Генетическая и фенотипическая характеристика изолятов Klebsiella michiganensis

Цель исследования — выявить оптимальный объект поиска изолятов Klebsiella michiganensis, определить их генетические и фенотипические характеристики, необходимые для идентификации. Объектом исследования были 11 штаммов Klebsiella oxytoca, атипичные (отрицательные) по уникальному для клебсиелл маркеру 5-аминосалицилат декарбоксилазе. Они были отобраны для генетического исследования после фенотипического изучения клинических изолятов K. oxytoca, выделенных в 2015–2018 гг. в лечебных учреждениях Санкт-Петербурга. В контроле использовали по два клинических штамма K. oxytoca и Raoultella ornithinolytica с типичными свойствами. Наличие 5-аминосалицилат декарбоксилазы определяли по хромогенной реакции на питательной среде «Клебсиелла 5-АСК ХРОМ С» (НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург). Утилизацию субстратов в качестве единственного источника углерода выявляли на плотной минимальной синтетической среде с 2 г/л субстрата при инкубации посевов в течение 72 ч при 37°С. Биохимические признаки бактерий изучали микрообъемным методом тест-системой «Рапид-Энтеро» (НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург). Для генетической характеристики штаммов использовали гены 16S rRNA, gyrA, rpoB, pehX. Амплификацию фрагментов генов 16S rRNA, gyrA, rpoB проводили методом стандартной ПЦР с использованием праймеров, имеющих описанные ранее последовательности. Были амплифицированы два фрагмента гена rpoB, общей длиной 834 п.н., фрагмент гена 16SrRNA длиной 387 п.н., фрагмент гена gyrA длиной 441 п.н. Амплифицированные фрагменты секвенировали по Сенгеру на автоматическом капиллярном секвенаторе ABI 3130 (Applied Biosystems, США) с последующим применением методов определения уровней сходства секвенированных фрагментов генов. ПЦР фрагментов гена pehX для определения паттерна его амплификации проводили по ранее описанной методике с использованием двух пар праймеров, фланкирующих фрагмент AD длиной 513 п.н. и CD длиной 344 п.н. При изучении 11 штаммов бактерий, идентифицированных ранее как K. oxytoca, атипичных (негативных) по маркеру 5-аминосалицилат декарбоксилазе, были выявлены генетическим методом 9 штаммов K. michiganensis, 1 штамм-мутант K. oxytoca и 1 штамм с высокой степенью гомологии с Klebsiella kielensis по нуклеотидной последовательности гена rpoB, что подтверждает высокую информативность этого объекта исследования. У 4 штаммов K. oxytoca выявлено 99–100% сходства с K. michiganensis по всем фрагментам секвенированных генов. Только секвенирование гена rpoB обнаружило сходство всех 9 выявленных штаммов с K. michiganensis, что позволяет рекомендовать этот подход как наиболее информативный. Наличие гена pehX, кодирующего полигалактуроназу, подтверждено методом ПЦР у большинства штаммов K. michiganensis, поэтому это исследование нецелесообразно для их идентификации (дифференциации с K. oxytoca). Наиболее информативными для фенотипической идентификации K. michiganensis являются тесты, по которым большинство штаммов имеют единый профиль: отсутствие 5-аминосалицилат декарбоксилазы, утилизации гистамина, дульцитола, трикарбаллиловой кислоты; наличие продукции индола, утилизации D-мелицитозы, путресцина.