Вирус гепатита В и сайт-специфические нуклеазы: влияние генетических модификаций CRISPR/Cas9 на противовирусную активность

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Хронический гепатит В — тяжелое заболевание печени, связанное с персистенцией вируса гепатита В в гепатоцитах человека. Хронический гепатит В является одним из самых распространенных заболеваний в мире. По обновленной статистике, более 250 млн человек хронически инфицированы, и более 1 млн человек умирают ежегодно из-за последствий ХГВ, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Основная причина персистенции вируса гепатита В — особая суперспирализованная молекула кольцевой ковалентно замкнутой ДНК в ядре. Современные методы терапии подавляют вирусную инфекцию, но не действуют напрямую на матрицы кольцевой ковалентно замкнутой ДНК, поскольку она существует в ядре гепатоцитов в виде минихромосомы и является недоступной для действия противовирусных препаратов. Как правило, после прекращения курса терапии наступает реактивация инфекции, поэтому прием противовирусных препаратов может быть неопределенно долгим. Одной из современных технологий, способных действовать напрямую на кольцевую ковалентно замкнутую ДНК, является система сайт-специфических нуклеаз CRISPR/Cas9 организма Streptococcus pyogenes. SpCas9 белок можно привлекать к участку ккзДНК с помощью короткого РНК-проводника, в результате чего SpCas9 вносит двуцепочечные разрывы, разрушая или мутируя вирусный геном. Тем не менее на сегодняшний момент использование CRISPR/Cas9 для терапии хронического гепатита В сопряжено с рядом проблем, в том числе с такой, как внецелевое действие нуклеаз (разрезание генома клеток). В последние годы было заявлено о создании нескольких технологий, использование которых может усиливать нуклеолитическую активность CRISPR/Cas9 (модифицированные РНК-проводники) или увеличивать специфичность SpCas9 белка (eSpCas9, более безопасная форма классического белка Cas9). В этой работе было проведено сравнение противовирусного действия CRISPR/Cas9 с классической формой белка SpCas9 и белком eSpCas9 c модифицированными и немодифицированными РНК-проводниками на культуре клеток in vitro. Показано, что система SpCas9 подавляет транскрипцию и репликацию вируса гепатита В на 90%, а также снижает уровень ккзДНК на 94%, тогда как противовирусный эффект при использовании eSpCas9 оказывается существенно ниже. Несмотря на то что модифицированные РНК-проводники должны улучшать нуклеолитическую активность CRISPR/Cas9 систем, модификация РНК-проводников также значительно снижает противовирусное действие CRISPR/Cas9. Таким образом, CRISPR/Cas9 сама по себе обладает высокой эффективностью действия, почти полностью блокируя транскрипцию и репликацию вируса гепатита В. Использование описанных технологий по улучшению свойств CRISPR/Cas9 нерационально при создании методов терапии на основе CRISPR/Cas9, а для элиминации генома вируса следует сосредоточиться на поиске эффективных РНК-проводников. 

Об авторах

А. П. Костюшева

ФБУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: ak@rcvh.ru
ORCID iD: 0000-0002-2335-6582

Костюшева Анастасия Павловна, младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов 

Адрес для переписки: Костюшева Анастасия Павловна, 111123, Россия, Москва, ул. Новогиреевская, 3А, ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Тел.: 8 (925) 310-91-24.

Россия

С. А. Брезгин

ФБУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора;
ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

Email: sb@rcvh.ru
ORCID iD: 0000-0003-4792-0739
Брезгин Сергей Алексеевич, младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов, ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия; аспирант лаборатории № 73 клинической фармакологии ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии

Д. Н. Зарифьян

ФБУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: dz@rcvh.ru
Зарифьян Дмитрий Николаевич, лаборант-исследователь лаборатории вирусных гепатитов

Д. С. Чистяков

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ

Email: dchistakoff@gmail.com
Чистяков Даниил Сергеевич, лаборант лаборатории вирусных гепатитов

В. И. Гегечкори

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ

Email: mr.faul@mail.ru
Гегечкори Владимир Ираклиевич, к.ф.н., старший преподаватель, ассистент кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева

Е. О. Баюрова

ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН

Email: 79153645941@ya.ru
Баюрова Екатерина Олеговна, младший научный сотрудник лаборатории моделирования иммунобиологических процессов с экспериментальной клиникой игрунковых обезьян отдела инновационных биотехнологических препаратов

Е. В. Волчкова

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ

Email: antononina@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-4581-4510
Волчкова Елена Васильевна, доктор мендицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней, зав. кафедрой инфекционных болезней медикопрофилактического факультета

Д. С. Костюшев

ФБУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора

Email: ak@rcvh.ru
ORCID iD: 0000-0002-1851-7441
Костюшев Дмитрий Сергеевич, младший научный сотрудник лаборатории вирусных гепатитов

В. П Чуланов

ФБУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора;
ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова МЗ РФ

Email: vladimir.chulanov@rcvh.ru
ORCID iD: 0000-0001-6303-9293
Чуланов Владимир Петрович, доктор мендицинских наук, зав. лабораторией вирусных гепатитов ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия; профессор кафедры инфекционных болезней медикопрофилактического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ, Москва

Список литературы

  1. Чуланов В.П., Зуева А.П., Костюшев Д.С., Брезгин С.А., Волчкова Е.В., Малеев В.В. Гепатит С стал излечим. Гепатит В следующий? //Терапевтический архив. 2017. Т. 89, № 11. С. 4–13. doi: 10.17116/terarkh201789114-13
  2. Allweiss L., Dandri M. The role of cccDNA in HBV maintenance. Viruses, 2017, vol. 9, no. 2, p. 156. doi: 10.3390/v9060156
  3. Chang T.T., Lai C.L., Kew Yoon S. Entecavir treatment for up to 5 years in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. Hepatology, 2010, vol. 51, no. 2, pp. 422–430. doi: 10.1002/hep.23327
  4. Dang Y., Jia G., Choi J. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biol., 2015, vol. 16, p. 280. doi: 10.1186/s13059-015-0846-3
  5. Dong C., Qu L., Wang H., Wei L., Dong Y., Xiong S. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Res., 2015, vol. 118, pp. 110–117. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015
  6. Fu Y., Sander J.D., Reyon D., Cascio V.M., Joung J.K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol., 2014, vol. 32, no. 3, pp. 279–284. doi: 10.1038/nbt.2808
  7. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences. N. Engl. J. Med., 2004, vol. 350, no. 11, pp. 1118–1129. doi: 10.1056/NEJMra031087
  8. Janssen H.L.A., Zonneveld M., Senturk H. Pegylated interferon alfa-2b alone or in combination with lamivudine for HBeAgpositive chronic hepatitis B: a randomised trial. Lancet, 2005, vol. 365, no. 9454, pp. 123–129. doi: 10.1016/S0140-6736(05)17701-0
  9. Karimova M., Beschorner N., Dammermann W. CRISPR/Cas9 nickase-mediated disruption of hepatitis B virus open reading frame S and X. Sci. Rep., 2015, vol. 5, p. 13734. doi: 10.1038/srep13734
  10. Lim S.G., Wai C.T., Rajnakova A., Kajiji T., Guan R. Fatal hepatitis B reactivation following discontinuation of nucleoside analogues for chronic hepatitis B. Gut, 2015, vol. 51, no. 4, pp. 597–599. doi: 10.1136/gut.51.4.597
  11. Lin S.R., Yang H.C., Kuo Y.T. The CRISPR/Cas9 system facilitates clearance of the intrahepatic HBV templates in vivo. Mol. Ther. Nucleic Acids, 2014, vol. 3: e186. doi: 10.1038/mtna.2014.38
  12. Nassal M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut, 2015, vol. 64, iss. 12, pp. 1972–1984. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809
  13. Ramanan V., Shlomai A., Cox D.B.T. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Sci. Rep., 2015, vol. 5, p. 10833. doi: 10.1038/srep10833
  14. Seeger C., Mason W.S. Hepatitis B virus biology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000, vol. 64, no. 1, pp. 51–68. doi: 10.1128/MMBR.64.1.51-68.2000
  15. Seeger C., Sohn J.A. Complete spectrum of CRISPR/Cas9-induced mutations on HBV cccDNA. Mol. Ther., 2016, vol. 24, no.7, pp. 1258–1266. doi: 10.1038/mt.2016.94
  16. Seeger C., Sohn J.A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Mol. Ther. Nucleic Acids, 2014, vol. 3: e216. doi: 10.1038/mtna.2014.68
  17. Slaymaker I.M., Gao L., Zetsche B., Scott D.A., Yan W.X., Zhang F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science, 2016, vol. 351, no. 6268, pp. 84–88. doi: 10.1126/science.aad5227
  18. WHO. Global hepatitis report 2017. World Health Organization, 2017.
  19. Yang H.C., Kao J.H. Persistence of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in hepatocytes: molecular mechanisms and clinical significance. Emerg. Microbes Infect., 2014, vol. 3, no. 9: e64. doi: 10.1038/emi.2014.64
  20. Yin H., Xue W., Chen S. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat. Biotechnol., 2014, vol. 32, no. 6, pp. 551–553. doi: 10.1038/nbt.2884
  21. Zhang X.H., Tee L.Y., Wang X.G., Huang Q.S., Yang S.H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol. Ther. Nucleic Acids, 2015, vol. 4: e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37
  22. Zhu W., Xie K., Xu Y. CRISPR/Cas9 produces anti-hepatitis B virus effect in hepatoma cells and transgenic mouse. Virus Res., 2016, vol. 217, pp. 125–132. doi: 10.1016/j.virusres.2016.04.003

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Костюшева А.П., Брезгин С.А., Зарифьян Д.Н., Чистяков Д.С., Гегечкори В.И., Баюрова Е.О., Волчкова Е.В., Костюшев Д.С., Чуланов В.П., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 64788 от 02.02.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах