Комплексный препарат на основе антибиотика, кластерного серебра и бактериофага для лечения инфекционных заболеваний, вызванных Staphylococcus aureus,в том числе MRSA-штаммами

Полный текст

Введение

Существует целый ряд заболеваний, вызываемых бактериями Staphylococcus aureus. Наиболее распространенными заболеваниями, причиной которых может стать золотистый стафилококк, являются заболевания желудочно-кишечного тракта, верхних дыхательных путей, кожные болезни, раневые инфекции, а также пневмонии при внутрибольничных инфекциях. Среди факторов патогенности стафилококков выделяют как структурные компоненты клеток — капсула, белки клеточной стенки, так и секретируемые молекулы — экзотоксины, экзоферменты.

Существенным является возможное взаимодействие между Staphylococcus aureus и респираторными вирусами в дыхательных путях.

Долгое время препаратами для лечения инфекций, вызванных S. aureus, оставались бета-лактамные антибиотики. Однако в последнее время все чаще выявляется золотистый стафилококк, устойчивый к этой группе препаратов (в том числе MRSA (methicillin-resistant S. aureus) — бактерии, устойчивые к метициллину) [3]. Устойчивость микроорганизмов к бета-лактамным препаратам в одних случаях объясняется продукцией бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), а в других — с наличием специфического белка ПСБ2а (пенициллинсвязывающего белка). Кроме того, низкую эффективность терапии хронических бактериальных инфекций можно объяснить образованием ими биопленок, которые препятствуют проникновению антибиотиков. К настоящему времени достоверно доказана роль микробных биопленок в возникновении и развитии ряда широко распространенных заболеваний. К ним относятся инфекции, связанные с катетеризацией сосудов, вызванные S. aureus и другими грамположительными микроорганизмами; инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, вызываемые стафилококками; пародонтит, обусловленный рядом микроорганизмов полости рта; инфекции мочевых путей, обусловленные Еscherichia coli, и другими патогенами; инфекции среднего уха, причиной которых может быть, например, Haemophilus influenzae; инфекционные осложнения муковисцидоза, вызываемые Pseudomonas аeruginosa и др. Все эти заболевания с трудом поддаются терапии, имеют высокую частоту рецидивов, некоторые из них могут явиться причиной летальных исходов [6]. Поэтому стоит задача разработки новых препаратов для медицины и ветеринарии. Изучаются возможности использования комбинированных препаратов. Цель комбинированной антибиотикотерапии — достижение синергидного и аддитивного эффектов и расширение спектра антибиотической активности.

Препараты антибактериального действия на основе бактериофагов (БФ) — перспективное направление лечения широкого спектра бактериальных инфекции у животных и человека. Достоинство таких препаратов заключается в высокой специфичности фагов, чувствительности к ним патогенной микрофлоры, эффективность в терапии хронических инфекций, особенно ассоциированных с образованием бактериальных биопленок, сочетаемости со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствии противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии, отсутствии аллергических реакций, низкой токсичности, отсутствии влияния на нормальную бактериальную флору кишечника и препараты пробиотиков, что дает возможность для их совместного применения [2]. Бактериофаги стимулируют активизацию факторов специфического и неспецифического иммунитета, что усиливает их эффективность в терапии хронических инфекций [4, 8].

Антибактериальная активность ионов серебра обусловлена его взаимодействием с мембраносвязанными и ДНК-связанными белками,что приводит к нарушению функционирования бактерии. Также ионы серебра способствуют образованию активных форм кислорода, что приводит к процессу окисления [5]. Установлено усиление бактерицидного эффекта в результате комплексного воздействия на S. aureus раствора коллоидного серебра и неомицина [1]. Использование наночастиц серебра в комплексе с бактериофагом и антибиотиком дает возможность снизить концентрацию последнего без потери антибактериальной активности [4].

В связи с высоким распространением MRSA-штаммов, когда лечение рекомендованными антибиотиками оказывается неэффективным, альтернативным средством может быть комплексный препарат, где действие антибиотика усиливается такими компонентами как бактериофаги, ионы металлов, муколитики или бактериоцины.

Наша стратегия создания новых антибактериальных препаратов заключалась в использовании комбинации вирулентного БФ, препарата, усиливающего его эффективность, — кластерного серебра (КлС) и антибиотика широкого спектра действия, применение которых не вызывает появления устойчивых форм бактерий S. aureus на суспензионной культуре и биопленках [9, 10].

Материалы и методы

Объектами исследования были три штамма бактерий S. aureus из коллекции ГНЦВБ «Вектор»: S. aureus 209; S. aureus spp.; S. aureus MRSA; штамм бактериофага С-47, специфичный к S. aureus.

В работе были использованы антибиотики — гентамицин (ГМН) производства «Биолот» и цефтазидим (ЦАЗ) производства АО «Рафарма», набор дисков индикаторных с антибиотиком ООО «НИЦФ», препарат КлС отечественного производства ООО НПЦ «Вектор-Вита». Питательные среды — Invitrogen™ LB Broth base, Difco™ LB Agar.

Чувствительность бактерий к антибиотическим препаратам определяли диско-диффузионным методом, а минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препаратов в суспензионной культуре — методом серийных разведений в бульоне [7].

Суспензию бактерий для экспериментов готовили разведением «ночной» культуры, выращенной в LB-бульоне, до необходимых концентраций. Суспензию бактерий и опытные образцы культивировали на качалке при 37°С, 160 об/мин. Отбор проб осуществляли через 3 и 24 ч. Для определения концентрации бактерий делали десятикратные разведения образцов и высевали на чашки Петри с LB-агаром, которые инкубировали в термостате на 37°С, 24 ч. Для определения концентрации БФ использовали метод агаровых слоев по Грациа.

Все эксперименты проводили в трех повторностях. Статистическую обработку проводили на компьютере с использованием критерия Стьюдента.

Рабочие концентрации подготовленных препаратов:

• A – 7,5 мкг/мл ГМН + 7 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ;
• B — 10 мкг/мл ГМН + 1,7 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ;
• C — 10 мкг/мл ГМН + 7 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ;
• D — 10 мкг/мл ГМН + 10 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ;
• E — 20 мкг/мл ГМН + 3,5 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ;
• F — 10 мкг/мл ГМН + 3,5 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ;
• G — 5 мкг/мл ГМН + 3,5 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ;
• H — 5 мкг/мл ГМН + 1,7 мкг/мл КлС + 5 × 10⁵ БОЕ/мл БФ;
• M — 2 мкг/мл ГМН + 0,8 мкг/мл КлС + 2 × 10⁵ БОЕ/мл БФ;
• К — 20 мкг/мл ЦАЗ + 3,5 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ.

Результаты

Частое и бесконтрольное использование антибиотиков приводит к возникновению множественной устойчивости бактерий к препаратам, снижению эффективности антибактериальной терапии, необходимости применения комбинации известных лекарственных средств, обладающих синергидным действием.

Предложен для использования трехкомпонентный препарат, обладающий бактерицидным действием в отношении патогенных микроорганизмов S. aureus, показана возможность соединения компонентов, имеющих принципиально разные механизмы антимикробного действия, для снижения дозы антибиотика при сочетанном использовании их с КлС и БФ.

Исследовали влияние препарата и отдельных его компонентов на динамику роста патогенных бактерий.

В экспериментах показано, что внесение БФ С-47 к суспензионным культурам S. aureus 209; S. aureus spp., S. aureus MRSA приводит к развитию фаговых частиц, урожай фага достигает 10⁸–10⁹ БОЕ/мл, при этом остаются устойчивые бактерии, способные к инфекции, в количестве 10⁵–10⁶ КОЕ/мл.

Показано, что внесение КлС в количестве от 3,5 до 10 мкг/мл к суспензионным культурам S. aureus 209; S. aureus spp., S. aureus MRSA с концентрацией 10⁴–10⁶ КОЕ/мл бактериостатического и бактерицидного эффекта не оказывает. Динамика роста подобна контрольным образцам.

Исследование антибиотической устойчивости бактерий S. aureus диско-диффузионным методом показало, что штаммы S. aureus 209 и S. aureus spp. чувствительны ко всем использованным антибиотикам — оксациллин 1 мкг, ванкомицин 30 мкг, цефтазидим (ЦАЗ) 30 мкг, эритромицин 15 мкг, бензилпенициллин 10 ЕД, гентамицин (ГМН) 10 мкг, ципрофлоксацин 5 мкг, клиндамицин 2 мкг, левофлоксацин 5 мкг, тогда как S. aureus MRSA проявляет чувствительность лишь к ванкомицину и ГМН.

Для суспензионной культуры S. aureus MRSA с концентрацией 10⁴–10⁶ КОЕ/мл количество ГМН от 10 до 30 мкг/мл не является бактерицидным, а для бактерии S. aureus 209; S. aureus spp. в количестве до 10⁶ КОЕ/мл концентрации ГМН от 5 до 7,5 мкг/мл являются бактерицидными, выше 10⁶ КОЕ/мл — бактериостатическими.

На основании полученных данных предложен комплексный препарат на основе антибиотика, КлС и БФ C-47 для лечения инфекционных заболеваний, вызванных S. aureus, в том числе MRSA-штаммов.

Подготовили разные варианты препаратов и апробировали их на штаммах бактерий S. aureus.

Исследование показало, что при обработке суспензии бактерий S. aureus MRSA с концентрациями от 10³ до 5 × 10⁴ КОЕ/мл, препаратами A, B, C, D, E уже через 3 ч наблюдается бактерицидный эффект. Через 24 ч жизнеспособные бактерии в суспензии отсутствуют.

Препараты A, B оказывают бактериостатический эффект на суспензионную культуру с концентрацией бактерий от 7 × 10⁴ до 5 × 10⁶ КОЕ/мл (рис. 1). Увеличение количества как антибиотика, так и КлС оказывает бактерицидный эффект на бактерии с концентрацией от 7 × 10⁴ до 5 × 10⁵ КОЕ/мл (рис. 1, образцы 3, 4, 5, 8, 9, 10) в течение 24 ч. Бактериостатический эффект наблюдается и при использовании более высокой концентрации бактерий (рис. 1, образцы 11–15).

 

Рисунок 1. Динамика роста Staphylococcus aureus MRSA в присутствии препаратов

Примечание. Образцы: 16 — контроль, исходная концентрация бактерий 104 КОЕ/мл; 1–5 с исходной концентрацией бактерий 7 × 104 КОЕ /мл; образцы 6–10 с исходной концентрацией 7 × 105 КОЕ /мл; образцы 11–15 с исходной концентрацией 5 × 106 КОЕ /мл. К образцам 1, 6, 11 добавлен препарат А; к образцам 2, 7, 12 — препарат В; к образцам 3, 8, 13 — препарат С; к образцам 4, 9, 14 — препарат D; к образцам 5, 10, 15 — препарат E.

 

Исследования показывают, что увеличение количества КлС от 1,7 до 10 мкг/мл при постоянной концентрации ГМН 10 мкг/мл позволяет снижать концентрацию бактерий S. aureus MRSA до нулевых значений (рис. 2).

 

Рисунок 2. Бактерицидное действие препарата на S. aureus MRSA в зависимости от количества кластерного серебра

Примечание. Образы: 1 — контроль; 2–4 с исходной концентрацией 7 × 104 КОЕ /мл; 5–7 с исходной концентрацией 7 × 105 КОЕ /мл. К образцам 2, 5 — добавлен препарат B; к образцам 3, 6 — препарат С; к образцам 4, 7 — препарат D.

 

Показано, что бактерицидный эффект достигается обработкой суспензионной культуры S. aureus 209 с концентрацией 10⁴–10⁵ КОЕ/мл препаратами F, G, H, а бактериостатический — препаратом M. Для бактерий в более высокой концентрации — 10⁶ КОЕ/мл — бактерицидным действием обладает лишь препарат F (рис. 3).

 

Рисунок 3. Динамика роста S. aureus 209 в присутствии препаратов

Примечание. Образец 1 — контроль; образцы 2–5 с исходной концентрацией 104 КОЕ/мл; образцы 6–9 с исходной концентрацией 105 КОЕ/мл; образцы 10–12 с исходной концентрацией 106 КОЕ/мл. К образцам 2, 6 добавлен препарат M; к образцам 3, 7, 10 — препарат H; к образцам 4, 8, 11 — препарат G; к образцам 5, 9, 12 — препарат F.

 

Для S. aureus ssp. получены аналогичные результаты: бактерицидный эффект установлен при обработке суспензионной культуры S. aureus ssp. с концентрацией 10⁴–10⁵ КОЕ/мл препаратами F, G, H, а бактериостатический — препаратом M. Для бактерий в более высокой концентрации — 10⁶ КОЕ/мл — бактерицидным действием обладают препараты F, G.

Исследования бактерицидного действия препарата и комбинации отдельных его компонентов показали, что в отношении суспензионной культуры S. aureus MRSA с концентрацией 10⁴–10⁵ КОЕ/мл высокой эффективностью обладает предложенный трехкомпонентный препарат, в отличие от двухкомпонентных композиций, например ГМН + КлС или ГМН + БФ, поскольку только в этом случае наблюдается устойчивый бактерицидный эффект.

Для суспензионных культур S. aureus 209 и S. aureus ssp. с концентрацией 10⁴–10⁵ КОЕ/мл показана возможность использования двухкомпонентных композиций, например антибиотик + КлС, антибиотик + БФ, в связи с пониженной резистентностью данных микроорганизмов. Показано, что использование ЦАЗ в сочетании с КлС или БФ при концентрациях патогенов 10⁴–10⁵ КОЕ/мл дает результат подобный использованию препарата антибиотик + КлС + БФ. Но при увеличении концентрации бактерий использование трехкомпонентного препарата остается единственно возможным вариантом.

Подобные результаты получены в работе с S. aureus 209 и S. aureus ssp. при использовании препарата К, содержащего ЦАЗ: 20 мкг/мл ЦАЗ + 3,5 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл БФ. Двухкомпонентные смеси готовили в соответствии с используемыми препаратами: 20 мкг/мл ЦАЗ + 3,5 мкг/мл КлС; 20 мкг/мл ЦАЗ + 10⁶ БОЕ/мл БФ. При внесении одного антибиотика показано снижение концентрации бактерий на два порядка через 24 ч инкубирования, что соответствует воздействию трехкомпонентного препарата через 3 ч. Через 24 ч инкубирования в образцах, обработанных препаратами (двух- и трехкомпонентные композиции) живые бактерии отсутствовали.

Необходимо отметить, что препараты, приготовленные на основе разных антибиотиков, обладают стабильным, пролонгированным действием.

В работе показано, что повторное внесение дозы препарата позволяет добиться снижения концентрации патогенных микроорганизмов в исследуемой суспензии. При использовании препаратов А и С на суспензии бактерий S. aureus MRSA с исходной концентрацией 2,6 × 10⁵ КОЕ/мл показано, что однократное внесение препарата оказывает бактериостатический эффект — в суспензии остается 10⁴–10⁵ КОЕ/мл, повторная обработка приводит к снижению концентрации бактерий до нуля. Следовательно, даже для бактерий S. aureus MRSA возможно использование препарата с минимальным количеством антибиотика (7–10 мкг/мл), чтобы достичь бактерицидного эффекта.

Анализ экспериментальных данных показал возможность эффективной борьбы с метициллинрезистентными бактериями — S. aureus MRSA. Обработка бактерий S. aureus MRSA с концентрацией до 10⁶ КОЕ/мл препаратами, содержащими 10–20 мкг/мл ГМН, приводит к их гибели, тогда как использование только антибиотика в таком же количестве не влияет на рост бактерий. При увеличении концентрации бактерий данные препараты оказывают бактериостатический эффект. При обработке S. aureus 209 и S. aureus ssp. препаратом, содержащим 2 мкг/мл ГМН отмечается бактериостатический эффект, а от 5 до 10 мкг/мл — бактерицидный. Для бактерий с более высокой концентрацией — выше 10⁶ КОЕ/мл рекомендуется использовать препарат, содержащий: 10 мкг/мл ГМН + 3,5 мкг/мл КлС + 10⁶ БОЕ/мл.

Обсуждение

Таким образом, предложенный комплексный препарат позволяет снижать дозу используемого антибиотика в 2–4 раза без потери эффективности и подавлять развитие антибиотикорезистентных и фагоустойчивых форм S. aureus.

1. В ходе исследований показана эффективность применения трехкомпонентного препарата — антибиотик + КлС + БФ — для достижения бактерицидного действия на суспензионной культуре aureus MRSA, причем количество антибиотика в такой композиции можно снизить в 2–3 раза по сравнению с использованиемтолько антибиотика.
2. Для суспензионных культур aureus 209 и S. aureus ssp. показана возможность использования двухкомпонентных композиций — антибиотик + КлС; антибиотик + БФ, в связи с пониженной резистентностью данных микроорганизмов, что также дает возможность снизить концентрацию антибиотика.
3. Необходимо отметить, что при постоянном количестве антибиотика, увеличивая количество кластерного серебра в 4–5 раз, наблюдается усиление бактерицидных свойств полученных препаратов.
4. Данный препарат не имеет ограничений в зависимости от состояния и степени резистентности микроорганизма.
5. Повторное внесение дозы препарата позволяет добиться значительного снижения концентрации патогенных микроорганизмов в исследуемой суспензии.

Данный препарат можно рекомендовать для использования при закрытом промывном дренаже для тяжелых форм гнойно-септических заболеваний, лечения кожных заболеваний и инфекций верхних дыхательных путей.

Работа была выполнена в рамках ГЗ 4/19 «Применение вирусов для решения задач биотехнологии».

Об авторах

Владимир Георгиевич Пугачев

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: pugachev@vector.nsc.ru

ведущий научный сотрудник отдела биофизики и экологических исследований

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Ольга Дмитриевна Тотменина

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: pugachev@vector.nsc.ru

научный сотрудник отдела биофизики и экологических исследований

Россия, р.п. Кольцово, Новосибирская область

Список литературы

Дополнительные файлы