механизмов иммунного ответа у МР, которые являются наиболее уязвимой социальной группой с высоким риском инфицирования, является актуальной задачей исследований.

Состояние иммунной системы и наличие генетически обусловленных иммунологических аномалий, которые затрагивают субпопуляции эффекторных Т- и В-клеток, метаболические пути, связанные с окислительным фосфорилированием, генерацией активных форм кислорода, мутации в ключевых рецепторах, контролирующих общие механизмы врожденного и адаптивного иммунного ответа, оказывают непосредственное влияние на особенности патогенеза и клиническое течение коронавирусной инфекции нового типа в различные периоды заболевания (острый и реконвалесценция — стадия «иммунологического восстановления» после COVID-19), а также на прогноз для пациентов, перенесших эту инфекцию. Существует предположение о том, что эти аномалии могут способствовать формированию пост-COVID-19- синдрома, однако прямых доказательств на данный момент не имеется [14, 15].

Следует отметить, что система макрофагов, являющаяся частью иммунной системы человека, способна выявлять вирусы непосредственно через Толл-подобные рецепторы (TLR), а также через образование комплексов с Fc-рецепторами. Распознавание иммунных комплексов с Fc-рецепторами и TLR инициирует активацию макрофагов и высвобождение эффекторных молекул — цитокинов широкого спектра действия, которые способствуют элиминации вируса. Быстрый клиренс иммунных комплексов критически важен для поддержания иммунного гомеостаза и разрешения воспаления. У восприимчивых людей наблюдается значительная функциональная гетерогенность сигнальной оси Fc-рецептора, а также выраженная генетическая гетерогенность генотипов TLR из-за наличия однонуклеотидных замен (SNP) в генах этих рецепторов. Группа TLR широко представлена и экспрессируется на различных клеточных типах, включая дендритные клетки, макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты и эпителиальные клетки. Недавние исследования показали влияние специфической модификации доменов Fc-рецепторов, которая характеризуется отсутствием основного остатка фукозы (афукозилирование), на развитие тяжелого течения COVID-19 у пациентов и на прогрессирование симптомов у тех, у кого инфекция сначала имела легкое течение [8]. Согласно проведенным исследованиям, у лиц с клинически значимыми полиморфизмами генов, кодирующих TLR, наблюдается прямая связь между течением бактериальных и вирусных инфекций и возникновением сепсиса. В результате иммунного дисрегуляторного ответа возможно развитие длительных пост-COVID симптомов, связанных с формированием аутоиммунного ответа, направленного против собственных тканевых антигенов, который сохраняется после элиминации вируса и сопровождается тканевым повреждением. TLR является наиболее исследуемым семейством рецепторов распознавания образов (PRR), основной функцией которых является выявление консервативных структур на микроорганизмах. Они играют важную роль в активации врожденной иммунной системы при распознавании вирусных частиц [12, 16]. Активация TLR приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов, таких, как IL-1, IL-6 и TNFα, вместе с IFNγ. Когда лиганд связывается с TLR, происходит олигомеризация, гомодимеризация или гетеродимеризация рецептора посредством PAMP-TLR взаимодействия, что инициирует передачу сигнала внутри клетки. Среди всех TLR млекопитающих, TLR2 проявляет наибольшую способность распознавания PAMP наиболее широкого спектра возбудителей, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии, микобактерии, грибки, а также вирусы. Этот феномен в основном обусловлен способностью TLR2 гетеродимеризироваться либо с TLR1, либо с TLR6 [7]. Отметим, что TLR2 играет решающую роль в распознавании грамположительных бактерий и микобактерий, что имеет особое клиническое значение. В настоящее время, грамположительные бактерии являются наиболее распространенной причиной серьезных инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи и дисфункцией органов, в том числе, при развитии септического шока в отделениях интенсивной терапии. Это особенно актуально в лечении пациентов с COVID-19 во временных инфекционных госпиталях, где предоставляется специализированная медицинская помощь.

Генетические мутации в генах, кодирующих TLR, в форме SNP, представляют собой различные вариации последовательности ДНК, возникающие при изменении одного нуклеотида в генном коде. Одна из групп SNP, известных как синонимичные полиморфизмы, не приводят к изменению аминокислот в белке рецептора, поскольку генетический код имеет избыточность. В то время как другая группа, несинонимичные SNP, может изменить аминокислоту, что существенно влияет на структуру или функцию белка рецептора. Особенный интерес представляет полиморфный вариант SNP TLR2 (rs5743708), который состоит из замены G > A в нуклеотиде 2251, что приводит к замене Arg753 на Gln (Arg753Gln). Этот SNP находится в области высококонсервативного участка белка рецептора TLR2 и ассоциируется с возникновением осложнений при сепсисе [13, 20]. Еще одним важным TLR и активационным функциональным каскадом иммунных реакций, имеющим существенное значение для патогенеза COVID-19, является TLR4 [19]. Стоит отметить, что TLR4 экспрессируется главным образом на клетках иммунной системы, таких как макрофаги, дендритные клетки и моноциты, а также на резидентных клетках легочной ткани и миокарда. В легких экспрессия TLR4 отмечается на низком базальном уровне в альвеолярных клетках, включая легочные макрофаги типа I и II, и в клетках бронхиального эпителия. Интересно, что экспрессия TLR4 и сенсибилизация к липополисахаридам резко возрастает при воспалительных процессах, инфильтрации легких макрофагами. Оказалось, что SNP (rs4986790) TLR4, который характеризуется заменой 1063A > G, и приводит к замещению аспарагиновой кислоты глицином в первичной структуре белкового рецептора (Asp299Gly), связан с высокой восприимчивостью к респираторно-синцитиальному вирусу (RSV), который обладает тропизмом к легочной ткани [10]. Последние исследования по моделированию «шиповидного гликопротеина» — гликопротеина белковой оболочки коронавируса SARS-COV-2 in silico позволяют сделать вывод, что данный гликопротеин имеет наиболее сильное белок-белковое взаимодействие с TLR4. Этот факт, вероятно, подтверждает роль TLR4 в инфекционном процессе при новой коронавирусной инфекции COVID-19 у человека [4, 11].

На основании вышеизложенных теоретических предпосылок, цель исследования состояла в комплексном изучении врожденных и адаптивных механизмов иммунного ответа путем анализа связей между клеточными и генетическими аспектами иммунитета, такими как известные клинически значимые полиморфизмы (SNP) в генах TLR2, TLR4, контролирующих иммунный ответ, уровнем экспрессии TLR2, на моноцитах периферической крови, цитокиновым профилем периферической крови (IL-1β, IL-10, IFNγ, IL-6) и маркера активации тромбоцитов (sCD40L) и специфическим гуморальным иммунным ответом на SARS-CoV-2 у медицинских работников временного инфекционного госпиталя (ВИГ), которые являются группой высокого риска инфицирования, в ранние и поздние сроки реконвалесценции после COVID-19.

Материалы и методы

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (протокол № 1 от 17.06.2020). Исследование проведено с июня 2020г. по июль 2021г. После подписания информированного согласия в исследование были включены 68 невакцинированных серопозитивных к SARS-CoV-2 МР ВИГ, переболевших новой коронавирусной инфекцией по данным регистра больных, имеющих лабораторное подтверждение (U07.1), или с диагнозом, установленным по данным компьютерной томографии (U07.2), и не имеющих документального подтверждения факта перенесенного заболевания, в том числе ОРВИ в осень–весну 2020 г. Информация, собранная в исследовании, включала: паспортные данные, место работы; должность; клинико-лабораторные данные (наличие симптомов ОРЗ в осень–весну 2020 г., результаты ПЦР на SARS-CoV-2, подтвержденный диагноз «COVID-19» (при наличии), дата появления симптомов ОРЗ, анализы на COVID-19 (ПЦР или ИФА); наличие хронических заболеваний; эпидемиологический анамнез (предполагаемое место заражения COVID-19, контакты с больными COVID-19 в семье или на работе, выезд из страны или в другие регионы РФ за последние 3 мес.).

Среди 68 участников исследования было 18 мужчин (26,5%) и 50 женщин (73,5%) в возрасте от 18 до 72 лет, средний возраст составил 43,5±1,51 лет. Врачей было 36 (52,9%), 25 (36,8%) — среднего медицинского персонала и 7 (10,3%) — младшего персонала. У 69,1% (47 человек) отмечались в анамнезе клинические проявления COVID-19, среди них перенесли инфекцию в легкой форме 29 человек (42,7%), в среднетяжелой — 14 (20,6%), тяжелой — 4 (5,9%) и бессимптомно — 21 (30,9%).

В контрольную группу (15 человек) включали лиц не болевших COVID-19 и с отсутствием полиморфных аллелей SNP TLR2 (rs5743708) и TLR4 (rs4986790) в генотипе.

Группа сравнения больные COVID-19 госпитализированные в ВИГ с тяжелым и среднетяжелым течением COVID-19 (31 пациент), которым было проведено комплексное изучение показателей иммунного ответа и маркера активации тромбоцитов (сывороточных концентраций sCD40L, IL-1β, IL-10, IFNγ, изучение интенсивности экспрессии TLR2 рецепторов на моноцитах периферической крови и детекций SNP TOLL -2 и 4 в геномной ДНК, фенотипирование субпопуляций лимфоцитов периферической крови).

Определение цитокинов в сыворотке крови (IL-1β, IL-10, IFNγ, IL-6) пациентов и лиц контрольной группы проводили иммуноферментным методом c помощью набора реагентов (Вектор-Бест, Россия) проводили дважды через месяц после появления первых симптомов и через 6 месяцев.

Уровень sCD40L определяли иммуноферментным методом с применением набора реагентов ZyQuikTM sCD40L ELISA Kit (Invitrogen Corporation, США) включающего мышинные моноклональные антитела к sCD40L человека. Коэффициент вариации в контрольных материалах не превышал 5,5%.

Изучение экспрессии TLR2 на мононуклеарах ПК проводили методом проточной цитофлуориметрии. Образец цельной крови 100,0 мкл инкубировали с 5,0 мкл МАТ в течение 10 минут, затем вносили лизирующий эритроциты раствор (Erythrocyte-Lysing Reagent), после чего клетки отмывали раствором Хенкса центрифугированием при 1000 об/мин. Экспрессию рецепторов на клетках (МПК) определяли методом проточной цитофлоуриметрии. В каждом образце анализировали не менее 150 000 событий. Для цитофлоуриметрического разделения МПК на лимфоциты, моноциты и нейтрофилы, экспрессирующих TLR 2 типа, использовали следующие моноклональные антитела: анти-CD14, меченные APC (e-BioScience), анти-CD 282 (TLR2) меченные Alexa Fluor 488 (e-BioScience).

Определяли процентное содержание моноцитов, экспрессирующих TLR2, а также среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) этих рецепторов на моноцитах. Показатель СИФ — пропорционален экспрессии рецепторов на клеточной мембране.

Мониторинг содержания антител (АТ) IgM и IgG к SARS-CoV-2 осуществлялся ежемесячно с июля 2020 г. методом двухстадийного прямого твердофазного ИФА. Определение IgG к SARS-CoV-2 проводилось с использованием отечественных диагностических тест-систем с сорбированнымв лунках планшета рекомбинантным полноразмерным тримеризованным гликопротеином (Spike-белок) вируса SARS-CoV-2 («SARSCoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ», АО «Вектор-Бест», Россия). Для детекции IgM к SARS-CoV-2 использовали отечественные тест-системы с иммобилизованными в лунках антителами к IgM человека и выявлением специфических АТ с помощью конъюгатов, содержащих антигены вируса — N-белок нуклеокапсида («SARS-CoV-2-IgM-ИФА-БЕСТ», АО «Вектор-Бест», Россия). Результаты исследований выражались в виде коэффициента позитивности (КП), представляющего собой отношение оптической плотности образца к критической оптической плотности, высчитываемой в каждом анализе. Интерпретация результатов в зависимости от использованной тест-системы была в следующих пределах: положительными считались образцы с КП, превышающим 1,1–1,2; отрицательными — с КП менее 0,8–0,9. Динамику титров IgM и IgG у каждого МР оценивали по рассчитанной линии тренда среднего геометрического значения титров антител.

Для изучения распространенности SNP TLR2 и TLR4 в исследуемой популяции была сформирована группа из 234 человек, проживающих в г. Казани, которая включала 134 МР ВИГ и консультативной специализированной поликлиники; группу контроля составили 100 лиц, не являющихся медицинскими работниками. Гендерно-возрастная структура участников исследования была однородной (средний возраст составил 45,6±2,44 лет, мужчин 21% и женщин 79%).

Cкрининг полиморфизмов генов TLR2 и TLR4 у исследуемых индивидуумов проводили методом АС-ПЦР с помощью реагентов «SNP-экспресс» НПФ «Литех» (Москва, Россия). Выделение геномной ДНК человека проводили из образцов буккального эпителия с помощью набора реагентов для экспресс-выделения ДНК из буккального соскоба (НПФ, «Литех», Россия).

Статистическая обработка данных проведена с помощью программ Microsoft Office Exсel 2010 и WinPepi (версия 11.65). Были рассчитаны медиана количественных показателей, а также 25-й и 75-й персентили признака. Сравнение между группами проводили применяя U-критерий Манна–Уитни, а для характеристика распределения количественных признаком критерий Колмогорова–Смирнова.

Результаты и обсуждение

При изучении цитокинового профиля у группы МР ВИГ, которые были обследованы через месяц после начала симптомов заболевания, отмечается значительное увеличение уровня IFNγ по сравнению с контрольной группой, состоящей из лиц, не инфицированных COVID-19. Кроме того, уровень концентрации IFNγ был значительно выше, чем в группе контроля. Это свидетельствует о сохранении активации макрофагально-моноцитарного звена в ответ на новую коронавирусную инфекцию COVID-19 в период ранней реконвалесценции, как отмечено в табл. 1.

 

Таблица 1. Основные показатели экспрессии TLR2 на моноцитах крови и цитокинового профиля сыворотки крови у медицинских работников временного инфекционного госпиталя в период реконвалесценции COVID-19 через 1 и 7 месяцев после появления симптомов

Table 1. Essential TLR2 expression parameters on blood monocytes and serum cytokine profile in medical workers of a temporary infectious hospital during COVID-19 recuperation at 1 and 7 months after the onset of symptoms

Показатель Indicator	Группа/Group
	МР через месяц от появления симптомов 29.06.2020 г. MW one month after symptoms onset on June 29, 2020 (n = 68)	МР Через 7 месяцев от появления симптомов 19.01.2021 г. MW 7 months after symptoms onset on January 19, 2021 (n = 68)	Больные COVID-19 острый период COVID-19 acute period patients (n = 31)	Контрольная группа Control group (n = 15)
	1	2	3	4
Экспрессия TLR2 на моноцитах ПК/TLR2 expression on peripheral blood (PB) monocytes
СИФ TLR2 на моноцитах ПК TLR2 MIF on PB monocytes	2500* [2218–3106]	2300* [1578–2578]	н/о	1350 [1400–1560]
Цитокиновый профиль сыворотки/Serum cytokine profile
IFNγ (пг/мл) IFNγ (pg/ml)	327,0* [214, 3–367, 0]	4,0* [1, 7–12, 0]	0,0* [0, 0–1, 0]	237,0 [212, 0–267, 0]
IL-1β (пг/мл) IL-1β (pg/ml)	3,1 [2, 6–3, 7]	1,4 [0, 0–2, 6]	0.0 [0, 0–2, 0]	2,36 [2, 12–2, 5]
IL-6 (пг/мл) IL-6 (pg/ml)	1,42 [1, 28–3, 2]	1,4 [1, 28–2, 4]	38,5* [14, 5–63, 5]	1,5 [1, 5–1, 67]
sCD40L (пг/мл) sCD40L (pg/ml)	23,0* [14, 9–34, 0]	7,8* [2, 0–17, 0]	34,0* [15, 5–106, 0]	16,0 [15, 0–16, 8]
IL-10 (пг/мл) IL-10 (pg/ml)	5,85 [3, 85–9, 8]	2,3 [0, 6–3, 8]	0,12 [0, 5–1, 3]	4,1 [2, 6–3, 6]

 

Дополнительно нами было установлено, что концентрация провоспалительного цитокина IL-1β, который вызывает воспалительную реакцию сосудов и индуцирует синтез белков острой фазы, была статистически значимо выше, чем в контрольной группе. Одновременно мы отметили увеличение уровня IL-10, который способствует дифференцировке В-лимфоцитов, пролиферации цитотоксических Т-лимфоцитов и уменьшению синтеза Th1-цитокинов. Примечательно, что наши исследования показали, что уровень концентрации IL-6 у МР оставался в норме в течение 7 месяцев и не отличался статистически значимо от контрольной группы.

Наше исследование выявило, что в раннем периоде реконвалесценции COVID-19 у МР наблюдается увеличение концентрации sCD40L. Это свидетельствует об активации системы тромбообразования и воспаления. Кроме того, показано, что белок CD40L и его рецептор CD40 экспрессируются различными типами клеток крови и стенки сосудов, включая эндотелиоциты, гладкомышечные клетки, моноциты/макрофаги и Т-лимфоциты. [6]. Исследования подтверждают, что система CD40/CD40L играет значимую роль в активации как тромбоцитов, так и клеток воспаления и эндотелиоцитов. В периферической крови, CD40L присутствует в виде растворимого фрагмента, известного как sCD40L. Активированные тромбоциты являются основным источником (95%) циркулирующего в крови sCD40L. Поэтому sCD40L считается важным маркером активации тромбоцитов и патологических процессов, связанных с увеличением активности системы тромбообразования [5].

При изучении экспрессии TLR2 нами было установлено, что в ранний период реконвалесценции после COVID-19 у МР наблюдается увеличение экспрессии этого рецептора на моноцитах, средняя интенсивность флюоресценции TLR2 была достоверно выше в 1,5 раза, чем в группе контроля.

В динамике, в поздний период реконвалесценции, через 7 месяцев после перенесенной новой коронавирусной инфекции COVID-19 было отмечено снижение сывороточного уровня IFNγ — основного интерферона второго типа с противовирусным эффектом, который активирует макрофаги и антиген- презентующие клетки (АПК) и стимулирует переключение классов антител на IgG 2A. Причем депрессия синтеза IFNγ была значительной, его концентрация у МР снизилась в этот период в 82 раза, что было достоверно ниже по сравнению с группой контроля (в 59 раз). Так же с этим коррелировало и снижение концентрации IL-1β и IL-10, который стимулирует дифференцировку В-лимфоцитов. Необходимо отметить, что в период поздней реконвалесценции активность тромбоцитарного фактора гемостаза sCD40L так же значительно снижалась и была меньше в 2 раза по сравнению с контрольной группой.

При этом экспрессия TLR2 на моноцитах периферической крови не претерпела существенной динамики снижения в этот период.

В сравнительном анализе, нами показано, что у пациентов с COVID-19, проходящих лечение в отделении интенсивной терапии, концентрация IFNγ, IL-1β и IL-10 почти не определялась, в то время как уровень sCD40L был почти в два раза выше нормы (табл. 1). Нами в этом исследовании выявлено, что только у больных COVID-19 в остром периоде, госпитализированных в ВИГ, уровень IL-6 был статистически значимо выше (в 7 раз), по сравнению с исследуемой группой МР.

В дополнение к этому, нами была выделена небольшая группа МР (9 человек) с детектированными в генотипе одновременно двумя SNP, которые затрагивают гены TLR2 и TLR4 с характерным цитокиновым профилем (табл. 2).

 

Таблица 2. Особенности экспрессии TLR2 на моноцитах крови и цитокинового профиля у медицинских работников с выявленными однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) в генах TLR2 и TLR4 (через 1 и 7 месяцев после перенесенного COVID-19)

Table 2. Features of TLR2 expression on blood monocytes and cytokine profile in healthcare workers with identified single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in TLR2 and TLR4 genes (1 and 7 months after COVID-19)

Показатель Indicator	Группа/Group		Контрольная группа Control group (n = 15)
	МР (SNP)* через месяц от появления симптомов 29.06.2020 г. MW (SNP)* one month after symptoms appeared on June 29, 2020 (n = 9)	МР (SNP)* через 7 месяцев от появления симптомов 19.01.2021 г. MW (SNP)* After 7 months from symptom onset on January 19, 2021 (n = 9)
	1	2	3
Экспрессия TLR2 на моноцитах периферической крови/TLR2 expression on peripheral blood monocytes
СИФ TLR2 на моноцитах ПК MIF TLR2 on PB monocytes	3050* [2750–3025]	2578* [1875–2550]	1350 [1400–1560]
IFNγ (пг/мл) IFNγ (pg/ml)	216,0* [214, 3–350, 0]	0,05* [0, 02–0, 15]	237,0 [212, 0–267, 0]
IL-1β (пг/мл) IL-1β (pg/ml)	1,1* [0, 6–2, 6]	0,02* [0, 0–0, 1]	2,36 [2, 12–2, 5]
IL-6 (пг/мл) IL-6 (pg/ml)	1,5 [1, 4–3, 4]	1,4 [1, 3–2, 1]	1,5 [1, 5–1, 67]
sCD40L (пг/мл) sCD40L (pg/ml)	14,0* [11, 9–36, 0]	8,7 [6, 0–15, 0]	16,0 [15, 0–16, 8]
IL-10 (пг/мл) IL-10 (pg/ml)	9,8 [7, 85–10, 8]	2,3 [0, 6–3, 8]	4,26 [3, 6–4, 78]

 

Проведенный анализ цитокинового профиля показал, что у группы МР с генотипами, характеризующимися сочетанием SNP в генах TLR2 и TLR4, наблюдалось практически 5000-кратное снижение уровня IFNγ через 7 месяцев после заболевания, а также 118-кратное снижение уровня IL-1β. Уровень sCD40L тромбоцитарного фактора гемостаза также снижался, но несколько менее значительно (в 1,8 раза ниже нормы).

Нами установлено, что все 9 человек из группы МР, имеющих генотипы, характеризующиеся сочетанием SNP в генах, кодирующих TLR2 и TLR4 перенесли COVID-19 в среднетяжелой форме.

Распределение генотипов SNP в генах TLR2 и TLR4 в исследуемой группе представлено табл. 3.

 

Таблица 3. Распространенность однонуклеотидных полиморфизмов TLR2 (rs5743708) и TLR4 (rs4986790) среди медицинских работников и контрольной группы лиц, проживающих в г. Казани

Table 3. Prevalence of TLR2 (rs5743708) and TLR4 (rs4986790) single-nucleotide polymorphisms among medical workers and control subjects in the city of Kazan

Генотип Genotype	МР MW	Контрольная группа Control group	ОШ (95%ДИ) OR (95% CI)
rs5743708 TLR2 (G > A)
GG	126 (94,0%)	97,0 (97,0%)	2,05 (0,5–7,9)
GA	5 (3,7%)	2,0 (2,0%)
AA	3 (2,2%)	1 (1,0%)
Аллель G Allele G	96,0%	98,0%
Аллель A Allele A	4,0%	2,0%,
Всего Total	134	100	234
rs4986790 TLR4 (A > G, T)
AA	111 (82,8%)	87 (87,0%)	1,4 (0,6–2,9)
AG	20 (15,0%)	11 (11,0%)
GG	3 (2,2%)	2,0 (2,0%)
Аллель A Allele A	90,3%	92,5%
Аллель G Allele G	9,7%	7,5%
Всего Total	134	100	234

 

В группе МР выявили встречаемость полиморфного аллеля А (rs5743708) в гене TLR2 составляющую 4,0% в кодоминантной модели наследования, а полиморфного аллеля G (rs4986790) в гене TLR4 — 9,7%. В контрольной группе эти значения для полиморфного аллеля А (rs5743708) в гене TLR2 составили 2,0%, а для полиморфного аллеля G (rs4986790) в гене TLR4 — 7,5%. Это свидетельствует о более высокой встречаемости соответствующих SNP TLR в группе МР в сравнении с контрольной группой (ОШ = 2,05 и ОШ = 1,4, p < 0.05, соответственно), что подтверждено данными табл. 3.

Таким образом, в исследуемой группе города Казани частота распространения полиморфного аллеля А (rs5743708) в гене TLR2 составила 3,2%, а полиморфного аллеля G (rs4986790) в гене TLR4 — 8,76%. Полученные нами результаты по распространенности полиморфного (мутантного) аллеля A (rs5743708, G > A) в гене TLR2, согласуются с данными о частоте распространения этого полиморфного аллеля среди финской и эстонской популяций. Средняя частота полиморфного аллеля A (rs5743708, G > A) в гене TLR2, была 2,96% в финской популяции (исследование FINRISK) и 4,75% среди эстонцев (исследование «Estonian», включающее 213 человек) [2]. Частота распространения полиморфного аллеля G (rs4986790) в гене TLR4 у нашей изученной части популяции была наиболее близка к популяции эстонцев, где эта частота составила 6,7% (исследование, включающее 4480 человек), и финской популяции, где частота распространения этого полиморфного аллеля составила 12,2% (исследование, включающее 304 человека) [1].

Учитывая выявленную депрессию иммунного ответа у МР ВИГ со снижением продукции провоспалительных цитокинов IFNγ, IL-1β и IL-10, становится критически важным исследование гуморального специфического иммунного ответа на SARS-CoV-2 в динамике реконвалесценции, включая период, когда концентрация IFNγ снижается. В этот период формирование полноценного адаптивного гуморального противовирусного иммунитета, включая стимуляцию дифференцировки созревания В-лимфоцитов и пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов, необходимо для эффективной противовирусной защиты. Для достижения этой задачи требуется проведение динамического мониторинга гуморального иммунного ответа в период реконвалесценции, включая выявленный нами критический период [11].

По данным зарубежных исследований, гуморальный иммунный ответ на SARS-CoV-2 включает выработку трех видов антител: IgM, IgА и IgG. Формирование IgA начинается на второй день после начала заболевания, достигает своего пика через 2 недели и сохраняется на протяжении длительного периода времени. Для детекции IgM необходимо примерно 7 суток с момента заражения, а пик достигается через неделю после этого [17, 18]. Этот класс антител (IgG) может сохраняться в организме в течение нескольких месяцев и более, и начинает обнаруживаться в крови приблизительно на третьей неделе или ранее после контакта с вирусом SARS-CoV-2 [9].

С начала сероконверсии (положительного результата) у МР ВИГ по титру IgM и IgG к SARS-CoV-2, отмечается уменьшение значений обоих антител (рис. 1 и 2). Наиболее быстрое снижение титра IgM наблюдалось через месяц после сероконверсии, затем снижение происходило более равномерно со среднемесячным уменьшением в размере –23,56% (рис. 1). Снижение титра IgG было менее интенсивным, со среднемесячным уменьшением на 1,2% (рис. 2).

 

Рисунок 1. Динамика среднегеометрического значения титров IgM к вирусу SARS-CoV-2 у медицинских работников временного инфекционного госпиталя, начиная от дня с впервые полученным положительным результатом

 

Рисунок 2. Динамика среднегеометрического значения титра IgG к вирусу SARS-CoV-2 у медицинских работников временного инфекционного госпиталя, начиная от дня с впервые полученным положительным результатом. Примечание. *Значения статистически значимо различаются по сравнению с контрольной группой, p < 0,05; ось ординат — среднегеометрическое значение титров IgG к SARS-CoV-2; по оси абсцисс — порядковый номер точек исследования.

 

Из обнаруженных особенностей иммунного ответа можно выделить следующие факты: спустя семь месяцев после выздоровления от COVID-19 у МР отмечается существенное снижение уровней продукции IFNγ, IL-1β и IL-10. Однако, экспрессия TLR2 на моноцитах и макрофагах остается значительно высокой, что связано с индивидуальными колебаниями уровня специфических IgM и IgG к SARS-CoV-2.

Заключение

В ходе комплексного исследования врожденных и адаптивных механизмов иммунного ответа у невакцинированных МР ВИГ, были обнаружены следующие особенности: через 7 месяцев после инфицирования новой коронавирусной инфекцией COVID-19, наблюдается заметное уменьшение уровня IFNγ, IL-1β и IL-10. В то же время, уровень активации экспрессии на моноцитах и макрофагах TLR2 сохраняется в значительной степени высоким, что связано с индивидуальной динамикой сокращения уровня специфических IgM и IgG к SARS-CoV-2.

В начальный период реконвалесценции после COVID-19 у МР наблюдается повышение экспрессии TLR2 на моноцитах периферической крови. Средняя интенсивность флюоресценции TLR2 достоверно выше в 1,5 раза, чем в группе контроля на протяжении 7 месяцев наблюдения за реконвалесцентами, что указывает на сохранение активности врожденных механизмов иммунной защиты, стимулируемых вирусной и микробной нагрузкой.

В начальные стадии реконвалесценции COVID-19 у МР происходит резкое повышение концентрации sCD40L, что свидетельствует об активации системы тромбообразования и воспаления. Впоследствии, через 7 месяцев, наблюдается значительное снижение уровня данного показателя до значения, которое ниже референсных показателей контрольной группы.

Полученные данные о распространенности полиморфного (мутантного) аллеля A (rs5743708, G > A) в гене TLR2 в изученной когорте МР составляют 4,0%, что соответствует данным о частоте распространенности этого полиморфного аллеля среди финской популяции, где средняя частота полиморфного аллеля A (rs5743708, G > A) составляет до 2,96%.

Распространенность полиморфного аллеля G (rs4986790) в гене TLR4 в изучаемой когорте была сопоставима с эстонской и финской популяциями, где, соответственно, составила 6,7 и 12,2%.

Выявлен дисбаланс цитокинов, контролирующих противовирусный врожденный и адаптивный иммунный ответ, у МР с установленной комбинацией полиморфизмов rs5743708 и rs4986790 в генах TLR2, TLR4 с частотой встречаемости не более 6,7%.

Таким образом, изучение иммунного ответа у невакцинированных МР ВИГ, как группы лиц с высоким риском инфицирования COVID-19, не только в ранние и поздние стадии реконвалесценции, но и в контексте взаимосвязи между известными клинически значимыми полиморфизмами в генах, контролирующих иммунный ответ, и уровнями экспрессии TLR2 на моноцитах периферической крови, цитокиновых профилей периферической крови и маркеров активности тромбоцитов, а также специфического гуморального иммунного ответа на SARS-CoV-2, показало значительные изменения в иммунологических показателях. Эти изменения свидетельствуют о нарушениях как врожденных, так и адаптивных механизмов иммунного ответа и могут снизить устойчивость к респираторным инфекциям. Результаты исследования свидетельствуют о необходимости оптимизации лечебно-профилактических мероприятий, направленных на повышение неспецифической резистентности, защиты барьеров слизистых респираторного тракта и выявление генетических предикторов дефектов врожденного и адаптивного иммунного ответа.

About the authors

I. D. Reshetnikova

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Rospotrebnadzor; Kazan (Volga Region) Federal University, Ministry of Education of the Russian Federation

Email: kniem@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Deputy Head; Associate Professor of the Department of Internal Medicine, Department of Fundamental Clinical Medicine

Россия, Kazan; Kazan

Yu. A. Tyurin

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Rospotrebnadzor; Kazan State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: kniem@mail.ru

DSc (Medicine), Leading Researcher, Head of Immunology Laboratory; Associate Professor, Department of Biochemistry and Clinical Laboratory Diagnostics

Россия, Kazan; Kazan

I. G. Mustafin

Kazan State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: kniem@mail.ru

DSc (Medicine), Professor, Head of the Department of Biochemistry and Clinical Laboratory Diagnostics

Россия, Kazan

E. V. Agafonova

Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Rospotrebnadzor

Email: kniem@mail.ru

PhD (Medicine), Laboratory Diagnostics Doctor, Diagnostics Centre of Infection-Allergic Diseases; Assistant Professor, Department of Propedeutics of Child Diseases

Россия, Kazan

N. D. Shaуkhrazieva

Kazan State Medical Academy — Branch of the Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: kniem@mail.ru

PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Epidemiology and Desinfectology

Россия, Kazan

References

Supplementary files