Биохимические маркеры скорости репаративных процессов у пациентов с инфильтративным туберкулезом легких

Полный текст

Введение

Эффективность терапии туберкулеза легких (ТЛ) определяется своевременностью и адекватностью лечения и характеризуется скоростью репаративных изменений легочной паренхимы [4]. Предсказать ответ организма по совокупности клинико-рентгенологических параметров до начала лечения не представляется возможным, что делает перспективным поиск прогностических биомаркеров неспецифической реактивности макроорганизма для определения вероятности неблагоприятных исходов лечения [17].

В соответствии с потребностями роста и репарации одним из наиболее важных механизмов регуляции внеклеточного компонента межклеточного матрикса (ВКМ) является протеолитический процессинг, опосредуемый различными классами протеиназ, среди которых можно выделить сериновые и матриксные металлопротеиназы (ММП). В норме эти протеиназы участвуют в процессах, включающих адгезию, пролиферацию, миграцию клеток, апоптоз, модулируют действия цитокинов, вызывая расщепление биоактивных молекул. Субстратом типичного представителя сериновых протеиназ — нейтрофильной эластазы (НЭ) — являются эластины межклеточного вещества, а также коллагены IV и V типов базальной мембраны, а среди ММП, согласно субстратной специфичности, выделяют — коллагеназы (ММП-1, ММП-8, ММП-13), желатиназы (ММП-2, ММП-9), стромелизины (ММП-3, ММП-10, ММП-11), матрилизины (ММП-7) и др. Источниками ММП могут быть различные типы клеток включая моноциты, нейтрофилы, клетки эпителия, фибробласты. Ферменты продуцируются как зимогены, а в периферической крови их активность регулирутся протеиназным ингибитором (ПИ), α2-макроглобулином (МГ) и тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). Нарушение баланса между ММП и ингибиторами играет важную роль в патологических состояниях, включая воспаление, фиброз, аутоиммунные заболевания и канцерогенез [12].

Известно, что Mycobacterium tuberculosis (МБТ) и ее основные клеточные антигенные компоненты стимулируют высвобождение ММП, но роль ММП в механизме разрушения соединительной ткани, вызванных МБТ, до конца не исследована [10]. Между сериновыми протеиназами и ММП существует взаимосвязь. Показано, что ММП-8, ММП-9 разрушая ПИ могут восстановить активность сериновых протеаз, в основном НЭ, тогда как НЭ, инактивируя ТИМП-1, опосредованно участвует в активации MMП [13]. Показано, что НЭ и представитель ММП (ММП-8) входят в состав нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs), которые напрямую воздействуют на МБТ [14, 15]. Повышение уровней НЭ и ММП связанно с рентгенологическими показателями тяжести процесса при различных заболеваниях легких [19]. Возможность использовать показатели системы протеиназы/ингибиторы в прогнозировании результатов интенсивной фазы терапии обсуждалась в единичных исследованиях [7, 11].

Целью данного исследования было определение взаимосвязи направленности репаративных изменений с показателями системы протеиназы/ингибиторы у пациентов инфильтративным туберкулезом легких (ИТЛ) с различной лекарственной устойчивостью (ЛУ) штаммов МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП).

Материалы и методы

Ретроспективное исследование включало 115 больных (65 мужчин и 50 женщин) со средним возрастом (39 лет) с впервые выявленным ИТЛ, находившихся на лечении в клинике ФГБУ «СПбНИИ фтизиопульмонологии» МЗ РФ. Критериями исключения служили внелегочные формы туберкулеза, сахарный диабет, острая воспалительная реакция нетуберкулезного генеза, ВИЧ и беременность. Исследование респираторного материала проводили методом микроскопии, посева в системе BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson, США) и молекулярно-генетическим методом (ПЦР). ЛУ изолятов МБТ определяли в соответствии с Приказом № 109. С учетом цели исследования в качестве группирующих факторов использовали тип чувствительности изолятов возбудителя и эффективность интенсивной фазы противотуберкулезной терапии. ЛЧ и ЛУ штаммы возбудителя к ПТП выделяли 60 и 55 пациентов соответственно. Выраженный положительный эффект терапии (1 вариант динамики процесса) характеризовался исчезновением симптомов интоксикации, абациллированием и ликвидацией полостей распада (n = 46). Замедленная динамика процесса (2 вариант) характеризовалась исчезновением симптомов интоксикации, абациллированием и частичным рассасывание инфильтративных изменений с уменьшением полостей распада (n = 69). Компьютерные исследования (КТ) были выполнены на спиральном компьютерном томографе Aquilion Prime (Toshiba) с оценкой структурных изменений легочной паренхимы (пакет прикладных программ Nodule Analysis и Lung Volume Analysis) [3].

Взятие крови осуществлялось перед назначением адекватной терапии, после определения ЛУ изолятов МБТ. Методом твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке крови определяли уровни показателей системы протеиназы/ингибиторы: концентрации ММП-1, ММП-3, ММП-8, ММП-9 и их тканевого ингибитора-1 (ТИМП-1) с использованием наборов реагентов «R&D Systems» (Minneapolis, MN, США); активность МГ, НЭ и ее ингибитора ПИ оценивали спектрофотометрически по торможению синтетических субстратов [2, 20].

Для статистического анализа данных были использованы программные продукты Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.) и R (свободная программная среда вычислений с открытым исходным кодом). Для описания в группах категориальных переменных использовались частоты градаций, представленные в процентах, значимость различия которых проверялась при помощи точного критерия Фишера. После проверки на нормальность распределения (Шапиро–Уилка), характеристики метрических переменных представлялись в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me, Q₁–Q₃). Для проверки значимости их различий применяли непараметрические критерии Вилкоксона, Краскела–Уоллиса с учетом поправки Бонферрони, в корреляционном анализе использовали критерий Спирмена (r).

Для решения задачи разделимости популяций больных с разной скоростью репаративных процессов и изучения вопроса о возможности прогнозирования результатов лечения на основе биохимических данных и результатов КТ, применялась статистическая процедура классификации с кросс-валидацией 20%. В качестве возможных предикторов (n = 23) рассматривались показатели системы протеиназы/ингибиторы, данные об основных популяциях лейкоцитов (общее количество лейкоцитов, общее количество лимфоцитов, сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов) до начала терапии и результаты рентгенологических исследований до и после интенсивной фазы лечения (суммарный объем поражения и деструкции, наличие полостных изменений).

В основу построения дифференциально-диагностической модели был положен метод классификации с расслоением [1], в котором предварительно ищутся категориальные переменные для такого расслоения выборки, при котором возможные предикторы в отдельных подвыборках отличались бы наибольшим образом. В группах с разной ЛЧ штаммов МБТ к ПТП и с разной распространенностью процесса был применен линейный дискриминантный анализ (на основе более чем 30 функций) с зависимой переменной в виде характера эффективности интенсивной фазы лечения. Исследование подтверждено этическим комитетом НИИФ от 2020 г.

Результаты

Предварительно проведенная классификация с расслоением данных показала необходимость анализа показателей системы протеиназы/ингибиторы не только в зависимости от ЛЧ штаммов МБТ, но и от объема поражения [1]. В связи с этим последующее построение модели дискриминантного анализа (ДА) с ретроспективной оценкой эффективности терапии проводилась в четырех группах: у пациентов с ограниченным и распространенным процессом, выделяющих как ЛЧ (I и II группы), так и ЛУ штаммы МБТ к ПТП (III и IV) соответственно (табл. 1).

 

Таблица 1. Эффективность терапии в группах с различной резистентностью в зависимости от объема поражения легочной ткани

Table 1. The effectiveness of therapy in groups with various resistance depending on the size of pulmonary tissue lesions

	Группы Groups
	Пациенты с ЛЧ штаммы МБТ к ПТП Рatients with DS strains Mycobacterium tuberculosis in anti-tuberculosis therapy		Пациенты ЛУ штаммы МБТ к ПТП Рatients with DR strains Mycobacterium tuberculosis in anti-tuberculosis therapy
Динамика Dynamics of the process	I Ограниченный Limited process	II Распространенный Extended process	III Ограниченный Limited process	IV Распространенный Extended process
1/2	64,00/36,00	45,80/54,17	33,00/67,70 *р = 0,01	26,92/73,08 *р = 0,03

Примечание. ЛЧ — лекарственно чувствительные, ЛУ — лекарственно устойчивые штаммы МБТ штаммы Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам; *p — значимость различий внутри группы.

Note. DS drug-sensitive strains, DR — drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in anti-tuberculosis therapy; *р — a in-group significant difference.

 

Согласно ретроспективной оценке эффективности интенсивной фазы терапии, среди пациентов с ЛЧ штаммами МБТ к ПТП, независимо от распространенности процесса (I и II группы), «выраженная положительная» и «замедленная динамика» процесса выявлялись почти в равном проценте случаев, а среди пациентов с ЛУ штаммами МБТ (III и IV группы) «замедленная динамика» процесса отмечалась в 2 раза чаще. Исходные отличия «замедленной» динамики от «выраженной положительной» динамики процесса в группе пациентов с ЛУ штаммами возбудителя к ПТП, проявлялись более выраженным деструктивным компонентом как по объему, так и по характеру процесса, наличию полостей деструкции в 62,16% против 37,84% случаев и бактериовыделением, оцениваемым методом микроскопии, в 37,5% против 13,3% случаев, что соответствует данным литературы о особенностях замедленной скорости репаративных изменений [5].

Следует обратить внимание, что в группе пациентов с исходно адекватной терапией (с ЛЧ штаммами возбудителя) не только при распространенных, но и при ограниченных процессах, замедленная скорость репарации отмечалась почти у половины пациентов. Учитывая, что эти изменения выявлялись до назначения ПТП, возможным объяснением полученных различий может служить фактор, который мы не включили в исследование — оценка давности заболевания. Обоснованием такой гипотезы является то, что по мере увеличения длительности воспалительного процесса отмечается изменение его патоморфоза в сторону нарастания фиброзных изменений.

Представленный ниже анализ данных проводился в выделенных группах до начала терапии. Согласно ретроспективной оценке динамики процесса, попарное сравнение исходных уровней показателей протеиназно-ингибиторной системы не выявило значимых отличий внутри каждой из четырех групп. Независимо от динамики процесса, во всех группах отмечалось значимое повышение уровней представителей разных классов протеиназ: сериновой протеиназы (НЭ) и одной из ММП — желатиназы — при сохранении концентраций коллагеназ (ММП-1, ММП-8) и стромелизина-1 (ММП-3) на уровне здоровых пациентов. Была установлена сниженная активность МГ и отсутствие изменений ТИМП-1 и ПИ относительно референтного уровня. Избыток концентрации ММП-9 и относительный дефицит ТИМП-1 при низкой активности МГ свидетельствовал о нарушении баланса в сторону повышения ММП.

С увеличением суммарного объема фокуса были связаны концентрации ММП-1 в I (r = 0,51, p = 0,05) и IV группах (r = 0,31, р = 0,02), ММП-8 во II (r = 0,54, p = 0,03), ММП-9 в III (r = 0,48, р = 0,05) и IV (r = 0,43, p = 0,007) соответственно. Выявленные закономерности согласуются с полученным нами ранее выводом о том, что изменения ММП являются объективным критерием распространенности специфического процесса [7, 10].

Для оценки прогноза скорости репарации по показателям протеиназно-ингибиторной системы модель ДА формировалась для каждой из четырех группы отдельно. Для того чтобы оценить вклад каждой из переменных, были вычислены их коэффициенты корреляций с итоговой моделью ДА, составленной более чем по 30 функциям (табл. 2). Анализируя данные таблицы, следует подчеркнуть, что сочетания из маркеров, определяющие скорость репаративных изменений, отличались между 4 группами.

 

Таблица 2. Коэффициенты корреляции между итоговой дискриминантной функцией и составляющими ее переменными в группах с различной резистентностью и объемами поражения при замедленной скорости репарации

Table 2. The correlation coefficients between the final discriminant function and its variables in groups with various resistance and size of damage with a slow repair rate

	Группы Groups
	Пациенты с ЛЧ штаммы МБТ к ПТП Рatients with DS strains Mycobacterium tuberculosis in anti-tuberculosis therapy		Пациенты с ЛУ штаммы МБТ к ПТП Рatients with DR strains Mycobacterium tuberculosis in anti-tuberculosis therapy
Переменные Variables	I Ограниченный Limited process n = 28	II Распространенный Extended process n = 32	III Ограниченный Limited process n = 21	IV Распространенный Extended process n = 34
ММП-1 MMP-1	0,26	0,15	0,46 *р = 0,009	–0,25
ММП-3 MMP-3	0,01	0,03	0,57 *р = 0,05	0,03
ММП-8 MMP-8	–0,67 *р = 0,023	0,50	0,57 *р = 0,006	0,50
ММП-9 MMP-9	–0,57 *р = 0,007	–0,40	0,57 *р = 0,001	0,08
ТИМП-1 TIMP-1	0,05	0,57 *р = 0,008	0,46 *р = 0,008	–0,09
МГ MG	0,11	0,03	–0,13	–0,11
НЭ NE	0,13	–0,04	0,68 *р = 0,001	0,22
ПИ PI	–0,41	–0,51 *р = 0,01	–0,12	0,31
Число палочкоядерных нейтрофилов Number of stab neutrophils	0,59 *р = 0,03	0,88 *р = 0,001	0,18	0,87 *р = 0,001
Наличие полости Рresence of a cavity	0,29	0,19	0,36 *р = 0,005	–0,14
Объем поражения Size of lesion	0,01	–0,06	0,28	–0,37 *р = 0,001

Примечание. ЛЧ МБТ — лекарственно-чувствительные или ЛУ МБТ лекарственно-устойчивые к противотуберкулезным препаратам штаммы Mycobacterium tuberculosis, ММП — металлопротеиназы, ТИМП-1 — тканевый ингибитор-1 металлопротеиназ, МГ — α2-макроглобулин, ПИ — протеиназный ингибитор, НЭ — нейтрофильная эластаза; *p — значимость по критерию Спирмена.

Note. DS — drug-sensitive strains, DR — drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains in anti-tuberculosis therapy, ММP — matrix metalloproteinases, TIMP-1 — tissue inhibitor of metalloproteinases, MG — α2-macroglobulin, NE — neutrophilic elastase, PI — proteinase inhibitor, *р — a statistical significance according to Spearman’s criterion.

 

В группе с ЛЧ к ПТП штаммами МБТ сопоставление коэффициентов корреляций и направленности знаков перед переменными в модели ДА показало, что менее выраженный эффект терапии характеризуется особенностью воспалительной реакции с преобладанием нейтрофильного компонента. При ограниченном процессе (I группа) увеличение числа нейтрофилов (r = 0,59, р = 0,035) не сопровождалось ростом концентраций протеиназ нейтрофильного происхождения, таких как ММП-8 и ММП-9 (r = –0,67, р = 0,023; r = –0,57, р = 0,007 соответственно). При распространенном процессе (II группа) на фоне роста числа нейтрофилов (r = 0,88, р = 0,001) не наблюдалось компенсаторного роста ингибитора ТИМП-1 (r = 0,57, р = 0,008) и отмечалось снижение основного ингибитора нейтрофильных протеиназ — ПИ (r = –0,51, р = 0,01). Роль ПИ в ингибировании нейтрофильных протеаз является важным отрицательным модулятором активности внеклеточных ловушек и считается его ключевой функцией.

В группе пациентов с ЛУ к ПТП штаммам МБТ, согласно модели ДА, при ограниченном процессе (III группа) возникла необходимость в качестве предикторов замедленной скорости репарации учитывать не только биохимические характеристики (концентрации протеиназ), но и данные КТ (наличие полости). Полученные результаты можно расценить как проявление взаимодействия моноцитов (ММП-1 в сочетании с ее активатором ММП-3) и нейтрофилов (ММП-8, ММП-9, НЭ) при увеличении объема специфического поражения. На тканевом уровне сочетанное действие различных классов протеиназ, обладающих эластолитической активностью (НЭ с ММП-9), проявляется в способности вызывать большую деградацию белков легочной ткани, по крайней мере, эластина. Таким образом, можно предположить, что предпосылкой более длительного процесса заживления является вовлечение в протеолитический каскад деградации ВКМ различных классов ММП, формирующих увеличение объема поражения (размеры полости). Снижение скорости репарации будет отмечаться при общем повышении уровней различных ММП на фоне роста ингибитора ТИМП-1, что согласуется с данными литературы об ухудшении прогноза заболевания и его прогрессировании [8]. В группе пациентов с ЛУ (IV группа) и распространенным процессом к окончанию интенсивной фазы терапии в 90% случаев отмечалось сохранение полости и высокий уровень нейтрофилов, что не позволило нам выделить дискриминантные функции (ДФ). Процент правильной классификации скорости репаративных изменений в описанных моделях составил 90–100%.

Обсуждение

Поиск более эффективных схем лечения туберкулеза затруднен из-за отсутствия надежных прогностических биомаркеров, которые определяют стратегию лечения. Математический аппарат, который мы применили, доказал эффективность поиска комбинаций из показателей протеиназно-ингибиторной системы для оценки прогноза терапии при отсутствии значимых различий при бинарном анализе переменных. На сегодня опубликовано единственное исследование, доказывающее связь исходных уровней MМП и ТИМП с результатами лечения [11]. Было выявлено, что комбинация из MMП-2, MMП-7 и TИМП-1 обладает высокой точностью при классификации благоприятных и неблагоприятных исходов лечения (с чувствительностью в 84% и специфичностью в 83%) в группе пациентов с ЛЧ к ПТП штаммами МБТ.

Преимуществом нашего анализа было получение ДФ с учетом резистентности штаммов МБТ. Основным выводом текущего исследования следует считать, что комбинации из биохимических маркеров деструкции, прогнозирующие направленность и скорость репарации, различаются не только в группах с различной резистентностью штаммов возбудителя, но и зависят от объема поражения. В группе пациентов с ЛЧ к ПТП штаммами МБТ ведущим оказалось влияние нейтрофильного компонента воспаления. Наши данные согласуются с литературными о том, что деструкция легочной паренхимы и бактериовыделение наиболее тесно связаны с относительной экспансией нейтрофилов, особенно палочкоядерных и снижением отношения лимфоцитов к нейтрофилам [16]. Различия в составе выделенных комбинаций в зависимости от объема поражения могут быть объяснимы с точки зрения соотношения нейтрофилов с умеренным или выраженным проявлением воспалительной реакции. Следует помнить, что оценка нейтрофилов не ограничивается их количеством. Необходимо учитывать их пластичность и спектр функциональных возможностей, среди которых также отмечена способность к дегрануляции или высвобождению во внеклеточное пространство из NETs НЭ, MMП-8 наряду с ядерной ДНК, IL-17, катепсином-G и протеиназой-3 [9]. Полученные нами данные согласуются с тем, что количественные параметры антигенспецифического Th1-ответа играют не столь выраженную роль в определении тяжести течения ТЛ, как общие сдвиги в гранулоцитарном и лимфоцитарном ростках, формируя важный фактор патогенеза специфического воспаления [16].

Подтверждением нашей гипотезы о влиянии длительности заболевания на скорость репарации на тканевом уровне являются различия в соотношении инфильтративных и фиброзных изменений легочной паренхимы, которые могут определяться раньше по биохимическим маркерам деструкции и ремоделирования, чем по данным КТ. Наличие фиброзных изменений, препятствует проникновению препаратов, способствует снижению эффективности (50%) лечения. Избыточное разрушение ВКМ приводит к деструкции тканей, тогда как преобладание избыточной продукция его компонентов над деградацией вызывает фиброз [18]. Установлено, что ММП не только вовлечены в воспалительный процесс, но могут активировать цитокины, инициирующие легочный фиброз, такие как трансформирующий фактор роста β (ТGF-β). Предполагаемый механизм формирования фиброза заключается в последовательной стимуляции свободными радикалами кислорода и НЭ протеаз (MMП-9), которые активируют находящийся в латентном состоянии ТGF-β.

В пользу нашей гипотезы о влиянии фиброзных изменений на скорость репарации служат данные литературы о том, что в течении трех лет у 26,7% больных ИТЛ с бактериовыделением и сохраненной ЛЧ к препаратам первого ряда процесс переходит в хроническую форму [6]. Полученный нами вывод о необходимости учитывать не только биохимические характеристики, но и данные КТ в группе больных с ЛУ штаммами возбудителя согласуется с данными литературы о снижении вероятности положительной динамики процесса при наличии полостных изменений с 54,5 до 31,5% [5].

Заключение

Применение статистической модели классификации на основе ДА выявило различия в структуре воспалительного ответа организма при ИТЛ в зависимости от объема поражения в группах с различной резистентностью возбудителя. Была показана информативность комбинаций из показателей системы протеиназы/ингибиторы в оценке направленности и скорости репаративных изменений. Построенные нами ДФ показали, что взаимодействие «микроорганизм–макроорганизм» в зависимости от скорости репарации характеризуется различной выраженностью неспецифического воспалительного ответа. Различия в комбинациях показателей протеиназно-ингибиторной системы свидетельствуют о том, что для достижения эффективности терапии следует учитывать биохимические данные, характеризующие исходный фон, на котором будут происходить репаративные изменения, обусловленные давностью специфического процесса.

Об авторах

Диляра Салиевна Эсмедляева

ФГБУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения

Автор, ответственный за переписку.
Email: diljara-e@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9841-0061

к.б.н., старший научный сотрудник отдела фундаментальной медицины 

Россия, Санкт-Петербург

Нина Петровна Алексеева

ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный университет

Email: ninaalexeyeva@mail.ru

к.ф.-м.н., доцент кафедры статистического моделирования математико-механического факультета 

Россия, Санкт-Петербург

Марина Евгеньевна Дьякова

ФГБУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения

Email: marinadyakova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7810-880X

д.б.н., старший научный сотрудник отдела фундаментальной медицины 

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы